Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.
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Methodenartikel
Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, um spezifische Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) in Segmenten einzelner Muskelfasern unter Verwendung von Dot-Blotting zu identifizieren, im Folgenden als My-Osin-Schwerketten-Detektion durch Do-t-B-Lotting zur Identifizierungdes Muskelfasertyps (MyDoBID) bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Gefriertrocknung der menschlichen Skelettmuskulatur und der Isolierung von Segmenten einzelner Muskelfasern. Mit MyDoBID werden Typ-I- und Typ-II-Fasern mit MHCI- bzw. IIa-spezifischen Antikörpern klassifiziert. Klassifizierte Fasern werden dann für jede Biopsie zu fasertypspezifischen Proben kombiniert.
Das Gesamtprotein in jeder Probe wird durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und UV-aktivierte Geltechnologie bestimmt. Der Fasertyp der Proben wird mittels Western Blot validiert. Es wird auch beschrieben, wie wichtig es ist, eine Normalisierung der Proteinbeladung durchzuführen, um die Detektion von Zielproteinen über mehrere Western Blots hinweg zu verbessern. Zu den Vorteilen der Konsolidierung klassifizierter Fasern in fasertypspezifischen Proben im Vergleich zu Western Blots mit einer Faser gehören die Vielseitigkeit der Proben, der erhöhte Probendurchsatz, die kürzere Zeitinvestition und die Kosteneinsparungsmaßnahmen, während wertvolle fasertypspezifische Informationen erhalten bleiben, die bei homogenisierten Muskelproben häufig übersehen werden. Der Zweck des Protokolls besteht darin, eine genaue und effiziente Identifizierung von Typ-I- und Typ-II-Fasern zu erreichen, die aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben isoliert wurden.
Diese einzelnen Fasern werden anschließend zu typ- und typ-II-fasertypspezifischen Proben kombiniert. Darüber hinaus wird das Protokoll um die Identifizierung von Typ-IIx-Fasern erweitert, wobei Aktin als Marker für Fasern verwendet wird, die negativ für MHCI und MHCIIa waren, die durch Western Blot als IIx-Fasern bestätigt werden. Jede fasertypspezifische Probe wird dann verwendet, um die Expression verschiedener Zielproteine mit Hilfe von Western-Blotting-Techniken zu quantifizieren.
Einleitung
Der Skelettmuskel ist ein heterogenes Gewebe mit ausgeprägten zellulären metabolischen und kontraktilen Eigenschaften, die davon abhängen, ob die Zelle (Faser) langsam zuckt (Typ I) oder schnell zuckt (Typ II). Der Fasertyp kann durch die Untersuchung der Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) identifiziert werden, die sich in mehrfacher Hinsicht voneinander unterscheiden, einschließlich Kontraktionszeit, Verkürzungsgeschwindigkeit und Ermüdungsbeständigkeit1. Zu den wichtigsten MHC-Isoformen gehören Typ I, Typ IIa, Typ IIb und Typ IIx, und ihre metabolischen Profile sind entweder oxidativ (Typ I und IIa) oder glykolytisch (IIx, IIb)
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Protokoll
Menschliche Muskelproben wurden aus dem Vastus lateralis von n = 3 (2 Männer, 1 Frau) im Alter von 70-74 Jahren unter sterilen Bedingungen unter örtlicher Betäubung (Xylocain) und einer für die manuelle Absaugung modifizierten Bergstrom-Nadel gewonnen11,12. Bei den Proben handelte es sich um eine Teilmenge einer früheren Studie, die vom Ethikkomitee für Humanforschung der Universität Victoria genehmigt wurde (HRETH11/221) und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki13 durchgeführt wurde. Die Teilnehmer gaben eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Teilnahme a....
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Ergebnisse
Identifizierung einzelner MHCI-, MHCIIa- und MHCIIx-Muskelfasern mittels Dot Blot
Ein Merkmal von MyDoBID ist die Kategorisierung der variierenden MHC- und Aktin-Signalintensitätsstärke in einer bestimmten Faser (Abbildung 4A). Der Fasertyp wurde durch das Vorhandensein oder Fehlen von MHCI- und IIa-Isoformen identifiziert (Abbildung 4B). Sechs Fasern zeigten keine MHC- oder Aktin-Detektion, was darauf hindeutet, dass keine Faser gesammelt wu.......
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Diskussion
Sammlung von Fasern
Basierend auf mehrjähriger Erfahrung können die meisten Forscher diese Technik beherrschen; Die Praxis führt jedoch zu einer schnelleren und effizienteren Fasersammlung für nachgelagerte Analysen. Um 30 einzelne Fasersegmente einer Qualität für das Pooling isolieren zu können, wird empfohlen, 50 Fasersegmente pro Probe zu sammeln. Es wird empfohlen, das Video zur Fasersammlung sorgfältig und nach Durchführung von zwei Übungssitzungen (~50 Fasern pro Sitzung) zu studieren, um einen .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Danksagungen
Die in dieser Studie verwendeten Antikörper gegen MHC I (A4.840) und MHCIIa (A4.74) wurden von Dr. H. M. Blau entwickelt, und der Antikörper gegen MHCIIx (6H1) wurde von Dr. C. A. Lucas entwickelt und von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft des National Institute of Child Health and Human Development bezogen und von der University of Iowa unterhalten. Fachbereich Biologische Wissenschaften (Iowa City, IA). Wir danken Victoria L. Wyckelsma für die Bereitstellung der menschlichen Muskelproben für diese Studie. Der Großteil der Bilder in Abbildung 1 stammt aus BioRender.com.
Finanzierung:
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1x Denaturierungspuffer | Nach Rezept herstellen | Die Bestandteile können von Sigma-Aldrich oder anderen Chemikalienvertriebsunternehmen bezogen werden | . 1x Denaturierungspuffer wird durch Verdünnung von 3x Denaturierungspuffer 1 in 3 V/V mit 1X Tris-HCl (pH 6,8) hergestellt. Bei -20 °C lagern. |
| 3x Denaturierungspuffer | Nach Rezeptur herstellen | Die Bestandteile können von Sigma-Aldrich oder anderen Chemiehändlern bezogen werden | 3x Denaturierungspuffer enthält: 0,125 M Tris-HCI, 10 % Glycerin, 4 % SDS, 4 M Harnstoff, 10 % 2-Mercaptoethanol und 0,001 % Bromphenolblau, pH 6,8. Bei -20 °C lagern. |
| 95% Ethanol | N/A | 100% Ethanol kann von jedem Unternehmen bezogen werden | Verdünnt auf 95% mit hochreinem H2O. |
| Polyklonaler Aktin-Kaninchen-Antikörper | Sigma-Aldbsp | ; A2066 | 1 zu 1.000 mit BSA-Puffer verdünnen. |
| Analysewaagen | Mettler Toledo | Modellnummer: MSZ042101 | |
| Antikörperverstärker | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Der Produktname lautet Miser Antikörper-Extender Solution NC. |
| Becherglas (100 mL) | N/A | N/A | |
| Tischzentrifuge | Eppendorf | 5452 | Modellname: Mini Spin. |
| Blockierungspuffer: 5 % Magermilch im Waschpuffer. | Diploma | Im Shop gekaufter | |
| BSA-Puffer: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldbsp; PBS: Bio-Rad Laboratorien. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Rinderserumalbumin (BSA), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Natriumazid (NaN3). Bei 4 °C lagern. |
| Öffnungshebel für die Kassette | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Wird zum Öffnen der vorgefertigten Gelkassetten verwendet. |
| Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Modellnummer: Universalhaube III | Jedes Bildgebungssystem mit fleckenfreien Gel-Bildgebungsfunktionen. |
| Criterion Blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Enthält Eisbeutel, Transferschale, Rolle, 2 Kassettenhalter, Filterpapier, Schaumstoffpolster und Deckel mit Kabeln. |
| Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
| ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Produktname: Clarity Max Western ECL Substrat. |
| Elektrophoresepuffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Verdünnen Sie 10x TGS 1 zu 10 mit ultrareinem H2O. |
| Filterpapier, 0,34 mm stark | Whatmann | 3030917 | Großformat 3 MM, Packung 100 Blatt, 315 x 335 mm. |
| Zange zum Präparieren von feinem Gewebe | Dumont | F6521-1EA | Jeweller' s Pinzette Nr. 5. |
| Flache Kunststoffschale/Deckel | N/A | N/A | Groß genug, um die Membran darauf zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche vollständig eben ist. |
| Gefriertrocknungsanlage | Labconco | 7750030 | Freezone 4,5 L mit Glaskammer-Probentisch. |
| Gefrierschrank -80 oC | N/A | N/A | Jeder Gefrierschrank mit einer konstanten Temperatur von -80 &°; C geeignet ist. |
| Gelabscheider | 1653320 | Bio-Rad | Schieben Sie unter die Membran, um die Membran zu sammeln oder zu bewegen. |
| Grauer Bleistift | N/A | N/A | |
|   Software für das Image-Labor | Bio-Rad Laboratories | N/A | beziehen sich auf die Softwareversion 5.2.1, es können jedoch auch andere Versionen verwendet werden. |
| Inkubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Jeder Inkubator, der auf 37 μd; C würde ausreichen. |
| Lampe | N/A | N/A | |
| Magnetrührer mit Floh | N/A | N/A | |
| Membranwalze | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Kann im Transfer-Bundle erworben werden. Wenn dieses Produkt jedoch nicht verfügbar ist, würde jedes zylindrische Rohr mit glatter Oberfläche, das lang genug ist, um über die Membran zu rollen, ausreichen. |
| Mikrozentrifugen-Röhrchen (0,6 ml) | N/A | N/A | |
| Maus IgG HRP sekundär | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Ziege Anti-Maus IgG (H+L), RRID AB_228341. Bei 1 zu 20.000 im Blockierungspuffer verdünnen. |
| Maus IgM HRP sekundär | Abcam | ab97230 | Ziege Anti-Maus IgM mu Kette. In der gleichen Verdünnung wie Maus-IgG verwenden. |
| Myosin Heavy Chain I (MHCI) Primärantikörper | DSHB | A4.840 | Verdünnungsbereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500 in BSA-Puffer. |
| Myosin-Schwerkett-IIa (MHCIIa)-Primärantikörper | DSHB | A4.74 | Verdünnungsbereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500 in BSA-Puffer. |
| Myosin-Schwerketten-IIx (MHCIIx)-Primärantikörper | DSHB | 6H1 | Verdünnungsbereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500 in BSA-Puffer. |
| Nitrozellulosemembran 0,45 &Mikro; M | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | Für Western Blotting. |
| Petrischalendeckel | N/A | N/A | |
| Kunststoffpinzette | N/A | N/A | |
| Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Produktname: Basis-Stromversorgung. |
| Proteinleiter | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter, 10 bis 180 kDa. |
| PVDF-Membran 0,2 & Mikro; m | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
| Kaninchen HRP sekundär | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), RRID AB_228341. Verdünnung wie bei Sekundärantikörpern der Maus. |
| Wippe | N/A | N/A | |
| Lineal | N/A | N/A | |
| Schere | N/A | N/A | |
| Stereomikroskop | Motic | SMZ-168 | |
| Stripping Buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Produktname: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
| Taschentuch (fusselfrei) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Produktname: Kimwipe. |
| Transferpuffer (1x Trisglycin-Puffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG Puffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | 10x TG Puffer mit hochreinem H2O auf 1x verdünnen. 100 % Methanol bis zu einer Endkonzentration von 20 % Methanol zugeben. Bei 4 °C lagern. |
| Transfertablett | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
| Vorgefertigtes Gel zur UV-Aktivierung | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Geltyp: 4– 15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 Well, 15 & micro;L. |
| Vortex | N/A | N/A | |
| Waschpuffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST Rezept: 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) wird auf 1x mit hochreinem H2O verdünnt, Tween 20 wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben. Puffer bei 4 °C lagern. |
| Waschbehälter | Sistema | Store gekauft | Jeder Tupperware-Behälter, der den ungefähren Abmessungen der Membran entspricht, würde ausreichen. |
Referenzen
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and huma....
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Nachdrucke und Genehmigungen
