Method Article

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

DOI:

10.3791/65878

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September 29th, 2023

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1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

In This Article

Summary

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Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Abstract

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Solute Carrier (SLCs) sind Membrantransporter, die eine Reihe von endogenen und exogenen Substraten importieren und exportieren, darunter Ionen, Nährstoffe, Metaboliten, Neurotransmitter und Pharmazeutika. Obwohl sich diese Gruppe von Proteinen als attraktive therapeutische Ziele und Marker für Krankheiten erwiesen hat, wird sie von den derzeitigen Pharmazeutika immer noch relativ wenig unter Drogen gesetzt. Wirkstoffforschungsprojekte für diese Transporter werden durch begrenztes strukturelles, funktionelles und physiologisches Wissen behindert, was letztendlich auf die Schwierigkeiten bei der Expression und Reinigung dieser Klasse von membraneingebetteten Proteinen zurückzuführen ist. Hier demonstrieren wir Methoden, um hochreine Milligramm-Mengen von humanen SLC-Transporterproteinen unter Verwendung von Codon-optimierten Gensequenzen zu erhalten. In Verbindung mit einer systematischen Untersuchung des Konstruktdesigns und der Hochdurchsatzexpression stellen diese Protokolle die Erhaltung der strukturellen Integrität und biochemischen Aktivität der Zielproteine sicher. Wir beleuchten auch kritische Schritte in der eukaryotischen Zellexpression, der Affinitätsreinigung und der Größenausschlusschromatographie dieser Proteine. Letztendlich führt dieser Arbeitsablauf zu reinen, funktionell aktiven und stabilen Proteinpräparaten, die sich für hochauflösende Strukturbestimmungen, Transportstudien, niedermolekulare Engagement-Assays und In-vitro-Screenings mit hohem Durchsatz eignen.

Introduction

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Membranproteine sind seit langem Ziele für Forscher und Pharmaindustrie gleichermaßen. Bei den Solute Carriers (SLCs) handelt es sich um eine Familie von über 400 sekundären Transportergenen, die im menschlichen Genom kodiert sind1. Diese Transporter sind am Import und Export zahlreicher Moleküle beteiligt, darunter Ionen2, Neurotransmitter3, Lipide 4,5,6,7, Aminosäuren8, Nährstoffe9,10,11 und Pharmazeutika

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Protocol

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ANMERKUNG: Alle Codon-optimierten RESOLUTE SLC-Gene wurden in AddGene43 deponiert, dessen Links auf der Liste der öffentlichen RESOLUTE-Reagenzien44 verfügbar sind. Diese Gene wurden in das pDONR221-Plasmid kloniert und ermöglichen die direkte Klonierung der Gene in den Zielvektor mittels Rekombinationsklonierung45. Um die Parallelität zu maximieren, werden Bakterien-, Insekten- und Säugetierzellen im Blockformat für die Bacmid-Produktion (Abschnitt 3), die Baculovirus-Amplifikation (Abschnitt 5) und die Expressionstests (Abschnitt 6) gezüchtet. Für diese Schritte ist ein Mikroexpressionsschüttler....

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Results

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SLC-Gene können aus RESOLUTE pDONR-Plasmiden in BacMam-Vektoren für die Säugetierexpression kloniert werden
Die beschriebenen Protokolle für Klonierung, Expression und Aufreinigung haben sich für viele SLC-Transporter über mehrere Proteinfaltungen hinweg bewährt. Nichtsdestotrotz enthalten die Verfahren mehrere Kontrollpunkte zur Überwachung des Fortschritts, die eine Optimierung ermöglichen, um Unterschiede in der Expression, der Proteinfaltung, der lipid- und detergenzienabhängigen Stabilität und de.......

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Discussion

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Die Entwicklung von SLC-gerichteten Therapien wurde durch das Fehlen einer systematischen Charakterisierung der Transporterfunktion behindert. Dies hat dazu geführt, dass im Vergleich zu GPCRs und Ionenkanälen63 unverhältnismäßig weniger Medikamente auf diese Proteinklasse abzielen, obwohl sie zahlreiche Rollen in normalen und pathophysiologischen Prozessen spielen. RESOLUTE ist ein internationales Konsortium, das sich zum Ziel gesetzt hat, modernste Forschungstechniken und -werkzeuge zu entwickel.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde im Rahmen des RESOLUTE-Projekts durchgeführt. RESOLUTE wurde vom Gemeinsamen Unternehmen Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777372 gefördert. Dieses gemeinsame Unternehmen wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union und EFPIA unterstützt. Dieser Artikel gibt nur die Ansichten der Autoren wieder, und weder das IMI noch die Europäische Union und die EFPIA sind für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen verantwortlich. Das pHTBV-Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. Frederick Boyce (Harvard) zur Verfügung gestellt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3C-ProteaseEigens
50- oder 100-kDa-Cut-off-ZentrifugalkonzentratorenSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-MaltosidAnatraceC325CYMAL-5
96-Well-Bacmid-AufreinigungskitMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-Well-Block (2 mL)Greiner Bio-One780271
Selbstklebende KunststoffdichtungenQiagen19570Tape Pads
Agarose-Größenausschluss ChromatographiesäuleCytiva29091596Superose 6 Erhöhung 10/300 GL
Benzonase DNAseEigenhergestellt
BisTrisSigma AldrichB9754
Cholesteryl Hemisuccinat TrisSalz AnatraceCH210CHS
Kobaltmetall-AffinitätsharzTakara Bio635653TALON Metall-Affinitätsharz
D(+)-BiotinSigma Aldrich851209
Dextran-Agarose-GrößenausschlusschromatographiesäuleCytiva28990944Superdex 200 Erhöhung 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce Gewebe Mühle (40 mL)DWK Life Sciences357546
EDTA-freier Proteasehemmer-CocktailSigma Aldrich4693132001cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail
Fötales RinderserumThermo Fisher10500064
Fos-Cholin-12AnatraceF308SFS-12
GlycerinSigma AldrichG5516
Glyko-DiosgeninAnatraceGDN101GDN
Schwerkraft-DurchflusssäulenCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 mittelThermo Fisher12338018FreeStyle 293 mittel
HEPESApollo ScientificBI8181
Hydrophile, neutrale Kieselsäure UHPLC-SäuleSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4,6 x 150
ImidazolSigma Aldrich56750
InsektentransfektionsreagenzSigma Aldrich71259Reagenz
Lauryl Maltose NeopentylglykolAnatraceNG310LMNG
Magnesiumchlorid HexahydratSigma AldrichM2670
MikroexpressionsschüttlerGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-β-D-MaltosidAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosidAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamin-n-oxidAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosidAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17-β- D-GlucopyranosidAnatraceO311DOGNG
Octaethylenglykol Monododecyl
Ether AnatraceO330C12E8
Octylglucose NeopentylglycolAnatraceNG311OGNG
Phosphat gepufferte KochsalzlösungSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyethylen(10)dodecyletherAnatrace AP1210C12E10
Polyoxyethylen(9)dodecyletherAnatraceAPO129C12E9
Poröse Versiegelung für GewebekulturplattenVWR60941-084Rayonfolien für biologische Kulturen
Proteinase KNew England BiolabsP8107S Rekombinationsenzymmischung
Thermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Serumfreie InsektenmedienGibco10902088Sf-900 II serumfreie Medien
NatriumbutyratSigma Aldrich303410
Sonicator 24-Kopf-SondeSonics630-0579
Sonicator AggregatSonicsVCX 750
Strep-Tactin HarzIBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow Hochleistungsharz
SaccharoseSigma AldrichS7903
SaccharosemonododecanoatAnatraceS350DDS Suspensionsangepasste
HEK293-ZellenThermo FisherA14527Expi293F
TransfektionsreagenzSigma Aldrich70967GeneJuice Transfektionsreagenz
hergestellte

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science

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Solute CarriersMembrane TransportersProtein ExpressionProtein PurificationHigh Throughput ScreeningAffinity PurificationSize Exclusion ChromatographySDS PAGE ElectrophoresisFluorescence MicroscopyDrug Discovery

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