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Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen der Zahnpulpa aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen

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DOI:

10.3791/65767

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17. Mai 2024

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1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Zusammenfassung

Im Bereich der regenerativen Medizin und therapeutischer Anwendungen gewinnt die Stammzellforschung rasant an Bedeutung. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die sowohl in Milchzähnen als auch in bleibenden Zähnen vorkommen, haben sich aufgrund ihrer Zugänglichkeit, Anpassungsfähigkeit und angeborenen Differenzierungsfähigkeit zu einer wichtigen Stammzellquelle entwickelt. DPSCs bieten ein leicht verfügbares und reichlich vorhandenes Reservoir an mesenchymalen Stammzellen und zeigen eine beeindruckende Vielseitigkeit und ein beeindruckendes Potenzial, insbesondere für regenerative Zwecke. Trotz ihres Versprechens liegt die größte Hürde in der effektiven Isolierung und Charakterisierung von DPSCs, da sie nur als winzige Fraktion in Zahnpulpazellen dargestellt werden. Ebenso wichtig ist die richtige Konservierung dieser unschätzbaren zellulären Ressource. Die beiden vorherrschenden Methoden für die DPSC-Isolierung sind die enzymatische Verdauung (ED) und das Auswachsen aus Gewebeexplantaten (OG), die oft als Spontanwachstum bezeichnet werden. Dieses Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf den enzymatischen Verdauansatz für die DPSC-Isolierung und beschreibt detailliert die Schritte, die die Extraktion, die Verarbeitung im Labor und die Zellkonservierung umfassen. Über die Extraktion und Konservierung hinaus befasst sich das Protokoll mit der Differenzierungsfähigkeit von DPSCs und beschreibt insbesondere die Verfahren, die angewendet werden, um diese Stammzellen zur Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten zu veranlassen, wobei ihre multipotenten Eigenschaften zur Geltung kommen. Die anschließende Anwendung kolorimetrischer Färbetechniken ermöglicht eine genaue Visualisierung und Bestätigung der erfolgreichen Differenzierung, wodurch das Kaliber und die Funktionalität der isolierten DPSCs validiert werden. Dieses umfassende Protokoll fungiert als Blaupause, die das gesamte Spektrum der Extraktion, Kultivierung, Konservierung und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen umfasst. Es unterstreicht das beträchtliche Potenzial von DPSCs, treibt die Erforschung von Stammzellen voran und verspricht zukünftige regenerative und therapeutische Durchbrüche.

Einleitung

Die Stammzellforschung hat in der biomedizinischen Wissenschaft aufgrund ihrer vielversprechenden Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering floriert. Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die aus dem Pulpagewebe sowohl menschlicher Milchzähne als auch bleibender Zähne gewonnen werden, haben aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und multipotenten Kapazität als Quelle für Stammzellen großes Interesse geweckt 1,2. Diese Zellen haben das Potenzial, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, darunter Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten, wie zahlreiche Studien bestätigen3.

In den letzten Jahrzehnten haben die Forschung und die therapeutischen Anwendungen von Stammzellen stark zugenommen. Das expansive Potenzial von Stammzellen erfordert eine Diversifizierung der Quellen, aus denen sie gewonnen werden. Mehrere Faktoren beeinflussen die Effizienz, Lebensfähigkeit und Stammheit ausgewählter Zellen. Trotz der Existenz verschiedener bekannter Stammzellreservoire wie Knochenmark und Fettgewebe schränken die invasiven Verfahren, die Morbidität an der Stelle und ethische Bedenken, die mit diesen Quellen verbunden sind, ihre Erforschung oft ein 4,5. Unter den verschiedenen Stammzellquellen haben dentale Stammzellen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit, hohen Plastizität und vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere humane Stammzellen der Zahnpulpa sind hinsichtlich ihrer therapeutischen Aussichten umfassend erforschtworden 6. Zähne, die häufig als medizinischer Abfall entsorgt werden, enthalten eine Fülle von mesenchymalen Stammzellen7. Der Schutz dieses wertvollen Stammzellpools erfordert gemeinsame Anstrengungen von Patienten, Zahnärzten und Ärzten, um sicherzustellen, dass diese Ressourcen nicht verschwendet werden und jede Zahnpulpa-Stammzelle für zukünftige regenerative Anforderungen verfügbar ist.

Aus der Zahnpulpa gewonnene Stammzellen, wie z. B. humane adulte Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) und Stammzellen aus exfolierten menschlichen Milchzähnen (SHED), befinden sich in der perivaskulären Nische der Zahnpulpa. Es wird angenommen, dass diese Zellen aus kranialen Neuralleistenzellen stammen und frühe Marker sowohl für mesenchymale Stammzellen (MSCs) als auch für neuroektodermale Stammzellen aufweisen. DPSCs und SHEDs haben Multipotenz und die Fähigkeit zur Regeneration verschiedener Gewebetypen bewiesen8.

Mögliche Quellen für dentale Stammzellen sind gesunde Milch- und bleibende Zähne. Stammzellen machen nur etwa 1 % der gesamten Zellpopulation in der Pulpa aus, was die Bedeutung wirksamer Isolierungs- und Expansionstechniken unterstreicht9. Folglich sind die Extraktion und Vermehrung dieser Stammzellen entscheidende Schritte bei der DPSC-Isolierung10. Extrahierte oder exfolierte Zähne müssen in einem nährstoffreichen Transportmedium wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks-gepufferter Kochsalzlösung (HBSS) gelagert werden.

Die Gewinnung von Zahnpulpa kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, abhängig vom Zahntyp 7,11. Bei Milchzähnen mit resorbierten Wurzeln kann die Extraktion über die Wurzelspitze erfolgen. In ähnlicher Weise können sterile Stachelräumnadeln verwendet werden, um Pulpa aus bleibenden Zähnen mit einer unreifen offenen Spitze zu gewinnen. Bei bleibenden Zähnen mit voll entwickelten Wurzeln wird für den Zugang zur Pulpakammer die Zahnkrone von der Wurzel getrennt. Dies wird erreicht, indem der Zahn mit einer Diamantscheibe an der Zementschmelzverbindung geschnitten wird. Dieser Schnitt legt die Pulpakammer frei, wodurch das Pulpagewebe entnommen werdenkann 12,13,14.

Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) können durch enzymatischen Verdau (ED) oder Auswuchs aus Gewebeexplantaten (OG) isoliert werden, was auch als spontanes Wachstum bezeichnet wird. Bei der ED-Methode werden Enzyme, hauptsächlich Kollagenase I und Dispase, verwendet, um das Gewebe in einzellige Suspensionen zu zerlegen15,16. Die OG-Methode, die einfacher und schneller ist, besteht darin, die Pulpafragmente zu zerkleinern und direkt in eine Kulturplatte zu legen, so dass die Zellen aus den Gewebeexplantaten wachsen können17. Forscher haben beide Techniken verwendet und verglichen, um die Zellproliferationsraten, die Erhaltung der Eigenschaften isolierter Stammzellen, die Differenzierung und die Expression von Oberflächenmarkern zu bewerten18. Die Etablierung und Standardisierung von Protokollen für den Erwerb von DPSCs mit hoher Effizienz und Stammheit kann den Weg für wirksame und sichere Therapien ebnen19. Dieses Protokoll umfasst die Extraktion von DPSCs durch enzymatischen Verdau, Laborverarbeitung, Konservierung und Zelldifferenzierung mit kolorimetrischer Färbung für Adipogenese, Osteogenese und Chondrogenese.

Das in diesem Artikel skizzierte Protokoll stellt ein schrittweises Verfahren dar, das mit der anfänglichen Isolierung der Zahnpulpa vom Zahn beginnt, gefolgt von der Kultur und Aufrechterhaltung der DPSCs im Labor und schließlich mit ihrer Charakterisierung unter Verwendung spezifischer Stammzellmarker (Abbildung 1). Die Techniken zur Induktion dieser Stammzellen in verschiedene Zelllinien, die ihre Multipotenz hervorheben, werden ebenfalls beschrieben.

Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll entspricht den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Die Verwendung der extrahierten Zähne erfolgte nach ethischen Standards, um die Integrität, Würde und Rechte der Teilnehmer zu gewährleisten. Bei den für diese Studie ausgewählten Teilnehmern handelte es sich um gesunde Personen unter 30 Jahren, die für eine kieferorthopädische Behandlung eine Zahnextraktion benötigten. Personen mit ausgedehnter Zahnkaries oder schwerer Parodontitis wurden von der Studie ausgeschlossen. Milchzähne wurden von Kindern entnommen, die die Extraktion von retinierten Zähnen benötigten. Eine schriftliche Einverständniserklärung der an dieser Studie beteiligten Probanden wurde ebenfalls eingeholt.

1. Extraktion und Transport von Zähnen

  1. Entnahme von Milchzähnen und bleibenden Zähnen
    1. Erklären Sie den Teilnehmern den Zweck des Verfahrens und die mögliche Verwendung der extrahierten Zähne für Forschungszwecke.
    2. Führen Sie die Zahnextraktion unter örtlicher Betäubung durch, indem Sie ein Betäubungsmittel in die Nähe des zu ziehenden Zahns verabreichen. Konkret wurden für diese Studie 1,75 ml Lidocain gemischt mit Adrenalin (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:200.000 injiziert. Die Auswahl von Zähnen, die keine schwere Karies oder Parodontitis aufweisen, ist vorzuziehen20,21.
  2. Transport der extrahierten Zähne
    HINWEIS: Es wird empfohlen, unter aseptischen Bedingungen zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Dazu gehören das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen und einem Laborkittel und das Arbeiten in einer sterilen Umgebung, wie z. B. einer Laminar-Flow-Haube für biologische Gefahren.
    1. Nachdem der Zahn gezogen wurde, spülen Sie ihn mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus, um Blut und andere Ablagerungen zu entfernen. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell vorsichtig alle anhaftenden Weichteilreste von der Zahnoberfläche (Abbildung 2A).
    2. Tauchen Sie den Zahn 10 s lang in eine Desinfektionslösung, z. B. 70%iges Ethanol. Spülen Sie den Zahn nach der Desinfektion mit sterilem PBS, um alle Reste des Desinfektionsmittels wegzuspülen.
    3. Legen Sie den Zahn in ein steriles Gefäß, in dem sich das Transportmedium befindet.
      HINWEIS: Das Transportmedium bestand aus Alpha-MEM, einem handelsüblichen Nährmedium, das mit Antibiotika ergänzt wurde: 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle). Dieses Medium versorgte die Zellen im extrahierten Zahn mit essentiellen Nährstoffen und sicherte ihr Überleben bis zur Laborverarbeitung. Die Antibiotika dienten dazu, das Bakterienwachstum zu hemmen.
    4. Halten Sie während des Transports eine Temperatur von 4 °C aufrecht, um die zellulären Stoffwechselaktivitäten zu verlangsamen und den Zelltod zu verzögern. Transportieren Sie den Zahn für die nächsten Schritte, einschließlich der Verarbeitung und Isolierung der Stammzellen der Zahnpulpa, ins Labor.

2. Entnahme von Pulpagewebe

  1. Sichern Sie den Zahn mit einer Zahnzange, um sicherzustellen, dass er während des Eingriffs an Ort und Stelle bleibt. Verwenden Sie eine Diamantscheibe, um den Zahn in ein zahnärztliches Handstück (siehe Materialtabelle) zu schneiden, das mit einem Kühlmittel verbunden ist (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Das Ziel ist es, die Pulpakammer freizulegen, ohne das Pulpagewebe darin unnötig zu beschädigen.
  2. Verwenden Sie einen Dentalbagger (siehe Materialtabelle), um das Pulpagewebe zu entfernen. Dieses Instrument ermöglicht die Extraktion von Pulpa, ohne Schäden zuzufügen, wodurch die Lebensfähigkeit der Zahnpulpa-Stammzellen erhalten bleibt (Abbildung 2C).
  3. Legen Sie das gewonnene Gewebe auf eine Petrischale aus Glas. Waschen Sie das Pulpagewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

3. Verdauung des Pulpagewebes und Isolierung der Zellen

  1. Zerkleinerung und Verdauung des Gewebes
    1. Mit einer sterilen chirurgischen Klinge das Pulpagewebe vorsichtig in kleine Fragmente zerkleinern (Abbildung 2D) und in eine Mini-Gewebemühle mit PBS geben, um eine fein homogenisierte Mischung zu erhalten. Dieser Prozess vergrößert die Oberfläche des Gewebes und ermöglicht eine effizientere Enzymwirkung während der Verdauung.
    2. Die zerkleinerten homogenen Gewebefragmente werden in ein 15-ml-Röhrchen überführt und enzymatisch mit einer Mischung aus 3 mg/mL Kollagenase Typ I und 4 mg/ml Dispase verdaut (siehe Materialtabelle). Diese Enzyme wurden in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gelöst, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen.
    3. Das Pulpagewebe wird in der Enzymmischung (Schritt 3.1.2) ca. 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation neutralisieren Sie die Enzyme und sammeln die Zellen durch Zentrifugation (Schritt 3.2.1) für die weitere Kultur.
  2. Zentrifugation und Resuspension
    1. Nach der Inkubation wird das verdaute Gewebe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 x g gedreht, um die Zellen zu pelletieren. In diesem Schritt werden die Zellen von den verbleibenden unverdauten Gewebefragmenten und Enzymen getrennt. Entsorgen Sie das überstehende Medium vorsichtig und achten Sie darauf, das Zellpellet am Boden des Röhrchens nicht zu stören.
    2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem frischen Nährmedium. Dieses Medium bietet die notwendigen Nährstoffe und die Umgebung, damit die isolierten Zellen überleben und sich vermehren können.

4. Zellkultur

  1. Plattierung und Inkubation von Zellen
    1. Die resuspendierten Zellen werden vorsichtig in einen 25 cm² großen Kulturkolben überführt.
      HINWEIS: Das gesamte Material aus einer einzigen Pulpa wird in einen einzigen 25cm 2-Zell-Kulturkolben überführt. Ein Medienvolumen von 5-7 mL sorgt für eine ausreichende Abdeckung und Nährstoffverfügbarkeit der Zellen. Stellen Sie sicher, dass das Kulturmedium für DPSCs Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ist, das mit 10 % bis 20 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird (siehe Materialtabelle), um die erforderlichen Wachstumsfaktoren bereitzustellen. Ergänzen Sie das Medium außerdem mit 1 % Penicillin/Streptomycin, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig im Kolben verteilt sind, um ein homogenes Wachstum zu fördern.
    2. Der Kolben wird bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 -Gehalt inkubiert.
  2. Mittlere Änderung und Überwachung der Konfluenz
    1. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage, um frische Nährstoffe bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. Aspirieren Sie dazu das alte Medium vorsichtig mit einer sterilen serologischen Pipette und ersetzen Sie es durch ein frisches Medium.
    2. Überwachen Sie die Zellkultur regelmäßig unter einem Mikroskop, um das Wachstum der Zellen zu verfolgen und auf Anzeichen einer Kontamination zu prüfen.
    3. Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, den Punkt, an dem die Zellen den größten Teil der Kolbenoberfläche bedecken, aber nicht übermäßig überfüllt sind.
  3. Zelltrypsinisierung und Passing oder Einfrieren
    1. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um das Restmedium und nicht adhärente Zellen zu entfernen.
    2. Geben Sie eine Lösung von 0,25 % Trypsin-EDTA in den Kolben, um die Zellen von der Oberfläche des Kolbens zu lösen. 2-5 min bei 37 °C inkubieren, bis die Zellen abheben.
    3. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen Kulturmedium hinzufügen, und pipettieren Sie dann die Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um eine vollständige Zellablösung zu gewährleisten.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in einem frischen Kulturmedium und plattieren Sie sie entweder für weiteres Wachstum neu (Passage) oder frieren Sie sie für die zukünftige Verwendung ein. Verwenden Sie beim Einfrieren ein Gefriermedium, das ein Kryoprotektivum wie DMSO enthält, um die Zellen vor Schäden während des Einfrierens zu schützen.

5. Charakterisierung von DPSCs

  1. Durchflusszytometrische Analyse
    1. Um die mesenchymale Stammzellnatur der isolierten Zellen zu bestätigen, ist eine durchflusszytometrische Analysedurchzuführen 22,23. Zunächst trypsinisieren und sammeln Sie Zellen, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
    2. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypanfarbstoff-Ausschlusstechnik. Führen Sie die Analyse mit einem Zellviabilitätsanalysator (siehe Materialtabelle) während der 2. und 8. Passage durch. Führen Sie während der 3. und 7. Passage eine phänotypische Analyse mit einem Durchflusszytometer durch.
    3. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation in einem Durchflusszytometrie-Puffer, um überschüssige Antikörper zu entfernen, und analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.
      HINWEIS: Der Durchflusszytometrie-Puffer besteht aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS), 1 % -2 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 % Natriumazid (NaN3). Das FBS oder BSA blockiert die unspezifische Bindung von Antikörpern, während das Natriumazid als Konservierungsmittel wirkt. Ein hoher Prozentsatz der Zellen sollte die mesenchymalen Stammzellmarker exprimieren und es fehlen die hämatopoetischen Marker, was ihre Identität als DPSCsbestätigt 24.
    4. Entfernen Sie die DPSCs und färben Sie sie mit Immunfluoreszenz-Antikörpern für die durchflusszytometrische Analyse.
      HINWEIS: Die Auswahl der Marker für die durchflusszytometrische Analyse von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) basiert auf dem von der International Society for Cellular Therapy (ISCT) festgelegten Konsens, der besagt, dass MSCs CD105, CD73 und CD90 exprimieren sollten und die Expression von CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79a oder CD19 und HLA-KlasseII 25 fehlt. Diese Marker werden häufig in Studien zur Untersuchung von Stammzellen der Zahnpulpa verwendet26. Die Konzentrationen der Antikörper für die Färbung können je nach verwendetem Antikörper variieren, und es wird empfohlen, die Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) für Antikörperverdünnungen und Inkubationsbedingungenzu befolgen 25.
    5. Festlegung der Einstufungskriterien27,28 für die Ausprägung von CD-Markern wie erwähnt: weniger als 10 %, keine Ausprägung; zwischen 11 % und 40 %, geringe Ausprägung; ein Bereich von 41 % bis 70 %, moderate Ausprägung; über 71%, hohe Ausprägung.
    6. Bestätigen Sie zusätzlich das Fehlen hämatopoetischer Marker, indem Sie ein separates Zellaliquot mit Antikörpern gegen CD34 und CD45 inkubieren.

6. Differenzierung mehrerer Abstammungslinien

HINWEIS: In den folgenden Schritten werden Protokolle für die osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierung von dentalen Stammzellen beschrieben. Beginnen Sie mit der Aussaat von Kulturen mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Vertiefung in einer mit Fibronektin beschichteten Gewebekulturplatte mit vollständigem Medium (CM). Überwachen Sie das Zellwachstum, bis eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht ist, bevor das gewünschte Differenzierungsprotokoll eingeleitet wird. Um das Multilinien-Differenzierungspotenzial der DPSCs zu bewerten, initiieren Sie den Differenzierungsprozess in Richtung Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten, indem Sie Zellen in 24-Well-Platten aussäen und sie in geeigneten Differenzierungsmedien kultivieren.

  1. Osteogene Differenzierung
    1. Beginnen Sie mit der Kultivierung von DPSCs in einem regulären Wachstumsmedium unter Standardbedingungen, bis sie einen Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.
    2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Fügen Sie den Zellen das osteogene Differenzierungsmedium (ODM) hinzu.
      HINWEIS: Das ODM besteht aus Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM), ergänzt mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 mM Beta-Glycerophosphat und 100 nM Dexamethason (siehe Materialtabelle).
    3. Inkubieren Sie die Zellen im osteogenen Medium bei 37 °C mit 5 % CO2. Wechseln Sie das osteogene Medium alle 2-3 Tage.
      HINWEIS: Nach 14 bis 21 Tagen sollten sich die DPSCs zu osteoblastenähnlichen Zellen differenziert haben. Dies kann bestätigt werden, indem man auf eine Erhöhung der Expression von Osteoblasten-spezifischen Markern, wie z. B. alkalischer Phosphatase, prüft, oder indem Färbetechniken zum Nachweis mineralisierter Matrix, wie z. B. Alizarinrot-S-Färbung, verwendet werden.
    4. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 1 h lang bei -20 °C mit 70 % eiskaltem Ethanol inkubieren.
    5. Färben Sie die fixierten Zellen mit 40 nM Alizarinrot S (pH 4,2) Färbelösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 10-15 min. Visualisieren Sie die Färbung unter einem Mikroskop, um die osteogene Differenzierung zu bestätigen (Abbildung 3). Die Differenzierung wird durch Färbung der Zellen mit Alizarin Red S bestätigt, das Kalziumablagerungen identifiziert, die auf eine Mineralisierung hinweisen29,30.
  2. Adipogene Differenzierung
    1. Wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, kultivieren Sie DPSCs unter Standardbedingungen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C. Passieren Sie die Zellen, wenn sie etwa 70 % bis 80 % Konfluenz erreichen.
    2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Ersetzen Sie das ausgewaschene Medium durch ein adipogenes Differenzierungsmedium. Dieses Medium besteht in der Regel aus DMEM, 10 % FBS, 10 μg/ml Insulin, 1 μM Dexamethason, 200 μM Indomatacin und 0,5 mM IBMX (siehe Materialtabelle).
    3. Wechseln Sie das Differenzierungsmedium alle 3-4 Tage. Nach ca. 3 Wochen die adipogen-differenzierten DPSCs mit PBS waschen und mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur fixieren.
    4. Färben Sie die fixierten Zellen mit Oil Red O (siehe Materialtabelle), um die Ansammlung von Lipidtröpfchen sichtbar zu machen (Abbildung 4). Um die adipogene Differenzierung weiter zu bestätigen, führen Sie eine Genexpressionsanalyse von adipogenen Markern wie Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor gamma (PPARγ) und Adiponektindurch 31,32.
  3. Chondrogene Differenzierung
    1. DPSCs-Kulturen, die in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten werden, werden für die chondrogene Differenzierung verwendet. Passieren Sie die Zellen, wenn sie etwa 70 % bis 80 % Konfluenz erreichen.
    2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Ersetzen Sie das ausgewaschene Medium durch chondrogenes Differenzierungsmedium, das typischerweise Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 1 % ITS, 100 nM Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbat-2-phosphat, 40 μg/ml Prolin und 10 ng/ml Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) enthält (siehe Materialtabelle).
    3. Halten Sie die Zellen im chondrogenen Differenzierungsmedium und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Nach etwa drei Wochen sollten sich die DPSCs zu chondrozytenähnlichen Zellen differenziert haben.
    4. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) inkubieren. Nach der Fixierung färben Sie die Zellen mit Alcianblau (siehe Materialtabelle) und visualisieren Sie sie unter einem Mikroskop, um die chondrogene Differenzierung zu bestätigen (Abbildung 5).
    5. Bestätigung der Differenzierung von DPSCs in Chondrozyten mit Techniken wie der Alcianblau-Färbung für Proteoglykane oder der Genexpressionsanalyse von chondrogenen Markern wie Aggrecan, SOX9 und Typ-II-Kollagen33,34.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Durchführung des skizzierten Protokolls führte zu Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die in der Lage sind, mehrere Linien zu differenzieren, was ihre Multipotenz demonstriert.

Viabilitäts-Assays
Die Viabilität der DPSCs wurde unter Verwendung eines Trypanblau-Ausschlussassays zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet. Die Ergebnisse zeigen eine konstant hohe Lebensfähigkeit (mehr als 95%) über den gesamten Kulturzeitraum, was die Robustheit unseres Isolations- und Kulturprotokolls zeigt.

Assays für koloniebildende Einheiten (KBE)
Es wurden CFU-Analysen durchgeführt, um die Selbsterneuerungsfähigkeit der DPSCs zu bewerten. Eine einzellige Suspension wurde mit geringer Dichte plattiert und 14 Tage lang kultiviert. Die gebildeten Kolonien wurden dann gefärbt und gezählt. Die Ergebnisse zeigen viele Kolonien, was auf einen hohen Anteil an selbsterneuernden Zellen innerhalb der DPSC-Population hinweist.

Zeit der Zellverdopplung
Die Zellverdopplungszeit wurde auf der Grundlage der Wachstumskurve der DPSCs berechnet. Die Zellen wurden mit einer bestimmten Dichte ausgesät und regelmäßig gezählt, um eine Wachstumskurve zu erstellen. Die Verdopplungszeit wurde dann anhand der exponentiellen Wachstumsphase der Kurve berechnet. Die Ergebnisse zeigen eine Verdopplungszeit, die mit der für MSCs berichteten konsistent ist, was auf eine gesunde und proliferative Zellpopulation hindeutet (Abbildung 6).

Durchflusszytometrische Analyse
Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass eine große Mehrheit der DPSCs (z. B. >95%) positiv für CD90, CD73 und CD105 war, was ihre Identität als MSCs bestätigte (Abbildung 7). Darüber hinaus waren weniger als 2% der Zellen positiv für CD45, CD34 und HLA-DR, was das Fehlen einer signifikanten hämatopoetischen oder endothelialen Zellkontamination bestätigt.

Osteogene Differenzierung
Nach Abschluss der osteogenen Differenzierung wiesen die Zellen eine mineralisierte Matrix auf, die durch Alizarin-Rot-S-Färbung sichtbar gemacht wird (Abbildung 3). Das Vorhandensein einer roten Färbung in den gefärbten Zellen deutet auf die erfolgreiche Abscheidung einer mineralisierten Matrix hin, ein wesentliches Merkmal der osteogenen Differenzierung. Die Unfähigkeit, eine Differenzierungsfärbung erfolgreich zu erreichen, könnte möglicherweise mit Herausforderungen während des Probenentnahmeverfahrens zusammenhängen.

Adipogene Differenzierung
Während der adipogenen Differenzierung akkumulierten die DPSCs Lipidtröpfchen, was auf die Adipogenese hinweist. Die Lipidtröpfchen können mit der Ölrot-O-Färbung beobachtet werden (Abbildung 4). Eine erfolgreiche Differenzierung führte zu orange-rot gefärbten Lipidtröpfchen in den Zellen.

Chondrogene Differenzierung
Schließlich produzierten DPSCs nach chongedogener Differenzierung Glykosaminoglykane, eine kritische Knorpelkomponente, die durch die Alcianblau-Färbung bestätigt wurde und an diese Glykosaminoglykane bindet. Zellen, die sich erfolgreich der Chondrogenese unterzogen, zeigten bei der Färbung eine blaue Färbung (Abbildung 5).

Die Zellen, die in den Färbeverfahren keine entsprechenden Farbveränderungen zeigten, könnten auf die suboptimale Differenzierung zurückzuführen sein, möglicherweise auf Probleme mit den Differenzierungsmedien oder der ursprünglichen Qualität der DPSCs. Es ist wichtig, die Qualität der Medien und Nahrungsergänzungsmittel sowie die Gesundheit und die Anzahl der verwendeten DPSCs sicherzustellen. Die erfolgreiche Differenzierung von DPSCs in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten bestätigt die multipotente Natur dieser Zellen und unterstreicht ihr Potenzial in der regenerativen Medizin und in therapeutischen Anwendungen.

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Abbildung 1: Überblick über die Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von Zahnpulpa-Stammzellen. Diese Abbildung zeigt eine schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für die Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs). Der Prozess beginnt mit der Extraktion des Zahns (oder der Zähne), gefolgt von der Isolierung des Pulpagewebes, aus dem die DPSCs abgeleitet werden. Nach der Isolierung werden die DPSCs verschiedenen Charakterisierungstests unterzogen, um ihre Stammzellidentität zu bestätigen und ihre Lebensfähigkeit, Proliferationsrate und andere wichtige Attribute zu bewerten. Die letzte Phase, die in diesem Diagramm dargestellt ist, beinhaltet die Induktion der Differenzierung, bei der die DPSCs mit spezifischen Faktoren behandelt werden, um ihre Umwandlung in spezialisierte Zelltypen wie Osteoblasten, Adipozyten oder Chondrozyten zu steuern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Pulpaentnahme von extrahierten Zähnen. (A) Ein extrahierter Zahn, der für die Extraktion von Pulpagewebe vorbereitet wurde. (B) Schneiden des extrahierten Zahns mit einem Diamantbohrer. (C) Entfernen des Pulpagewebes aus der Pulpakammer. (D) Fragmentierung des Pulpagewebes mit einer chirurgischen Klinge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Osteogene Differenzierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) nachgewiesen durch Alizarin-Rot-S-Färbung (40x). Die leuchtend rote Färbung zeigt die Ablagerung der mineralisierten Matrix, ein charakteristisches Merkmal von Osteoblasten, das eine erfolgreiche osteogene Differenzierung bestätigt. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Adipogene Differenzierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), demonstriert durch Öl-Rot-O-Färbung. Das Vorhandensein von hellroten Tröpfchen stellt die Lipidakkumulation dar, ein Kennzeichen von Adipozyten, das eine erfolgreiche adipogene Differenzierung bestätigt. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Chondrogene Differenzierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), demonstriert durch Alcian-Blau-Färbung (40x). Die intensive blaue Farbe weist auf das Vorhandensein einer proteoglykanreichen extrazellulären Matrix hin, ein Merkmal der Chondrozyten, das eine erfolgreiche chondrogene Differenzierung bestätigt. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Zellverdopplungszeit für Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs). Diese Abbildung veranschaulicht die Wachstumskurve von DPSCs im Zeitverlauf. Die Zellen wurden zunächst mit einer bestimmten Dichte ausgesät, und es wurden in regelmäßigen Abständen Zellzählungen durchgeführt (dargestellt auf der x-Achse), um die Proliferationsrate zu überwachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Expression von Stammzelloberflächenmarkern in DPSC-Kultur. Diese Abbildung zeigt die Ausprägung spezifischer Oberflächenmarker auf DPSCs. Die mesenchymalen Stammzellmarker CD44, CD90 und CD105 weisen eine hohe Expression auf, was auf das Vorhandensein mesenchymaler Merkmale in diesen Zellen hinweist. Umgekehrt ist die Expression von hämatopoetischen Markern (CD34 und CD45) und dem Haupthistokompatibilitätskomplex der Klasse II (HLA-DR) nahezu vernachlässigbar, was das Fehlen von hämatopoetischen Zellen in der Kultur bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen. Es enthält eine Beschreibung der Lagerung und Proliferation dieser Zellen sowie die Bewertung ihres in vitro Differenzierungspotenzials in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten35.

Chen et al.36 zeigten, dass Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) aus verschiedenen Quellen gewonnen werden können, einschließlich infizierter vitaler menschlicher Zähne, die von Erkrankungen wie Parodontitis, Wurzelresorption, Perikoronitis und Zahnfrakturen betroffen sind, sowie überzählige und falsch ausgerichtete Zähne. Dieser Befund wurde durch nachfolgende Studien weiter bestätigt, in denen infizierte vitale Zähne als potenzielle Quellen für DPSCs identifiziertwurden 37,38,39,40. Bernardi et al.10 wiesen jedoch darauf hin, dass eine erhöhte Wurzelresorption die Lebensfähigkeit dieser Stammzellen nachteilig beeinflussen könnte. Eine wesentliche Hürde dabei ist die Konservierung der Zellen und die Verhinderung ihres Abbaus, der unmittelbar nach der Zahnextraktion oder dem Peeling beginnt. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass Zähne, die von schweren Erkrankungen wie periapikalen Abszessen, Tumoren oder Zysten betroffen sind, nicht zur Extraktion von Stammzellen verwendet werdensollten 40,41.

DPSCs können durch die enzymatische Verdauungstechnik (ED) oder die Methode des Auswachsens aus Gewebeexplantaten (OG), auch bekannt als Spontanwachstumstechnik, beschafft werden14,15. Forscher nutzen diese Strategien, um die Effizienz der Zellproliferation oder die Aufrechterhaltung morphologischer und phänotypischer Eigenschaften isolierter Stammzellen zu untersuchen17. Studien haben gezeigt, dass Stammzellen, die mit der OG-Methode isoliert wurden, eine langsamere Proliferationsrate und eine schwächere Expression von Stammzellmarkern aufweisen18. Umgekehrt zeigten DPSCs, die mit der ED-Methode isoliert wurden, eine schnellere Proliferation, Differenzierung und erhöhte Expression zusätzlicher Oberflächenmarker als solche, die mit der OG-Methode isoliert wurden. Interessanterweise zeigten unreife Stammzellen (IDPSCs), die mit der OG-Technik aus Milchzähnen extrahiert wurden, dass die Zellkultur die selektive Proliferation von IDPSCs förderte und dadurch eine frühe Differenzierung verhinderte42.

Die Aufreinigung von DPSCs ist entscheidend für die Gewinnung hochregenerativer Zellen und erfordert spezifische Zellmarker. Die Zellauswahl erfolgt entweder mit Fluoreszenz- oder magnetisch aktivierten Zellsortiermethoden. Neben den oben genannten Markern werden aufgrund der heterogenen Natur von DSCs43 auch zahlreiche andere Oberflächenantigene verwendet. Es wurde jedoch kein einzelner Marker identifiziert, um die Subpopulationen zu trennen.

Im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen, die aus dem Knochenmark gewonnen werden, wurden DPSCs aufgrund ihres Multilineage-Potenzials als vielversprechende Quelle für multipotente Zellen anerkannt44. Diese Stammhaftigkeit ist wahrscheinlich eine Folge der relativen Unreife des Ausgangsgewebes, da Weisheitszähne, oft die Quelle der DPSC-Extraktion, die letzten bleibenden Zähne sind, die sich entwickeln, und daher weniger reif sind als Knochenmark45. Dieses Protokoll erforscht erfolgreich die multipotente Natur von Stammzellen aus der Zahnpulpa, indem es diese Zellen dazu veranlasst, Adipogenese, Osteogenese und Chondrogenese zu durchlaufen. Bemerkenswert ist, dass DPSCs der einzige Zelltyp sind, der die DSPP-Expression hochreguliert, wenn er unter osteogenen Bedingungen kultiviert wird, was auf ihre zukünftige Differenzierung in Odontoblasten hinweist46.

Zahnstammzellen, die aus verschiedenen Quellen isoliert werden, weisen viele Proliferations- und Differenzierungspotenzialeauf 47. Die bedeutenden Fortschritte, die bei In-vitro-Systemen erzielt wurden, haben die Stammzellbiologie und -therapie tiefgreifend beeinflusst. Trotz dieser Fortschritte gibt es nach wie vor Herausforderungen bei der Übertragung von Stammzelltherapien vom Labortisch auf das Krankenbett. Besonderes Augenmerk muss auf das Überleben und die Stabilität von Stammzellen gelegt werden, um sicherzustellen, dass Konservierungstechniken die Lebensfähigkeit dieser Zellen nicht beeinträchtigen. Während die dentale Stammzellenforschung in Tiermodellen vielversprechende Ergebnisse erbracht hat, besteht ein dringender Bedarf, diese Erkenntnisse auf Versuche am Menschen auszuweiten. Durch die fortgesetzte konsequente Forschung und Entwicklung sind dentale Stammzellen in der Lage, eine wesentliche Rolle bei der Weiterentwicklung des Bereichs der Stammzellbanken zu spielen.

Der enzymatische Verdauansatz zur Isolierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) ist zwar weit verbreitet, weist aber mehrere Einschränkungen auf. In erster Linie kann der Prozess die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen, da Enzyme wie Kollagenase und Dispase versehentlich die Zellmembranen schädigen können, wodurch weniger lebende Stammzellen entstehen17. Darüber hinaus führt diese Methode häufig zum Abbau der vitalen extrazellulären Matrix (EZM), die für die Erhaltung der inhärenten Eigenschaften von Stammzellen entscheidend ist48. Das Verfahren kann auch die Marker der Zelloberfläche verändern, was die genaue Identifizierung und Charakterisierung von DPSCs erschwert43. Abgesehen von diesen biologischen Einschränkungen ist der Ansatz zeitaufwändig und erhöht das Risiko einer mikrobiellen Kontamination aufgrund längerer Inkubationen bei 37 °C. Darüber hinaus kann die Inkonsistenz zwischen den Enzymchargen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, was die Reproduzierbarkeit des Isolierungsverfahrens in Frage stellt. Die finanzielle Belastung ist nicht zu übersehen, da hochwertige Enzyme, die für die Gewebeverdauung geeignet sind, teuer sind49. Darüber hinaus kann es nach der Verdauung zu einer verbleibenden Enzymaktivität kommen, die sich nachteilig auf die Zellkulturen auswirken und ihre Gesundheit, Proliferation und Differenzierung beeinflussen könnte. Schließlich könnte das Potenzial der enzymatischen Verdauung, bestimmte DPSC-Subpopulationen bevorzugt gegenüber anderen zu isolieren, den resultierenden Zellpool unbeabsichtigt verzerren und ihr therapeutisches Potenzial beeinflussen50.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Mathew Mazhavancheril, Direktor und Leiter des Pushpagiri-Forschungszentrums in Thiruvalla, für seine Unterstützung bei der Dokumentation der Abläufe im Forschungszentrum.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-Isobuty-L-methyl-xanthin Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Essigsäure Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S FärbelösungSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkalische Phosphatase -FärbekitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM oder Alpha Minimum EssentialMedium Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, oder Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco Antibiotikum
/AntimykotikumSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbat-2-phosphatSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-Glycerophosphat Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosicherheitswerkbank - Laminar-Flow-HaubeLabconco Corporation, MO 64132-2696, USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 und HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121, USA
Zellsieb (70 & Mikro; m )HiMedia Laboratorien  Ltd.Mumbai, IndienTCP025Zellsieb
ZentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
ZentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,Indien1101 | 1102
CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Kollagenase Typ IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Kollagenase Typ IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Komplettes WachstumsmediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndienAT006DMEM
Konische Röhrchen (15 oder 50Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P / 546041P15 mL und 50 mL
Kryo-GefrierbehälterThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA15-350-50
KryoetikettenEtikett Indien:
Kryovial-Aufbewahrungsboxen  Kryostore Aufbewahrungsboxen
KryofläschchenThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Kryofläschchen (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Selbststehende
Kulturflasche (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
KulturflaschenHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndienTCG4 / TCG6T25 / T75
KulturplattenHiMedia Laboratorien   Ltd.Mumbai, IndienTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental DiamantscheibenKomet SC 29730, USAKomet 
Dentallöffel BaggerBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics, Mannheim, Deutschland.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Deutschland
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndienMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAFisher Scientific
Extraktionszange  Dentsply Sirona, USA
Fötales Kälberserum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fötales Kälberserum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fötales Kälberserum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndienRM9954
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronektin-beschichtete GewebekulturplatteCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
DurchflusszytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Durchflusszytometrie-PufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Deckglas Deckglas 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndienTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Schweiz
Dentales Hochgeschwindigkeits-Handstück NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z-Serie
PferdeserumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, oder 3-Isobutyl-1-methylxanthinSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selen (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selen (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selen (ITS) PremixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverses MikroskopOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60%) )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropylalkohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar-Flow-HaubeThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocain gemischt mit AdrenalinDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
FlüssigstickstoffAir Liquide,75007 Paris,Frankreich
Flüssigstickstoff-LagertankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MikropipettenEppendorf AG,22339 Hamburg,Deutschland30020Accupipet-2-20 & micro; L
Mini Tissue GrinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep Mini
Grinders Minus 80 GefrierschrankBlue Star Limited
Neubauer ZählkammerMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Deutschland
Öl rot O FleckSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenes Differenzierungsmedium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3, Kanada
Paraformaldehyd (PFA)  Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) ohne Ca++ und Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndienTS1101
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Prolin Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Skalpellklinge Größe 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ, UKBDF-6955C
NatriumhypochloritHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndienAS1024% w/v Lösung
Sterile ZentrifugenröhrchenTarsons Products Pvt. Ltd.
Steriler Behälter -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Sterile Pipetten (2, 5 und 10 mL)Eppendorf AG,22339 Hamburg,Deutschland
Sterile Pipetten und SpitzenEppendorf India Limited
Chirurgische Klinge HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β 3)Forschung und Entwicklung D Systems, Inc.MN 55413, USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β 3)Forschung und Entwicklung D Systems, Inc.MN 55413, USA
Trypanblau 0,4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypanblau 0,4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypanblau 0,4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0,25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
WasserbadThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D
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DPSC Isolierungenzymatischer VerdauGewebeexplantat Auswachsenmesenchymale StammzellenDurchflusszytometrieZelldifferenzierungosteogene Differenzierungadipogene Differenzierungchondrogene Differenzierung

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