Mechanische Dissoziation von Geweben für die Einzelzellanalyse mit einem motorisierten Gerät

Summary

Es wird ein allgemeines Protokoll für die kombinierte enzymatische und halbautomatische mechanische Dissoziation von Geweben zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen für nachgeschaltete Analysen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, bereitgestellt. Anweisungen für die Herstellung, Montage und den Betrieb der kostengünstigen mechanischen Vorrichtung, die für dieses Protokoll entwickelt wurde, sind enthalten.

Abstract

Die Möglichkeit, einzelne Zellen für die Analyse von Gewebeproben zu isolieren und vorzubereiten, ist für neue biomedizinische Entdeckungen und Forschungen schnell entscheidend geworden. Manuelle Protokolle für Einzelzellisolierungen sind sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzervariabilität. Automatisierte mechanische Protokolle sind in der Lage, die Verarbeitungszeit und die Probenvariabilität zu reduzieren, sind aber in Forschungsumgebungen mit geringeren Ressourcen nicht leicht zugänglich oder kostengünstig. Das hier beschriebene Gerät wurde für die halbautomatische Gewebedissoziation unter Verwendung kommerziell erhältlicher Materialien als kostengünstige Alternative für akademische Labore entwickelt. Anweisungen zur Herstellung, Montage und Bedienung des Gerätedesigns wurden bereitgestellt. Das Dissoziationsprotokoll erzeugt zuverlässig Einzelzellsuspensionen mit vergleichbaren Zellausbeuten und Probenviabilität wie manuelle Präparationen über mehrere Mausgewebe. Das Protokoll bietet die Möglichkeit, bis zu 12 Gewebeproben gleichzeitig pro Gerät zu verarbeiten, wodurch Studien, die große Probengrößen erfordern, leichter zu bewältigen sind. Die mitgelieferte Software ermöglicht auch die Anpassung des Geräteprotokolls, um unterschiedliche Gewebe und experimentelle Einschränkungen zu berücksichtigen.

Introduction

Die Einzelzellanalyse ist für neue biomedizinische Entdeckungen schnell von entscheidender Bedeutung geworden, sei es für Anwendungen wie die Durchflusszytometrie, die Identifizierung verschiedener Zelltypen, die Einzelzellsequenzierung oder die Identifizierung genomischer oder transkriptomischer Variationen zwischen Zellen¹. Die Durchführung solcher Zellisolierungen aus Geweben von Interesse erfordert das Zerkleinern von präpariertem Gewebe und das Schieben durch ein feines Zellsieb, um das Bindegewebe aus den gewünschten Zellen herauszufiltern (Abbildung 1A). Die Isolierung adhärenter Zelltypen, wie dendritische ....

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Für diese Studien wurden Gewebe von 7 bis 9 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäusen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Manuelle Dissoziation

HINWEIS: Dieser Schritt wurde von Maisel K. et ^al.7 übernommen.

1. Entfernen Sie präpariertes Gewebe und legen Sie es in kalte Zellkulturmedien mit 5% fötalem Rinderserum (FBS).
2. Hacken Sie das Gewebe mit einer scharfen Sezierschere, bis die Fragmente....

Results

Dieses halbautomatische mechanische Protokoll kann Ergebnisse von Experimenten replizieren, in denen Zellen manuell bearbeitet wurden. Zellsuspensionen, die mit diesem Gerät und durch manuelle Dissoziation hergestellt wurden, zeigen vergleichbare Zellausbeuten und Probenviabilität in Lungen-, Nieren- und Herzgeweben von Mäusen (Abbildung 2A, B). Populationen von Immunzellen, wie T-Zellen und dendritische Zellen, wurden durch einen Unterschied im Isolationsprotokoll nicht sig.......

Discussion

Dieses Gerät wurde für die einfache Montage in der Forschungsumgebung entwickelt, um Einzelzellsuspensionen aus ganzen Geweben für die anschließende Einzelzellanalyse bereitzustellen. Die Funktionen sind zwar einfach, reichen aber aus, um die Bedürfnisse von Forschern im akademischen Umfeld und darüber hinaus zu erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Geräts ist sein Potenzial, die Herstellung von Einzelzellsuspensionen durch Verringerung der Variabilität zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Fähigkeit, 12+ Proben g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ Zoll Acrylplatte & nbsp; 12 "x 24"	Acryl Mega Store	N / A
& frac12; Zoll Acrylplatte 12 "x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G Edelstahldraht (für Spannarme)	Everbilt	1000847413
16 G elektrischer Draht (verseilt)	Beste Anschlüsse	N / A
2 x 3 mm Magnet	SU-CRO0587	N/A
2-Kanal-Relaisplatine (zur Umkehrung der Polarität des Stroms zu Motoren)	AEDIKO	AE06233
Durchmesser Gleichstrommotoren (12 V, 200 U/min) mit 37 mm Durchmesser x 12	Greartisan	N/A	Nenndrehmoment: 2,2 Kg.cm Untersetzungsverhältnis: 1:22 Nennstrom: 0,1 A D-förmige Abtriebswellengröße: 6 x 14 mm (0,24" x 0,55") (D x L) Getriebegröße: 37 x 25 mm (1,46" x 0,98") (T x L) Motorgröße: 36,2 x 33,3 mm (1,43" x 1,31") (T x L) Größe der Montageöffnung: M3 (nicht im Lieferumfang enthalten)
AC/C-Netzteil mit variablem Spannungsregler   (5 Ampere, 3-12 Volt)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Präzisions-Abwärtswandler-Abwärtstransformator	Walfront	1A	(Netzteil zur Stromversorgung von Arduino Nano)
Arduino Nano    (Lafvin)	LAFVIN	8541582500
Tasten	Awpeye	Druckknopf
C57BL6/J Mäuse	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Doppelseitiges Schaumstoffband	SANKA	N/A
Doppelseitige Prototyping-Leiterplatte	deyue	N/A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Elektrischer Löt- und Lötkolben	LDK	1002P
Isolierband	3M	03429NA
FBS (Fötales Rinderserum)	Gibco	16140089
sanfte MACS C Rohre	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Grafik- und statistische Analysesoftware
Hall-Effekt-Sensor Abmessungen: 0,79 x 0,79 x 0,39 Zoll	SunFounder	43237-2
Sechskantkupplung 6 mm Bohrung Motor Messing x 2 x 12	Uxcell	N/A
Sechskantschrauben (M4-.70 x 12 Sechskantkopfschraube) x 12	FAS	N/A
Überbrückungsdrähte (für Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
LCD-Bildschirm	JANSANE	N/A
M3 Innensechskantschrauben x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology Co. Ltd	310luosditaozhuang
M3 EdelstahlMaschinenschrauben Flachkopf-Innensechskantschrauben (30 mm) x 36	Noch wach	a52400001
Schnelltrenn-Anschlussverbinder	IEUYO	22010064
Lysionspuffer für rote Blutkörperchen (10x)	Zellsignalisierung	46232
Anschlussadapter Shield Erweiterungsplatine für Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Technologie	60-026-3