In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Bewertung der Nozizeption bei Mäusen vor, die mit Trypanosoma evansi infiziert sind, wobei das elektronische von-Frey-Gerät als Werkzeug verwendet wird, um die mechanischen Schwellenwerte der Hinterpfote und der Eingeweide zu messen.
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Methodenartikel
Elektronische von Frey-Studie in Verbindung mit der Maus-Grimasse-Skala zur Beurteilung von Allodynie und Schmerzen bei Trypanosoma evansi-infizierten Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Pathogenese von Infektionskrankheiten ist nach wie vor ein komplexes Feld, das es zu untersuchen gilt. Der Verlauf verschiedener klinischer Symptome, wie Allodynie und Schmerzen, kann bei Haustieren beobachtet werden. Das Wissen um ihre Wege und die richtige Behandlung erfordert jedoch kontrollierte Experimente, viele davon mit Labortieren. Die Messung von Veränderungen der mechanischen Schwellen der Hinterpfote und der Eingeweide ist eine nützliche Technik, um Veränderungen in der Schmerzwahrnehmung bei Nagetieren zu beobachten. Die Entzugsreaktion kann zuerst in Baseline-Tests gemessen werden, was eine bessere Kontrolle der Versuchsgruppen ermöglicht. Nachfolgende Tests können nach der Induktion einer Infektion und der Aufnahme von Medikamenten in das Protokoll durchgeführt werden. Die Verwendung einer elektronischen von-Frey-Apparatur in Verbindung mit der Verwendung einer Gesichtswaage zur Beobachtung schmerzähnlicher Veränderungen ermöglicht eine einfache, präzise und konsistente Beurteilung zur Bewertung von Allodynie und Schmerzen bei Mäusen. Daher stellen Experimente, die die vorliegende Methodik für die Trypanosoma evansi-Infektion verwenden, eine nützliche Methode zur Bewertung von Allodynie und Schmerzen bei laborinfizierten Tieren dar, die auf die konventionelle Behandlung von Nutztieren angewendet werden kann.
Einleitung
Trypanosoma evansi ist der ätiologische Erreger der Krankheit, die in Südamerika "Surra" oder "Mal-das-Cadeiras genannt" wird 1,2. Sie befällt häufig Pferde und Rinder, aber auch wilde Tiere und wird durch hämatophage Fledermäuse, Tabaniden und Stomoxen übertragen. Fliegenbisse 1,3. Surra ist eine schwere Erkrankung bei Haustieren, die ohne die richtige Behandlung tödlich verlaufen kann und unspezifische klinische Symptome wie Anämie, Appetit- und Gewichtsverlust, Muskelschwäche und Abort aufweist, die je nach Wirt und geografischer Region variieren können 2,4,5,6.
Die Ausprägung von Allodynie und Schmerzen bei infizierten Tieren im Verlauf der Erkrankung ist noch ein neues Thema 2,7. Der Drang, die Pathogenese hinter diesen Anzeichen zu verstehen, ist ein wichtiger Schritt, um die derzeit verwendete Behandlung zu verbessern und zu verfeinern, indem das klassische trypanozide Protokoll um wirksame Analgetika ergänztwird 5,6. In diesem Szenario stellt die Möglichkeit, die Krankheit mit einem Mausmodell zu replizieren, einen Vorteil dar, da Mäuse problemlos unter kontrollierten Umgebungen im Labor gehalten werden können und daher konsistentere Ergebnisse liefern als Feldexperimente mit Nutztieren.
Ein mechanischer Schwellenwert wird üblicherweise mit einer elektronischen von-Frey-Apparatur (EvF) zur Bewertung der Allodynie in einer Vielzahl von Experimenten ermittelt 2,8,9. Dieses Gerät wird verwendet, um die Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber mechanischer Stimulation zu beurteilen: Sobald das Gerät die Pfote des Tieres berührt, wird durch eine am Gerät befestigte 20-200-μL-Spitze die Kraft aufgezeichnet, mit der das Tier die Pfote zurückzieht.
Nagetiere werden in diesen Experimenten in der Regel als Standardtiere verwendet, und die meisten Ergebnisse werden auf andere Arten extrapoliert, da die meisten erforschten Krankheiten von anderen Arten stammen, bei denen es schwierig wäre, eine kontrollierte Studie durchzuführen. Darüber hinaus sind Allodynie und Schmerzen eng miteinander verbunden. Die Verwendung einer spezifischen Gesichtsskala zur Beurteilung von Schmerzen bei infizierten Mäusen spielt eine wichtige Rolle als bestätigendes Adjuvans zur Bestätigung des Vorhandenseins von Schmerzen im Verlauf einer T. evansi-Infektion 2,10.
In diesem Protokoll demonstrieren wir ein neuartiges Modell zur Bewertung von Allodynie und Schmerzen bei Mäusen, die experimentell mit T. evansi infiziert wurden, das eine hohe Korrelation zwischen den Variablen zeigt und sich somit als starkes Modell erweist. Darüber hinaus ist eine kleine Anzahl von Forschern erforderlich, um das gesamte Verfahren durchzuführen, wodurch die Wahrscheinlichkeit menschlicher Eingriffe während des Experiments verringert wird. Es ermöglicht dem Untersucher auch, die Zielerkrankung während eines akuten Verlaufs zu replizieren und mehrere verschiedene Behandlungsmedikamente in das Versuchsdesign aufzunehmen, wodurch in kurzer Zeit konsistente Ergebnisse erzielt werden.
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Protokoll
Alle Experimente wurden an 10 Wochen alten erwachsenen weiblichen Schweizer Mäusen (35-55 g) durchgeführt. Die Tiere wurden in Polysulfonkäfigen (3-5 Tiere pro Käfig) in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (21 ± 1 °C), 12 h Licht-/12 Stunden Dunkelzyklus und Standard-Laborfutter und Wasser ad libitum untergebracht. In jedem Test wurden jeder Gruppe zehn Tiere zugeteilt, um die konsistente Wirkung der medikamentösen Behandlungen zu demonstrieren. Das Versuchsdesign wurde von der Ethikkommission der Staatlichen Universität Santa Catarina (CEUA) eingereicht und genehmigt (Protokollnummer: 6019201123). Alle Tierversuche entsprachen den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) und wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des Nationalen Forschungsrats für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
1. Vorbereitung und Impfung von Trypanosoma evansi
VORSICHT: Tragen Sie einen Einweg-Laborkittel, Handschuhe, eine Maske und einen Augenschutz, wenn Sie mit infizierten Blutproben, Reagenzien und anderen chemischen Verbindungen umgehen.
- Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie es auf eine konstante Temperatur von 37 °C ein.
- Nehmen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der konservierten Blutprobe aus dem Ultratiefkühlschrank (-80 °C). Legen Sie es in das Wasserbad, bis das Blut auftaut.
HINWEIS: Das gleiche Isolat sollte verwendet werden, um alle Mäuse in jeder Gruppe verschiedener Experimente zu infizieren, um eine gleiche Anzahl von Blutpassagen aufrechtzuerhalten. - Verwenden Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 0,1 M) mit 60 % D-(+)-Glukose (pH 7,4), um eine serielle Verdünnung (10:1 v v) durchzuführen, bis 1 × 104 Trypanosomen pro 0,1 mL erreicht sind. Bestimmen Sie die Anzahl der Parasitenzellen durch manuelle Zellzählung mit einer Neubauer-Kammer an einem Mikroskop mit einer 100-fachen Objektivlinse2.
- Beimpfen Sie 0,1 ml der verdünnten Blutlösung (infizierte Gruppe) oder das gleiche Volumen in einem 0,9%igen Kochsalzgefäß (Kontrollgruppe) intraperitoneal mit einer 26 G 1/2" Nadel, die an eine Insulinspritze gekoppelt ist.
2. Aufbau und Betrieb der elektronischen von-Frey-Apparatur
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit der Art und Weise, wie die erhaltenen Daten aufgezeichnet werden. Einige EvF-Geräte verfügen über spezielle Programme, um die von dem Gerät erhaltenen Daten auf andere elektronische Geräte wie Computer, Tablets oder Smartphones zu übertragen.
- Schalten Sie das EvF-Gerät ein. Stellen Sie sicher, dass das Gerät gut geladen ist, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, indem Sie den auf dem Gerätebildschirm angezeigten Batteriestand beobachten und es gegebenenfalls aufladen.
- Verbinden Sie das EvF-Gerät über Wi-Fi mit dem ausgewählten elektronischen Gerät, um die erhaltenen Daten zu übertragen und zu speichern.
- Führen Sie eine 10 μl Polypropylenspitze in den EvF-Gerätekegel ein und stellen Sie die Anzeige auf Null (0,00 g), indem Sie den Knopf mit einem Pfotensymbol drücken.
- Beachten Sie, dass, sobald das untersuchte Gewebe untersucht wurde; Der maximal ausgeübte Druck wird auf dem Display des EvF-Geräts angezeigt. Übertragen Sie es danach auf das ausgewählte elektronische Gerät, indem Sie die Taste mit einem Antennensymbol drücken, um eine sichere Aufnahme zu ermöglichen.
- Setzen Sie die Anzeige auf Null zurück und bereiten Sie sich auf eine neue Messung vor, indem Sie einfach den Knopf mit dem Pfotensymbol erneut drücken.
3. Allgemeine Erwägungen zur Bewertung mechanischer Schwellenwerte
- Führen Sie alle Experimente in einem ruhigen Raum mit kontrollierter Temperatur bei 21 °C und einem 12-stündigen Licht-/12-Stunden-Dunkelzyklus durch und achten Sie darauf, den zirkadianen Mauszyklus zu respektieren, indem Sie alle Auswertungen zur gleichen Tageszeit durchführen2.
- Lassen Sie dieselbe Person sowohl Basis- als auch experimentelle mechanische Schwellenwertbewertungen durchführen, um Verzerrungen zu reduzieren und die Konsistenz der Messungen sicherzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Experimente verblindet sind.
- Platzieren Sie jede Maus vorsichtig in einer einzelnen Kammer aus Polymethylmethacrylat (PMMA) mit perforierter Oberseite, die auf einem 5 mm² Maschenbodenständer 2,8 platziert ist.
- Lassen Sie die Mäuse 30 Minuten lang in den PMMA-Kammern akklimatisieren, bevor Sie sowohl die Ausgangs- als auch die experimentellen mechanischen Schwellenwerte beurteilen2.
- Stellen Sie den Gitterbodenständer in einer bequemen Höhe (auf einer festen Oberfläche) auf, so dass die Tiere von allen Seiten zugänglich sind. Achten Sie darauf, dass der Bauch und alle vier Pfoten der Mäuse durch die Netzbodenöffnungen leicht zugänglich sind.
- Decken Sie die stabile Fläche, auf der die Kammern angeordnet sind, mit saugfähigem Material ab, um Miktion und Stuhlgang zu absorbieren oder zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass sich die Arme des Untersuchers während der Bedienung des EvF-Geräts frei unter den Kammern bewegen können.
4. Bewertung der mechanischen Schwelle zu Studienbeginn und Reaktion der Maus auf Reize
- Unterteilen Sie für die Messung des Abdomens den Bauch in drei virtuelle Teile (kraniale, mittlere und kaudale Bereiche). Wählen Sie den Schädelbereich (anatomisch, der die Leber enthält) als Standardzielgewebe für die Beurteilung der mechanischen Schwelle der viszeralen Allodynie. Wählen Sie für die Pfotenvermessung die rechte Hinterpfote zur Standardisierung.
- Nehmen Sie 48 Stunden vor der Infektion eine Basismessung von jeder Maus vor. Platzieren Sie dazu die Mäuse in den Kammern, bereiten Sie das EvF-Gerät vor und heben Sie die Sonde mit beiden Händen langsam an, um das Zielgewebe zu stimulieren.
- Erhöhen Sie allmählich den Druck auf das Gewebe, bis die Maus ein nozizeptives Verhalten zeigt. Für die Bewertung der rechten Hinterpfote suchen Sie nach Pfotenrezug, Pfotenlecken oder Vier-Pfoten-Springen 2,8,9. Für eine viszerale Beurteilung achten Sie auf ein scharfes Zurückziehen des Bauches, sofortiges Lecken oder Kratzen der sondierten Stelle oder Vier-Pfoten-Springen 2,11.
- Speichern Sie den erhaltenen Wert, indem Sie die Daten auf das ausgewählte elektronische Gerät übertragen, das das spezifische EvF-Programm enthält, oder indem Sie es in ein Notenbuch schreiben. Setzen Sie die Anzeige auf Null zurück und wiederholen Sie den Vorgang viermal, um fünf Messungen zu erhalten8.
HINWEIS: Betrachten Sie nur drei ähnliche Messungen, um den Mittelwertzu schätzen 2 - Die mechanische Schwelle der Maus in der angrenzenden Kammer wird gemessen, bis jede Maus fünfmal untersucht wird und ein Mittelwert für jedes Tier erhalten wird.
- Wiederholen Sie die Ausgangsmessungen 24 h später und schließen Sie Mäuse mit Mittelwerten unter 3,00 g oder mit Unterschieden zwischen den Basalmessungen von mehr als 2,00 gaus 2,8.
HINWEIS: In jedem Versuch muss für jede Maus nur ein Zielgewebe ausgewählt werden, so dass sich die Tiere nicht an die Sondierung gewöhnen, da die Anzahl der Auswertungen in kurzer Zeit erheblich höher wäre.
5. Experimentelle Beurteilung der mechanischen Schwelle der rechten Hinterpfote und der viszeralen Allodynie
- Beurteilen Sie die mechanische Schwelle der rechten Hinterpfote oder der viszeralen Allodynie 1 h nach der Infektion für die Bewertung an Tag 0.
- Wiederholen Sie den Vorgang alle 24 Stunden über 5 Tage nach der Infektion.
HINWEIS: Wenn eine Behandlung verabreicht werden soll, wählen Sie einen geeigneten Zeitpunkt innerhalb des Versuchsdesigns. - Bringen Sie die Mäuse in ihre ursprünglichen Käfige zurück, um zu verhindern, dass die Tiere gegeneinander kämpfen, und erhalten Sie nach Abschluss der Messungen Zugang zu Standard-Laborfutter und Wasser ad libitum .
- Führen Sie einen Normalitätstest durch, um die Normalverteilung der Daten zu überprüfen und die gesammelten Daten entsprechend statistisch zu analysieren.
6. Bewertung der Maus-Grimasse-Skala
- Stellen Sie sicher, dass jede Maus in der Kammer leicht zu sehen ist, und untersuchen Sie jede Maus vor dem Experiment, um sicherzustellen, dass keine Läsionen an den Gliedmaßen, am Bauch oder im Gesicht vorhanden sind und sich das Fell nicht verändert.
- Beobachten Sie den Orbitalbereich der Maus. Klassifizieren Sie offene Augen als Abwesenheit von Schmerzen (Punktzahl 0), während ein offensichtlicher Schmerz dargestellt werden kann, wenn die Maus die Augen schließt (Punktzahl 2).
- Beobachte die Nase der Maus. Klassifizieren Sie eine normale Nase als das Fehlen von Schmerzen, während das Vorhandensein einer Ausbuchtung auf dem Nasenrücken offensichtliche Schmerzen darstellt.
- Beobachte die Wangen der Maus. Klassifizieren Sie normale Wangen als das Fehlen von Schmerzen, während das Vorhandensein einer Ausbuchtung auf beiden Wangen offensichtliche Schmerzen darstellt.
- Beobachte die Position der Ohren der Maus. Klassifizieren Sie abgerundete Ohren als die Abwesenheit von Schmerzen, während Ohren, die sich nach außen oder hinten drehen, weg vom Gesicht, in einer spitzen Form, offensichtliche Schmerzen darstellen. Der Abstand zwischen den Ohren nimmt mit dem Schmerzwert zu.
- Beobachte die Schnurrhaare der Maus. Klassifizieren Sie Schnurrhaare mit ihrer natürlichen Abwärtskrümmung als Abwesenheit von Schmerzen, während Schnurrhaare, die entweder gegen die Wange zurückgezogen oder nach vorne gezogen werden, offensichtliche Schmerzen darstellen.
- Da angeborene Verhaltensweisen, wie z. B. Selbstpflege, den Gesichtsausdruck beeinträchtigen können, sollten Sie diese nicht als schmerzbezogene Verhaltensweisen betrachten8. Warten Sie, bis die Maus dieses Verhalten stoppt, bevor Sie eine Aktionseinheit auswerten.
- Führen Sie einen Normalitätstest durch, um die Normalverteilung der Daten zu überprüfen und die gesammelten Daten entsprechend statistisch zu analysieren.
HINWEIS: Am Ende aller Versuche wurden die Mäuse mit Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (7,5 mg/kg), die intraperitoneal injiziert wurden, human euthanasiert. Nachdem sie einen bestätigten Tiefenanästhesieplan erreicht hatten, wurden sie einer Gebärmutterhalsluxation unterzogen.
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Ergebnisse
Abnahme der mechanischen Schwelle aufgrund einer T. evansi-Infektion , wie sie mit einem elektronischen von-Frey-Apparat sowohl an der rechten Hinterpfote als auch am viszeralen Gewebe bewertet wurde
Das Experiment wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen durchgeführt, gemäß früheren Daten in Bezug auf die verfügbare T. evansi-Probe 2. Infizierte Mäuse zeigten am Tag 3 nach der Infektion einen signifikanten Unterschied in der mechanischen Schwelle an der rechten ...
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Diskussion
Ein kritischer Schritt bei Experimenten mit infizierten Tieren ist die Kontrolle des Parasitämieniveaus. Verschiedene Stämme von T. evansi können sich bei Mäusen unterschiedlich verhalten und von akuten zu chronischen Infektionen führen 2,4,5,6. Darüber hinaus können Änderungen der Infektionsdosis die Überlebenszeit von Mäusen verringern oder verlängern. Daher wird empfohlen, vor den E...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Die Autoren danken insbesondere der Staatlichen Universität Santa Catarina für die finanzielle Unterstützung, dem Pharmakologischen Labor für die Tiere und den Weltraum und dem Labor für Biochemie von Hämoparasiten und Vektoren für die kryokonservierte Blutprobe, die mit T. evansi infiziert war und in diesen Experimenten verwendet wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 26 G 1/2" Nadel gekoppelt an Insulinspritze | TKL | 80288090100 | Wird zur Infusion von Lösungen an Labortieren |
| verwendet Zubehör für von Frey Analgesimeter | INSIGHT | EFF 303 | Containment Box mit Unterstützung für die digitale Analgesimeterbewertung |
| D-(+)-Glukose | SIGMA-ALDRICH | G7021 | Ein Monosaccharid, das die Hauptenergiequelle in Form von ATP für lebende Organismen ist |
| Digitales Analgesimeter | INSIGHT | von Frey Wi-Fi | Das von Frey Wi-Fi ist ein tragbares Gerät zur Beurteilung der Empfindlichkeit von Gewebe gegenüber mechanischen Reizen |
| Gilson Typ 10 & Mikro; L Polypropylenspitze | CRALPLAST | 18261 | Polypropylen zur Verwendung auf elektronischen von Frey-Geräten, empfohlen für die Beurteilung der Allodynie der Hinterpfote |
| Wasserbad im Labor | BEING INSTRUMENT | BW-22P | Wird verwendet, um flüssige und halbfeste Substanzen, die in geeigneten Behältern enthalten sind, auf eine bestimmte Temperatur zu erhitzen |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | SIGMA-ALDRICH | 806552 | Ein ausgewogener Salzlösungspuffer, der für eine Vielzahl von Zellkulturanwendungen verwendet |
| Schweizer Mäuse (Mus musculus) von Tieren beider Geschlechter | UFSC | Swiss | Webster Labortiere, die für kontrollierte Experimente verwendet werden |
| Trypanosoma evansi cryiokonservierte Probe | UDESC-Probe | , die zur Infektion aller Mäuse verwendet wurde, die vom Hämoparasiten und Vektoren abgegeben wurden Biochemisches Labor | |
| Universell Typ 10 & Mikro; L Polypropylenspitze | CRALPLAST | 18171 | Polypropylen zur Verwendung auf elektronischen von Frey-Geräten, empfohlen für die Beurteilung der viszeralen Allodynie |
Referenzen
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