Ein passives Sprunggelenk-Dorsalflexions-Testsystem für ein In-vivo-Modell der Überlastungsinduzierten Tendinopathie

Da Sehnen Muskeln mit Knochen verbinden und sich während ihres gesamten Lebens täglich wiederholende Bewegungen durchlaufen, sind sie sehr anfällig für Überlastungsverletzungen, die schmerzhaft und einschränkend sind und zu einer Beeinträchtigung der mechanischen Funktion führen, von der 30-50 % der Bevölkerung betroffen sind¹. Tendinopathien sind chronische Erkrankungen, die aufgrund sich wiederholender Ermüdungsbewegungen und unzureichender Heilung auf das Niveau vor der Verletzung als Überlastungsverletzungen gelten. Sowohl die oberen als auch die unteren Extremitäten sind häufig betroffen, einschließlich der Rotatorenmanschette, des Ellbogens, der Achillessehne und der Patellasehne 2,3,4,5. Eine Achillessehnenentzündung tritt häufig bei Aktivitäten auf, die Laufen und Springen beinhalten, insbesondere bei Sportlern, die an Leichtathletik, Mittel- und Langstreckenlauf, Tennis und anderen Ballsportarten beteiligt sind, und betrifft 7-9% der Läufer ^6,7. Verletzungen durch Laufen und Springen können auch zu einer eingeschränkten Dorsalflexion des Knöchels führen, die ein Risikofaktor für Achillessehnen- und Patellatendinopathien ist ^8,9,10. Daher besteht ein Bedarf an einer besseren Beurteilung und Charakterisierung der Tendinopathie, die diese Studie als Rattenmodell der passiven Knöcheldorsalflexion bei Überlastungsverletzungen der Achillessehne liefern kann.

Bisherige Arbeiten mit Kleintiermodellen zielten darauf ab, die Entwicklung und die Marker der Tendinopathie zu untersuchen. Dazu gehören Laufbandübungen, wiederholtes Greifen, direkte Sehnenbelastung, Kollagenase-Injektionen, Operationen und In-vitro-Studien 11,12,13,14,15,16. Obwohl die Literatur von der Identifizierung von Schadensmarkern durch die Verwendung dieser Tendinopathie-Modelle profitiert hat, gehören zu den Einschränkungen die Belastung der Sehne bei nicht physiologisch relevanten Gelenkbewegungen, wie im Fall der direkten Belastung der Sehne, die nicht direkt gemessene aufgebrachte Lasten, wie z. B. bei Laufbandstudien, und die Verwendung einer physiologischen Überbeanspruchung, wie dies bei Kollagenase-Injektionen der Fall ist. unter anderem. Zu diesem Zweck zielte diese Studie darauf ab, ein System zu entwickeln, das nicht-invasiv quantifizierte Belastungen auf die Achillessehne aufbringt, mit der Anwendung für überlastungsinduzierte Tendinopathie-Studien, um die Lücken in zuvor entwickelten Kleintiermodellen für Tendinopathie zu schließen. Wir haben eine Pilotstudie durchgeführt, um zu zeigen, dass das System reproduzierbare Änderungen der mechanischen Eigenschaften über einen Bereich von Belastungszyklen induziert. Dieses System ermöglicht es, physiologisch relevante Bewegungen und Belastungen zu einer Überbeanspruchung zu induzieren und gleichzeitig die Kräfte zu quantifizieren und zu messen, die während des Belastungsregimes auf die Sehne ausgeübt und von ihr erfahren werden.

Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt. Die Tiere wurden mit 5 % Isofluran zur Induktion und zu 2,5 % zur Erhaltungstherapie betäubt, wobei darauf geachtet wurde, eine Unterkühlung zu vermeiden.

1. Einrichten des Testsystems

1. Steuern Sie die passive Knöchelrotation durch einen Schrittmotor, um eine gleichmäßige Drehung und ein gleichmäßiges Drehmoment anzuwenden. Steuern Sie den Schrittmotor mit einem Mikrocontroller. Verwenden Sie die Eingaben aus dem 3D-Positions- und Ausrichtungssystem, um die Rotationsgrade zu markieren. Verwenden Sie die Ausgänge des Drehmomentsensors, um eine Rückkopplungssteuerung zur Erhöhung des Dorsalflexionswinkels bereitzustellen, wenn die Grenze zum Schwellenwert nicht erreicht wird.
2. Schließen Sie zunächst den Mikrocontroller, den Drehmomentsensor, das elektromagnetische 3D-Positionierungs- und Ausrichtungssystem an einen Computer und die Stromversorgung an. Steuern Sie das maßgeschneiderte System mithilfe eines intern entwickelten MATLAB-Codes (Abbildung 1). Laden Sie die MATLAB-Codedateien von GitHub herunter und befolgen Sie die spezifischen Anweisungen zum Ausführen des Codes auf der GitHub-Seite instructions (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
3. Öffnen Sie MATLAB mit den Codedateien. Öffnen Sie die PDImfc-Software, um das elektromagnetische 3D-Positionierungs- und Ausrichtungssystem mit dem MATLAB-Programm zu verbinden. Klicken Sie auf Verbinden | Kontinuierlicher P&O | StartSockExport() aufgerufen werden. Lassen Sie die Anwendung im Hintergrund geöffnet.

2. Ex-vivo und post-mortem

1. Euthanasie von sechs 13 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten durch CO_{2 -} Inhalation und eine sekundäre Euthanasiemethode durch Thorakotomie. Sezieren Sie die rechte Achillessehne mit intaktem Fersenbein und myotendinösem Übergang. Bei -20° C einfrieren, um zu einem späteren Zeitpunkt mechanische Tests durchzuführen. Nachdem die Sehne aufgetaut, fein zerlegt und für die mechanische Prüfung vorbereitet wurde, wird eine Zugbelastung bis zum Versagen durchgeführt, um die endgültige Zugfestigkeit (UTS) der Sehne zu erhalten (Vorspannung auf 0,1 N, Vorkonditionierung für 10 Zyklen von 0,1 - 1 N, Rampe bis zum Versagen bei einer konstanten Verschiebung von 0,1 mm/s). Verwenden Sie 15 % des UTS als Eingabe für das System, um die Vorkonditionierung für einen späteren Schritt durchzuführen, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
2. Euthanasie eine weitere Gruppe von fünf Tieren mit dem gleichen Verfahren für Momenten-, Arm- und Belastungsmessungen. Führen Sie eine Röntgenaufnahme des linken Beins mit dem Knöchel in 90° Dorsalflexion neben einem Lineal als Referenz durch. Öffnen Sie das Röntgenbild in Fidschi, verwenden Sie das Lineal im Bild als Referenz, messen Sie den Sehnenmomentarm vom Rotationszentrum des Sprunggelenks bis zur Rückseite des Knöchels, der als Eingabe im MATLAB-Code verwendet werden soll, um die in Schritt 2.1 beschriebene Eingangskraft für die Vorkonditionierung in den entsprechenden Drehmomentwert umzuwandeln, sowie die Umrechnung zwischen dem ausgegebenen Drehmoment und der Kraft für die Datenanalyse.
3. Ruhigstelle die linke Hintergliedmaße ruhig, indem du zwei Schienen verklebst, um das Knie in volle Streckung zu bringen. Beugen Sie den Knöchel leicht nach dorsal, indem Sie auf die Zehen drücken, um sicherzustellen, dass die Knöchelrotation aufgrund der isolierten Sehne erfolgt und nicht das umliegende Weichgewebe einbezieht und unter Spannung steht. Wenn das Knie nicht verspannt ist oder sich bewegt, kleben Sie die Schiene wieder ab.
4. Lege die Sehne frei, indem du die Haut um die Achillessehne entfernst. Lege Kleber auf eine 1/32-Zoll-Aluminiumperle, lege sie auf die freie Sehne, die dem myotendinösen Übergang der Achillessehne am nächsten ist, und verwende ein Wattestäbchen mit Kochsalzlösung, um überschüssigen Kleber zu entfernen. Tragen Sie während des restlichen Eingriffs wiederholt Kochsalzlösung auf die Achillessehne auf, um die Feuchtigkeit des Gewebes zu gewährleisten.
5. Messen Sie die Querschnittsfläche des Spannglieds mit einem digitalen Messschieber, bevor Sie eine Last aufbringen. Nehmen Sie an, dass es sich bei der Sehne um eine Ellipse handelt, und messen Sie die Breite und Dicke in Dreifachen.
6. Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf die Ganzkörperplattform. Befestigen Sie den Knöchel mit einem Kabelbinder um den Knöchel und einem weiteren um die Zehen am Gelenkaktor und sichern Sie das gespreizte Knie mit zwei Kabelbindern. Drehen Sie die Achse so, dass sich der Knöchel in voller Plantarflexion befindet.
7. Schließen Sie den Digitalisierungsstift des elektromagnetischen 3D-Positions- und Orientierungssystems an den Computer an und schalten Sie die Stromversorgung ein.
8. Führen Sie den Systemcode (näher beschrieben in Schritt 3) für die angegebene Anzahl von Zyklen aus (in dieser Studie erhielten sechs euthanasierte Ratten 7.200 Zyklen).
9. Bei 0, 500, 1.000, 2.000, 3.600 und 7.200 Zyklen für die Ex-vivo-Dehnungsmessungen das zyklische Belastungsregime pausieren und die Länge der Sehne vom Fersenbein bis zur Aluminiumperle in Schritten von 5° von 0 bis 40° Dorsalflexion (die Grenze der Betätigung aufgrund physikalischer Einschränkungen des Systems) mit dem 3D-Digitalisierungsstift in dreifacher Ausführung abwechselnd messen.
10. Berechnen Sie die Sehnendehnung unter Verwendung der Längen aus Schritt 2.9, wobei die Anfangslänge für jede Zykluszahl bei 0° Dorsalflexion liegt. Führen Sie eine lineare Anpassung durch, um die Beziehung zwischen Dorsalflexionswinkel und Dehnung bei jeder Zyklusnummer zu erhalten. Verwenden Sie diese Beziehung, um Winkelrohdaten für die Datenanalyse in Dehnungen umzuwandeln.
11. Berechnen Sie die Sehnenquerschnittsfläche mit einem digitalen Messschieber bei 40° Dorsalflexion unter der Annahme einer Inkompressibilität (konstantes Volumen) mit den Sehnenlängenmessungen bei 0° und 40° und der gemessenen Querschnittsfläche bei 0°. Verwenden Sie diese Querschnittsfläche bei jeder Anzahl von Zyklen, um Kraft in Spannung für die Datenanalyse umzurechnen (Spannung = Kraft / Querschnittsfläche).

3. Mechanisches Belastungsprotokoll

1. Für diesen Abschnitt der Studie verwendeten wir 25 weibliche 11 Wochen alte Sprague-Dawley-Ratten, wobei 5 Ratten jeweils nach dem Zufallsprinzip 500, 1.000, 2.000, 3.600 oder 7.200 Zyklen Ermüdungsbelastung erhielten.
   HINWEIS: Die Vorkonditionierung, die anfängliche Kalibrierung sowie die Vor- und Nachmessung dauern etwa 15 Minuten, und das zyklische Ermüdungsbelastungsprogramm dauert 1 Sekunde pro Zyklus. Daher beträgt die längste Zeit, die die Ratte unter Narkose steht, etwa 2 Stunden, die nach IACUC-genehmigten Protokollen durchgeführt wurde.
2. Schließen Sie den Mikrocontroller, den Drehmomentsensor, die elektromagnetische 3D-Positionierung und das Ausrichtungssystem an einen Computer und die Stromversorgung an. Steuern Sie das maßgeschneiderte System mit dem intern entwickelten MATLAB-Code (Abbildung 1).
3. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie MATLAB mit den Codedateien. Öffnen Sie die PDImfc-Software, um das elektromagnetische 3D-Positionierungs- und Ausrichtungssystem mit dem MATLAB-Programm zu verbinden. Klicken Sie auf Verbinden | Kontinuierlicher P&O | StartSockExport() aufgerufen werden. Lassen Sie die Anwendung im Hintergrund geöffnet.
4. Anästhesie mit 5% Isofluran durch Inhalation in einer Induktionskammer einleiten. Befestigen Sie das Tier nach der Induktion auf der Ganzkörperplattform mit einem Heizelement auf Wasserbasis, um die Temperatur aufrechtzuerhalten und die Anästhesie mit 2,5 % Isofluran über einen Nasenkonusaufsatz aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie eine feuchte Salbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
5. Legen Sie die Ratte in Bauchlage auf die Ganzkörperplattform. Befestigen Sie den Knöchel mit einem Kabelbinder um den Knöchel und einem weiteren um die Zehen am Gelenkaktor und sichern Sie das gespreizte Knie mit zwei Kabelbindern. Drehen Sie die Achse so, dass sich der Knöchel in voller Plantarflexion befindet.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kabelbinder keine Einschnürungen oder Läsionen verursachen, seien Sie vorsichtig beim Anziehen und legen Sie bei Bedarf Gaze zwischen den Kabelbinder und die Haut, um eine Schutzschicht zu erhalten.
6. Für die folgenden Schritte, bei denen der Systemcode ausgeführt wird, klicken Sie für jeden Abschnitt des Codes, der dem jeweiligen Belastungstest entspricht, auf Auf MATLAB ausführen.
7. Wiederholen Sie den Knöchel 50 Mal bis zu 15 % der endgültigen Zugspannung, basierend auf dem Wert der ultimativen Zugspannung der Achillessehne vom Ex-vivo-Zug bis zum Versagen, gemessen auf der Grundlage von Schritt 2.1.
8. Führen Sie eine erste Kalibrierung der Sehne durch, indem Sie sie dreimal auf 12° dorsalflexieren. Verwenden Sie die Steigung des linearen Bereichs des Belastungsbereichs der Hysteresekurve, um den exponentiellen Bereich der Kurve zu berechnen.
9. Beugen Sie den Knöchel schrittweise in zunehmenden Winkeln, bis entweder der exponentielle Bereich der Kurve durch Berechnung der Steigung der Spitze des Belastungsbereichs der Kurve (berechnet mit dem intern entwickelten MATLAB-Code) oder bis er um 40° gedreht wird, je nachdem, was zuerst eintritt.
10. Führen Sie am endgültigen erhaltenen Winkel fünf zyklische mechanische Messungen als Vorspannungsbasis durch.
11. Führen Sie das zyklische Ermüdungsbelastungsprogramm für eine bestimmte Anzahl von Zyklen durch (in dieser Studie entweder für 500, 1.000, 2.000, 3.600 oder 7.200 Zyklen).
12. Berechnen Sie alle 50 Zyklen die Steigung des Belastungsanteils der Hysteresekurve (berechnet durch den intern entwickelten MATLAB-Code), um sicherzustellen, dass er sich noch im exponentiellen Bereich befindet. Erhöhen Sie den Dorsalwinkel um 1°, es sei denn, er liegt bereits bei 40°, bis dieser exponentielle Bereich erreicht ist.
13. Nachdem das zyklische Belastungsregime abgeschlossen ist, führen Sie fünf zyklische mechanische Messungen als Messungen nach der Belastung im ursprünglich gewählten Winkel durch, um die mechanischen Eigenschaften der Sehnen zu messen.
14. Entferne die Kabelbinder und die Schiene. Bringen Sie das Tier in die Auffangkammer zurück. Das Tier wird nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es wieder zu Bewusstsein gekommen ist, dann wird es in seinen Käfig zurückgebracht. Überwachen Sie die Tiere täglich auf unerwünschte klinische Symptome und verabreichen Sie, falls vorhanden, Buprenorphin in einer Dosis von 1,2 mg/kg subkutan einmal alle 72 Stunden oder führen Sie eine frühzeitige Euthanasie durch. Euthanasie der Tiere nach 7-tägiger Käfigaktivität durch CO_{2 -} Inhalation und eine sekundäre Euthanasie durch Thorakotomie.
    HINWEIS: Die zyklische Belastungsanwendung und die mechanischen Messungen wurden mit einer speziell angefertigten Vorrichtung durchgeführt, die aus einem Drehmomentsensor, einem 3D-gedruckten Knöchelgelenkaktuator und einem Tierbett, einem elektromagnetischen 3D-Positions- und Ausrichtungssystem und einem Schrittmotor besteht, der eine Welle dreht, um eine Dorsalflexion zu erreichen, wie bereits von unserer Gruppe¹⁷ berichtet. Dieses System wird von einem MATLAB-Skript gesteuert, das in Schritt 1.2 erwähnt wurde. Der Drehmomentsensor und das Positions- und Ausrichtungssystem erfassen Drehmoment- und Positionsdaten während des gesamten Belastungsprotokolls des Systems.

4. Datenanalyse

1. Laden Sie die Daten vor und nach der Messung separat in MATLAB.
2. Das Drehmoment wird auf der Grundlage des gemessenen Momentenarms aus Schritt 2.2 und der Querschnittsfläche, die bei der angegebenen Anzahl der aufgebrachten Lasten gemessen wurde, die aus Schritt 2.11 unter Verwendung der Gleichungen (1) und (2) ermittelt wurden, in Spannung umgerechnet:
   (1)
   (2)
3. Konvertieren Sie den Winkel in Dehnung basierend auf der Umrechnung aus Schritt 2.10.
4. Berechnen Sie die durchschnittliche Hysterese (Bereich zwischen den Be- und Entladekurven), die Spitzenspannung (maximaler Spannungswert des Zyklus) und die Be- und Entlademodule (lineare Anpassung der letzten 50 % der Belastungs- und der ersten 60 % der Entladekurven) für die Vor- und Nachmesszyklen.
5. Berechnen Sie die prozentuale Änderung der mechanischen Eigenschaften aus Schritt 4.4 zwischen den Vor- und Nachmesszyklen.

Mit zunehmender Anzahl der applizierten Zyklen kam es zu einer stärkeren Verringerung der mechanischen Eigenschaften der In-vivo-Sehnen . Es zeigte sich eine signifikant geringere Verringerung der Hysterese und der Be- und Entlademodule für die 500-Zyklus-Gruppe im Vergleich zu den 3.600- und 7.200-Zyklus-Gruppen (p < 0,05) (Abbildung 2). Während es eine signifikante Verringerung der Spitzenbelastung pro Zyklus von der 500-Zyklus-Gruppe bis zur 3.600-Zyklus-Gruppe gab, gab es keine signifikante Verringerung zwischen den 500- und 7.200-Zyklus-Gruppen. Es gab eine konsistente prozentuale Abnahme der Hysterese, der Spitzenspannung und der Be- und Entlademodule für die 3.600- und 7.200-Zyklusgruppen. Hämatoxylin- und Eosin- und Masson-Trichrom-gefärbte Bilder von Sehnenproben bestätigten ein höheres Maß an mikrostruktureller Schädigung mit längeren Dorsalflexionszyklen mit mehr abgerundeten Zellen, Hyperzellularität, Faseraufschluss und Faserkräuslung (Abbildung 3). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass höhere Dorsalflexionszyklen eine erhöhte Schädigung der Achillessehne verursachen.

Abbildung 1: Passives Knöchel-Dorsalflexions-Testsystem. (A) Stromversorgung, (B) Mikrocontroller, (C) Schrittmotor, (D) Drehmomentsensor, (E) elektromagnetischer 3D-Positionierungs- und Ausrichtungssensor, (F) 3D-gedruckte Knöchelhalterung, (G) 3D-gedrucktes Tierbett, (H) 3D-gedruckter Nasenkonushalter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative zyklische Belastungs-Spannungs-Dehnungs-Kurven. Hysteresekurven bei 0, 500, 1.000, 2.000, 3.600 und 7.200 Zyklen. Der Pfeil zeigt an, dass die Spitzenspannung mit zunehmender Anzahl von Zyklen abnimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative histologisch gefärbte Bilder von Sehnenproben. Hämatoxylin und Eosin (links) und Massons Trichrom (rechts) gefärbte Bilder von Sehnen für Gruppen mit 500, 1.000, 2.000, 3.600 und 7.200 Zyklen für diese Studie zeigten, dass eine Erhöhung der Anzahl der angewendeten Zyklen zu abgerundeteren Zellen, Hyperzellularität (Sterne), Faseraufschluss und Faserkräuseln (Pfeile) führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.