Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Elena Levi-D’Ancona; Vaibhav Sidarala; Scott A. Soleimanpour

doi:10.3791/65789

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Methodenartikel

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

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DOI:

10.3791/65789

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15. September 2023

Elena Levi-D’Ancona¹^,² , Vaibhav Sidarala¹ , Scott A. Soleimanpour¹^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴VA Ann Arbor Healthcare System

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Mitophagie ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der für die Aufrechterhaltung einer optimalen Mitochondrienfunktion erforderlich ist. Eine dysfunktionale β-Zell-Mitophagie führt zu einer unzureichenden Insulinausschüttung. Fortgeschrittene quantitative Bewertungen der Mitophagie erfordern oft den Einsatz genetischer Reporter. Das mt-Keima-Mausmodell, das eine auf die Mitochondrien abzielende pH-sensitive ratiometrische Sonde mit doppelter Erregung zur Quantifizierung der Mitophagie mittels Durchflusszytometrie exprimiert, wurde in β-Zellen optimiert. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen kann zur robusten Quantifizierung der Mitophagie verwendet werden. Die Verwendung genetischer Mitophagie-Reporter kann jedoch eine Herausforderung darstellen, wenn mit komplexen genetischen Mausmodellen oder schwer zu transfizierenden Zellen, wie z. B. primären menschlichen Inseln, gearbeitet wird. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige komplementäre farbstoffbasierte Methode zur Quantifizierung der β-Zell-Mitophagie in primären Inselzellen mittels MtPhagy. MtPhagy ist ein pH-empfindlicher, zelldurchlässiger Farbstoff, der sich in den Mitochondrien anreichert und ihre Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sich Mitochondrien in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert befinden, wie z. B. Lysosomen während der Mitophagie. Durch die Kombination des MtPhagy-Farbstoffs mit Fluozin-3-AM, einem^Zn2+ -Indikator, der für β-Zellen selektiert, und Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) zur Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials kann der Mitophagiefluss in β-Zellen mittels Durchflusszytometrie spezifisch quantifiziert werden. Diese beiden Ansätze ergänzen sich in hohem Maße und ermöglichen Flexibilität und Präzision bei der Beurteilung der mitochondrialen Qualitätskontrolle in zahlreichen β-Zell-Modellen.

Einleitung

β-Zellen der Bauchspeicheldrüse produzieren und sezernieren Insulin, um den Stoffwechselbedarf zu decken, und β-Zell-Dysfunktion ist für Hyperglykämie und das Auftreten von Diabetes sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes verantwortlich. β-Zellen koppeln den Glukosestoffwechsel mit der Insulinsekretion über die mitochondriale Energetik und die Stoffwechselleistung, die von einer Reserve an funktioneller mitochondrialer Masse abhängen ^1,2,3. Um eine optimale β-Zell-Funktion aufrechtzuerhalten, verlassen sich β-Zellen auf mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen, um ge....