Entwicklung und Charakterisierung von dezellularisierten extrazellulären Lungenmatrix-Hydrogelen

Summary

Das Protokoll erläutert zwei verschiedene Dezellularisierungsmethoden, die auf natives Lungengewebe von Rindern angewendet werden, und bietet eine umfassende Darstellung ihrer jeweiligen Charakterisierungen.

Abstract

Die Verwendung von Hydrogelen aus extrazellulärer Matrix (ECM) im Tissue Engineering wird immer beliebter, da sie die natürliche Umgebung von Zellen in vitro nachahmen können. Die Aufrechterhaltung des nativen biochemischen Gehalts der ECM, das Erreichen mechanischer Stabilität und das Verständnis der Auswirkungen des Dezellularisierungsprozesses auf die mechanischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele sind jedoch eine Herausforderung. Hier wurde eine Pipeline zur Dezellularisierung von Rinderlungengewebe unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen, der nachgeschalteten Charakterisierung der Wirksamkeit der Dezellularisierung, der Herstellung von rekonstituierten dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogelen und der Bewertung ihrer mechanischen und zytokompatiblen Eigenschaften beschrieben. Die Dezellularisierung der Rinderlunge wurde mit einer physikalischen (Gefrier-Tau-Zyklen) oder chemischen (auf Detergenzienbasis) Methode durchgeführt. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen wurden durchgeführt, um die Dezellularisierung und Retention der wichtigsten EZM-Komponenten zu validieren. Für die Bewertung des Restgehalts an Kollagen und sulfatiertem Glykosaminoglykan (sGAG) in den dezellularisierten Proben wurden Sirius-Rot- bzw. Alcianblau-Färbetechniken eingesetzt. Die mechanischen Eigenschaften der dezellularisierten Lungen-ECM-Hydrogele wurden durch oszillatorische Rheologie charakterisiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dezellularisierte Rinderlungenhydrogele eine zuverlässige organotypische Alternative zu kommerziellen ECM-Produkten darstellen können, indem sie die meisten nativen ECM-Komponenten beibehalten. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass die Dezellularisierungsmethode der Wahl die Gelierungskinetik sowie die Steifigkeit und viskoelastischen Eigenschaften der resultierenden Hydrogele signifikant beeinflusst.

Introduction

Herkömmliche Monolayer-Kulturbedingungen bieten keine originalgetreue Darstellung der nativen Gewebemikroumgebungen und sind nicht in der Lage, ein dreidimensionales (3D) Gerüst mit instruktiven Liganden bereitzustellen, die Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen¹. Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (ECM) sind sehr gewebespezifisch, zeitabhängig und unterliegen Veränderungen in pathologischen Zuständen. Daher besteht ein Bedarf an biomimetischen 3D-Gewebemodellen, die die Abstimmbarkeit solcher Eigenschaften, die Modulation des zellulären Verhaltens und das Erreichen der gewünschten G....

Protocol

Frische einheimische Lungen von jungen (1-2 Jahre alten) Rinderspendern wurden aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen und in einem versiegelten Plastikbehälter auf Eis ins Labor transportiert. Tieropfer werden für den allgemeinen Fleischkonsum (Lunge wird als Abfall entsorgt) durchgeführt und stehen nicht im Zusammenhang mit oder aufgrund der Studie. Wir bestätigen, dass der Schlachthof die nationalen Gesetze und Vorschriften für Tieropfer einhält. Darüber hinaus bestätigen wir, dass wir nur Abfallmaterial verwendet haben und das Forschungsprojekt keinen Einfluss auf die Anzahl der getöteten Tiere hatte.

1. Organentnahme und Gewebep....

Results

Dezellularisierung
Die Dezellularisierung von Rinderlungengewebe zur Herstellung von dECM-Hydrogelen, die die native Lungenmikroumgebung rekapitulieren würden, wurde sowohl durch physikalische (Gefrier-Auftauen) als auch durch chemische (Triton-X-100) Methoden erreicht. Nach der Dissektion wurden Gewebestücke in dH₂O-haltigen Antibiotika gewaschen, um Krankheitserreger zu entfernen, die später die Sterilität der dECM-Hydrogele beeinträchtigen können. Insgesamt fünf Zyklen im Wechsel zwische.......

Discussion

Aus Organen gewonnene Hydrogele sind zu vielversprechenden Modellen geworden, die die native Gewebe-EZM rekapitulieren und die organotypische Zellfunktion nachahmen. Obwohl dezellularisierte Lungen-EZM häufig im Tissue Engineering eingesetzt wurde, wird eine gründliche Charakterisierung der Biomaterialzusammensetzung und der mechanischen Eigenschaften zu einem besseren Verständnis beitragen, wie Zell-ECM-Interaktionen moduliert werden können, um biologische Prozesse während der Homöostase oder Krankheit zu modellieren. I.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolutes Ethanol	ISOLAB	64-17-5
Essigsäure	ISOLAB	64-19-7
Alcianblau-Lösung	Sigma-Aldrich	B8438
Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 Rheometer	TA Instruments
Entellan Einbettmedium	Merck	107960
Eosin-Lösung	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyd-Elektronenmikroskopie	Sciences	50-980-485
Salzsäure	Merck	100317
Jod	Sigma-Aldrich	3002
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's Hämatoxylin-Färbelösung	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin aus der Magenschleimhaut des Schweins	Sigma-Aldrich	P6887
Pikrinsäure	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298