Method Article

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

DOI:

10.3791/65898

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Reproductive Medicine, First Hospital of Jilin University, 2Center of Prenatal Diagnosis, First Hospital of Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Abstract

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Runde Spermatiden, die sich durch ihren haploiden genetischen Gehalt auszeichnen, stellen die Vorläuferzellen der reifen Spermien dar. Durch die innovative Technik der runden Spermatideninjektion (ROSI) können Eizellen erfolgreich befruchtet und zu lebensfähigen Föten entwickelt werden. In einem bahnbrechenden Meilenstein, der 1995 erreicht wurde, wurde der erste Mausfötus durch die ROSI-Technologie geboren. Seitdem hat sich ROSI zu einem zentralen Instrument entwickelt, um die komplizierten Mechanismen der Embryonalentwicklung zu entschlüsseln, und birgt ein erhebliches Potenzial in verschiedenen Anwendungen, einschließlich der Beschleunigung der Mauserzeugung und der Produktion genetisch veränderter Mäuse. Im Jahr 1996 wurde ein Meilenstein erreicht, als der erste menschliche Fötus durch die ROSI-Technologie geboren wurde. Die klinischen Anwendungen dieser Methode zeigen jedoch ein schwankendes Muster von Erfolg und Misserfolg. Bisher hat die ROSI-Technologie in der klinischen Praxis keine breite Anwendung gefunden, vor allem aufgrund ihrer geringen Geburtseffizienz und der unzureichenden Validierung der Sicherheit des Fötus. Dieser Artikel bietet eine umfassende Darstellung der genauen Methoden zur Durchführung von ROSI bei Mäusen, um ein neues Licht auf die Grundlagenforschung und ihre potenziellen klinischen Anwendungen zu werfen.

Introduction

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Das letzte Stadium der Spermatogenese beinhaltet die Umwandlung eines runden Spermatiden in ein voll entwickeltes Spermatozoon, das durch ausgeprägte Kopf-, Hals- und längliche Schwanzstrukturen gekennzeichnetist 1. Diese Transformation umfasst signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie, wie z. B. die Kondensation von Chromatin im Zellkern, den Ersatz von Histonen durch Protamin, die Bildung von Akrosomen, die Entwicklung der mitochondrialen Scheide, die Migration und den Verlust von Zentriolen, die Bildung der Schwanzstruktur und die Entfernung von zellulären Resten2.

Im Jahr 1992 wurde der erste menschliche Fötus erfolgreich durch die intrazytoplasmatische Spermieninjektionstechnologie (ICSI) geboren3. Seitdem haben Forscher das Potenzial der Verwendung von runden Spermatiden, die die gleiche haploide genetische Zusammensetzung wie reife Spermien aufweisen, zur Befruchtung von Eizellen und zur Aufrechterhaltung lebensfähiger Schwangerschaftenuntersucht 2,4. Im Jahr 1996 wurde der erste menschliche Fötus geliefert, der mit Hilfe der runden Spermatideninjektion (ROSI) gezeugt wurde 5,6. Es ist erwähnenswert, dass Studien mit ICSI und ROSI an Mäusen hinter denen beim Menschen zurückblieben, da die Eizellmembran der Maus während des Injektionsprozesses anfällig für Schäden war. Dieses Problem wurde mit der Einführung der Piezo-Membranbrechvorrichtung erfolgreich gelöst. So wurde 1995 die erste Maus geboren, die mit der ROSI-Technologie gezeugt wurde. Darüber hinaus ist auch die Erforschung von ROSI bei verschiedenen anderen Tieren im Gange 7,8.

Derzeit konzentriert sich die Forschung zu ROSI hauptsächlich auf die folgenden Aspekte: klinische Anwendung, Aufklärung des Mechanismus und Strategien zur Steigerung der Entwicklungseffizienz sowie breitere Anwendungen der ROSI-Technologie. Im Rahmen der klinischen Anwendungen waren die Fortschritte trotz der Geburt des ersten menschlichen ROSI-Fötus durch ROSI im Jahr 1996 durch eine Reihe von Erfolgen und Misserfolgen gekennzeichnet 9,10,11,12. Bisher hat die ROSI-Technologie keine breite klinische Implementierung erreicht, was vor allem auf ihre geringe Effizienz und die Notwendigkeit einer weiteren Validierung der Sicherheit von Föten, die mit der ROSI-Technologie gezeugt wurden, zurückzuführen ist. Unvollständige Statistiken deuten darauf hin, dass weltweit weniger als 200 mit ROSI gezeugte menschliche Föten zur Welt gebracht wurden. Ein Wendepunkt im Verständnis des Potenzials der ROSI-Technologie erfolgte im Jahr 2015, als Tanaka und Kollegen über die erfolgreiche Geburt von 14 Föten durch die ROSI-Technologie berichteten und damit neues Vertrauen in ihre klinische Anwendung und Machbarkeit weckten13,14. Die ROSI-Technologie ist vielversprechend für die Bewältigung reproduktionsbiologischer Herausforderungen, insbesondere bei Patienten mit nicht-obstruktiver Azoospermie. Zusätzlich zu seinen klinischen Anwendungen dient ROSI als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der komplizierten Mechanismen der Embryonalentwicklung 15,16,17.

Zahlreiche Tierversuche wurden durchgeführt, um die zugrunde liegenden Faktoren zu untersuchen, die zu der geringen Effizienz von ROSI beim Erreichen einer vollständigen Embryonalentwicklung beitragen. Zu diesen Faktoren gehören die Wahl der Methoden der assistierten Eizellaktivierung (AOA) und deren Zeitpunkt, Anomalien in der genomischen Stabilität und insbesondere Anomalien bei epigenetischen Modifikationen. Es ist wichtig zu erkennen, dass runde Spermatiden unreife Keimzellen sind, die sich in verschiedenen physiologischen Aspekten deutlich von reifen Spermien unterscheiden. Mizuki Sakamoto und Kollegen wiesen darauf hin, dass H3K27me3, das aus runden Spermatiden gewonnen wird, mit Chromatin assoziiert ist, das weniger zugänglich ist und zu einer gestörten Genexpression in ROSI-Embryonen führt18. In einer verwandten Studie von Jing Wang und Kollegen waren Reprogrammierungsdefekte in ROSI-Embryonen im Vorkernstadium überwiegend mit der Fehlexpression einer Kohorte der Gene verbunden, die für die Aktivierung des kleinen zygotischen Genoms verantwortlich sind19. Sie fanden auch heraus, dass die Einführung eines selektiven euchromatischen Histon-Lysin-Methyltransferase-2-Hemmers, A366, die Gesamtentwicklungsrate möglicherweise um etwa das Doppelte erhöhen könnte.

Die Maus gilt als eines der wertvollsten Modelltiere für die Erforschung der Embryonalentwicklung. In diesem Artikel wird erläutert, wie ROSI bei Mäusen durchgeführt wird. Dieses umfassende Protokoll umfasst die Auswahl geeigneter Mäuse, detaillierte Verfahren zur Induktion des Eisprungs, AOA-Techniken, Injektionstechniken und die Vorbereitung von Leihmüttern. Darüber hinaus präsentieren wir eine vergleichende Analyse der Auswirkungen von zwei Injektionsschemata auf die Geburtseffizienz: AOA gefolgt von ROSI (A-ROSI; erstes Regime) und ROSI gefolgt von AOA (ROSI-A; zweites Schema). Unser Ziel ist es, Forscher zu ermutigen, ROSI-Experimente an Mäusen präziser durchzuführen und so ihre klinische Anwendung und die Grundlagenforschung zu den Mechanismen der embryonalen Entwicklung robuster zu unterstützen.

Protocol

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Die in diesem Experiment verwendeten Mäuse B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 und ICR wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Peking, China) gekauft. Alle Tierbehandlungen entsprachen den experimentellen Verfahren und Standards, die von der Ethikkommission für Versuchstiere des Ersten Krankenhauses der Universität Jilin (Zulassungsnummer: 20200435) genehmigt wurden.

1. Vorbereitung der relevanten Reagenzien

  1. Erwerben Sie einige Reagenzien kommerziell und bereiten Sie die restlichen Reagenzien selbst vor.
    1. Beziehen Sie M2, ein Puffersystem für die In-vitro-Verarbeitung von runden Spermatiden (RS), Spermien und Eizellen vom Lieferanten.
    2. Bereiten Sie das Ca2+-freie C.L. Chatot-, C.A. Ziomek- und B.D. Bavister (CZB)-Medium für die AOA gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll20 vor.
    3. Beziehen Sie das Kalium-Simplex-optimierte Medium, das mit Aminosäuren (KSOMaa) für die Embryokultur ergänzt ist, vom Lieferanten.
    4. Bereiten Sie Hyaluronidase mit einer Arbeitskonzentration von 0,1 % (1 g/l) vor, indem Sie 0,1 g Hyaluronidase in 1 ml Embryowasser auflösen. Nehmen Sie 10 μl konzentrierte Aufbewahrungslösung und lösen Sie sie in 990 ml M2 auf, die 1 Woche lang bei 4 °C gelagert werden könnten.
    5. Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 360.000 und einer Massenkonzentration von 12 % wird hergestellt, indem 1,2 g PVP in 10 ml M2 gelöst werden. Die resultierende Lösung kann 1 Woche lang bei 4 °C gelagert werden.
    6. Die in 18 μl DMSO lösliche Cytochalasin B (CB)-Stammlösung (2 μl) ist bei -20 °C zu lagern. Nehmen Sie 5 μl der konzentrierten Lagerlösung und lösen Sie sie in 995 ml M2 auf. Die resultierende Lösung kann 1 Woche lang bei 4 °C gelagert werden.

2. Vorbereitung der Eizellen

  1. Gewöhnen Sie weibliche B6D2F1-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen mindestens 1 Woche lang an ihre neue Umgebung. Injizieren Sie intraperitoneal um 17 Uhr 7,5 I.E. Serumgonadotropin (PMSG) der trächtigen Stute, gefolgt von 7,5 I.E. humanem Choriongonadotropin (HCG) 48 h später. Stellen Sie sicher, dass nach der Injektion kein Kontakt mit männlichen Mäusen stattfindet.
    HINWEIS: Die angegebene Uhrzeit (17 Uhr) ist nicht verpflichtend. Es dient nur der Bequemlichkeit der Arbeit. Die 14 Stunden nach 17 Uhr sind 7 Uhr morgens, wenn die Eizellen bereit sind und die Injektion durchgeführt wird, so dass die Injektionszeit auf den Morgen gelegt wird. Die Startzeit der Injektion kann entsprechend dem Tagesplan des Labors angepasst werden.
  2. Nach 14 Stunden HCG-Injektion euthanasieren Sie die Mäuse mit der Methode der zervikalen Luxation. Öffnen Sie die Bauchhöhle und lokalisieren Sie die Gebärmutter. Identifiziere die Eierstöcke entlang der Gebärmutter und durchtrenne die Eileiter in der Nähe der Eierstöcke mit einer Schere. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang auf der anderen Seite und legen Sie die Eileiter in M2, das zuvor auf 37 °C vorgewärmt wird.
  3. Lokalisieren Sie unter einem aufrechten Mikroskop (10x) den vergrößerten Teil des Eileiters, der ein transparentes und geschwollenes Aussehen zeigt. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um den Eileiter zu sichern, während Sie den vergrößerten Teil abschneiden und koronale Kumuluskomplexe (OCCCs) sammeln.
  4. OCCCs in die vorgewärmte M2-Betriebslösung mit 0,1 % Hyaluronidase geben und Granulosazellen durch vorsichtiges Durchblasen einer oralen Pipette entfernen.
    HINWEIS: Bewahren Sie die OCCCs bei Bedarf für einen kurzen Zeitraum von ca. 2 Minuten in 0,1 % Hyaluronidase auf.
  5. Nach der Entnahme der Granulosazellen die Eizelle in KSOMaa überführen, 3x spülen und zur späteren Verwendung in einen Kohlendioxid-Inkubator geben (37 °C, 5 % CO2).

3. Präparation von runden Spermatiden und Spermien

  1. Sammeln Sie runde Spermatiden und Spermien aus den Hoden und Nebenhoden männlicher C57BL/6-Mäuse (8-10 Wochen).
    1. Bei Spermien euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation. Öffnen Sie die Bauchhöhle, lokalisieren Sie den Nebenhoden in der Nähe des Hodens und entfernen Sie vorsichtig mit einer Schere.
    2. Legen Sie den Nebenhoden in M2 Medium und exzitieren Sie vorsichtig mit einer 1 ml-Spritze, damit die Spermien unter einem aufrechten Mikroskop (10x) ausfließen können.
    3. Saugen Sie die fließenden Spermien und die M2 -Suspension in den Boden eines Röhrchens mit 0,5 ml M2 ab, so dass die Spermien auf natürliche Weise stromaufwärts fließen können. Legen Sie sie für den späteren Gebrauch beiseite.
    4. Bei runden Spermatiden die Hoden aus der Bauchhöhle entfernen und in M2 legen. Schneiden Sie die weiße Membran vorsichtig mit einer 1 mL Spritze durch und drücken Sie die gewundenen Samenkanälchen unter einem aufrechten Mikroskop (10x) heraus.
    5. Die Samenkanälchen vorsichtig mit zwei 1-ml-Spritzen herausschneiden. Die Suspension extrahieren und mit einem 400-Mesh-Sieb (38 μm) filtrieren.
  2. Die filtrierten Zellen zentrifugieren, den Überstand verwerfen und 200 μl Hoechst 33342 zum Färben hinzufügen, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 37 °C.
  3. Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durch, um runde Spermatiden von anderen Zelltypen zu unterscheiden. Legen Sie die gefärbten Zellen in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen und führen Sie ein rundes Spermatiden-Screening durch.
    1. Verschiedene Modelle von Durchflusszytometrie-Geräten haben unterschiedliche regulatorische Parameter und können während des Betriebs mit technischem Support kommuniziert werden. Passen Sie im ersten Schritt die Spannung an und wählen Sie die Zellpopulation nach Vorwärtsstreuung (FSS) und Seitenstreuung (SSC; siehe Ergänzende Tabelle 1).
    2. Für den zweiten Schritt entfernen Sie Zelladhäsionen gemäß FSC und lösen die Pulsbreite aus.
    3. Wählen Sie im dritten Schritt die haploiden runden Zielspermatiden aus. Hoechst 33342 bindet an DNA, und Zellen mit unterschiedlicher Ploidie weisen unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten auf. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 355 ein. Wählen Sie zwei Detektionskanäle, 460/50 und 670/30, mit einem Laser mit einer Wellenlänge von 355, um runde Spermatiden zu sortieren. Lagern Sie anschließend die sortierten runden Spermatiden für die spätere Verwendung im 4 °C Kühlschrank.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, runde Spermatiden direkt auf der Grundlage ihrer Morphologie unter dem Mikroskop auszuwählen, aber es ist eine Schulung erforderlich, um die Selektionsgenauigkeit zu gewährleisten.

4. Runde Spermatiden-Injektion (ROSI)

  1. Führen Sie das ROSI-Verfahren mit einem inversen Mikroskop mit einem Mikromanipulationssystem durch.
  2. Im ersten Präparationsschritt werden Halte- und Injektionsnadeln gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren21 hergestellt. Halten Sie den Innendurchmesser der Injektionsnadel zwischen 6 und 7 μm, die für die Extraktion von runden Spermatiden ausgelegt ist, und für die Haltenadel einen Innendurchmesser von 20 μm zur Sicherung der Eizelle.
  3. Im nächsten Vorbereitungsschritt legen Sie ein Injektionsgefäß an, indem Sie 10 μl CB-haltige M 2-Tröpfchen zur Erweichung der Eizellen und 10 μl M2-Tröpfchen zur Aufbewahrung runder Spermatiden geben. Verwenden Sie PVP-Tröpfchen, um die Injektionsnadeln zu befeuchten und zu reinigen.
    HINWEIS: Die Zugabe von CB ist hier kein notwendiger Schritt, aber die Zugabe von CB kann die Überlebensrate nach der Injektion erheblich verbessern.
  4. Entnehmen Sie runde Spermatiden mit einer Injektionsnadel.
  5. Drehen Sie die Eizelle mit einer Haltenadel und positionieren Sie den Polkörper der Eizelle entweder in der 12-Uhr- oder 6-Uhr-Position.
  6. Platzieren Sie die Injektionsnadel vorsichtig in der 3-Uhr-Position auf der Eizelle und haften Sie fest an der Zona pellucida. Verwenden Sie ein PiezoXpert-Gerät, um ein Loch in die Zona pellucida zu erzeugen. Stellen Sie die Stärke von klein bis groß ein, was hier ungefähr Intensität = 5 und Geschwindigkeit = 15 ist.
  7. Schieben Sie die Injektionsnadel vorsichtig durch die Zona pellucida und führen Sie horizontal in die Eizelle ein. Wenn es das Zentrum der Eizelle passiert, wenden Sie einen Piezo (Intensität = 1 und Geschwindigkeit = 1) an, was zum Bruch der Eizellmembran und zur allmählichen Injektion der runden Spermatide in das Zytoplasma der Eizelle führt.
  8. Ziehen Sie die Injektionsnadel zurück und saugen Sie eine kleine Menge der Eizellmembran in der Nähe der Öffnung ab, um sie zu verschließen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da ein Versagen der Versiegelung zu zytoplasmatischem Austritt und zum Tod der Eizelle führen würde.
    HINWEIS: Es ist erwähnenswert, dass ROSI entweder vor oder nach der Injektion von runden Spermatiden eine AOA benötigte, die wir in den folgenden Abschnitten besprochen haben.

5. Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

  1. Führen Sie für ICSI die gleichen Schritte wie für ROSI durch, mit dem einzigen Unterschied im Durchmesser der ICSI-Injektionsnadel, der 9-10 μm misst.
  2. Platzieren Sie Spermien auf einer PVP-Landebahn, um ihre Schwimmgeschwindigkeit zu verringern und die Spermienextraktion zu erleichtern.
  3. Trennen Sie den Kopf und den Schwanz der Spermien für ICSI. Aspirieren Sie die Spermien aus dem Schwanz und positionieren Sie den Hals der Spermien genau an der Mündung der Injektionsnadel. Wenden Sie einen Piezo an (je nach Bedarf können mehrere Piezos verwendet werden, Intensität = 5 und Geschwindigkeit = 15), um Kopf und Schwanz der Spermien zu trennen.

6. Assistierte Eizellaktivierung (AOA)

  1. Bereiten Sie gemäß dem Protokoll ein CZB-Medium ohne Kalzium und Magnesium vor.
  2. Verwenden Sie Strontiumchlorid-Hexahydrat (SrCl26H2O) mit einem Molekulargewicht von 266,62 in einer Konzentration von 10 mM. Zur Herstellung lösen Sie 0,26662 g SrCl26H2O in 1 ml Embryowasser. Zum Zeitpunkt der Verwendung 10 μl konzentrierte Lagerlösung zu 990 μl Ca2+-freiem CZB-Medium geben und sofort verwenden.
  3. Legen Sie die Eizellen zur Aktivierung in das Ca2+-freie CZB-Medium, das SrCl26H2O enthält. Jedes Tröpfchen hat ein Volumen von 20 μl, und jedes Mal werden 20 Eizellen platziert. 20 Min. inkubieren.
  4. Gleichzeitig wird eine Gruppe für die Aktivierung der Parthenogenese gebildet, ohne runde Spermatiden oder Spermien zu injizieren. Es ist zu beachten, dass die Aktivierungsgruppe für die Parthenogenese ohne statistische Analyse dargestellt wird und die Kontrollgruppe ICSI ist.

7. Embryotransfer

  1. Beherbergen Sie die ligierten männlichen und weiblichen ICR-Mäuse in einem Verhältnis von 1:2. Am nächsten Morgen untersuchen Sie die weiblichen Mäuse auf das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens und wählen Sie diejenigen mit einem Vaginalpfropfen für die Transplantation aus.
  2. Injizieren Sie die übertragenen Embryonen, die aus 2-zelligen Embryonen bestehen, am Vormorgen und übertragen Sie sie am nächsten Nachmittag.
  3. Machen Sie einen Schnitt auf dem Rücken der weiblichen Maus, legen Sie das weiße Fett und die Eierstöcke frei und lokalisieren Sie den vergrößerten Teil des Eileiters unter einem aufrechten Mikroskop (10x).
  4. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um eine Öffnung im vergrößerten Teil des Eileiters zu schaffen, und aspirieren Sie die Embryonen durch eine orale Pipette. Führen Sie die Embryonen vorsichtig in Richtung Gebärmutter ein. Nähen Sie die Wunde mit 4 x 10 Modellen gebogener Nadeln mit Faden mit einer Dicke von 5-0 (0,09-0,11 mm). Die Naht wird in zwei Schichten hergestellt, mit einer Schicht für das Bauchfell und einer Schicht für die Außenhaut.
  5. Bei Leihmüttern führen Sie einen Kaiserschnitt auf der Grundlage des Versuchsplans durch. Euthanasieren Sie die Mäuse mit der Methode der Gebärmutterhalsluxation, desinfizieren Sie sie mit Alkohol und öffnen Sie die Bauchhöhle. Schneiden Sie vorsichtig und schnell die Gebärmutter auf und öffnen Sie die Fruchthöhle, um den Fötus und die Plazenta zu zeigen. Entfernen Sie die Nabelschnur und schneiden Sie von der Seite in der Nähe des Fötus ab. Der Fötus wurde von der gleichen Zeit gefüttert, in der Mäuse gestillt wurden.
    HINWEIS: Aufgrund der Notwendigkeit, die Geburtenraten zu berechnen, ist der Kaiserschnitt in Bezug auf die Produktionskapazität genauer. Bei der natürlichen Geburt kann es vorkommen, dass der Nachwuchs von der Mutter gefressen wird, was zu ungenauen Statistiken führt. Der Kaiserschnitt wird an Leihmäusen durchgeführt, die im Frühstadium transplantiert wurden, und der Euthanasie-Kaiserschnitt wird vor der Entbindung durchgeführt.

8. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie GraphPad Prism 5 zur Analyse. Die Daten werden in mittleren ± SD ausgedrückt; P < 0,05 deutet auf eine statistische Differenz hin, und P < 0,01 deutet auf eine signifikante statistische Differenz hin.

Results

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Wir begannen unsere Untersuchung mit der Untersuchung der Auswirkungen von AOA auf die Entwicklungsfähigkeit von Embryonen. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 1A dargestellt. Vor der Spermieninjektion wurden die Eizellen entweder einer AOA (A-ICSI) unterzogen oder blieben unbehandelt (ICSI). Detaillierte Daten zur Embryonalentwicklung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Spaltung, der Blastozyste oder der Geburtenrate zwischen der A-ICSI- und der ICSI-Gruppe (P > 0,05; Abbildung 1B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AOA mit 10 mM SrCl2 für 20 min das Entwicklungspotenzial der Embryonen nicht beeinflusste.

Zuvor wurde berichtet, dass es keine erkennbaren Unterschiede in der Entwicklungseffizienz von ROSI-Embryonen gab, die entweder durch FACS oder durch direkte visuelle Untersuchung unter einem Mikroskop ausgewählt wurden22. Unsere Experimente verwendeten die FACS-Technologie, um RS zu identifizieren (Abbildungen 2A, B). Unter dem Mikroskop hatten die runden Spermatiden der Maus einen Durchmesser von etwa 10 μm und wiesen in der Mitte eine protrusionsartige Nukleolusstruktur auf (Abbildung 2C). Wir gehen davon aus, dass die Selektion durch FACS genauer ist als die direkte visuelle Untersuchung unter dem Mikroskop. Darüber hinaus unterstützt die Literatur die direkte Erforschung von RS durch morphologische Unterschiede. ROSI-Embryonen wurden mit zwei unterschiedlichen Methoden erzeugt: der A-ROSI-Gruppe, bei der die Eizellen vor der runden Spermatideninjektion einer AOA unterzogen wurden, und der ROSI-A-Gruppe, bei der die Eizellen nach der runden Spermatideninjektion einer AOA unterzogen wurden. Das schematische Diagramm des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 1C dargestellt. Bemerkenswert ist, dass keine signifikanten Unterschiede in den Spaltungs- und Blastozystenraten zwischen den Gruppen A-ROSI, ROSI-A und ICSI gefunden wurden (P > 0,05; Abbildung 1D). Die Blastozystenraten der A-ROSI-, ROSI-A- und ICSI-Gruppen waren signifikant höher als die der Aktivierungsgruppe (P < 0,05; Abbildung 1D). Die Geburtenrate der ROSI-Gruppe war jedoch niedriger als die der ICSI-Gruppe, unabhängig davon, ob die Eizellen vor oder nach der Injektion aktiviert wurden (P < 0,05; Abbildung 1D). Wichtig ist, dass die Geburtenrate der A-ROSI-Gruppe etwas höher war als die der ROSI-A-Gruppe (Abbildung 1D). Weitere Einzelheiten zu den Daten zur Embryonalentwicklung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

figure-results-1
Abbildung 1: ROSI-Embryonen zeigten im Vergleich zu ICSI-Embryonen eine geringere Entwicklungseffizienz. (A) Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls zur Bewertung des Effekts der Aktivierung auf die ICSI-Embryonalentwicklung. Blau = Eizellen wurden nicht aktiviert; Gelb = Eizellen wurden aktiviert. (B) Entwicklungseffizienz von Embryonen aus A-ICSI und ICSI. (C) Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls zur Erzeugung verschiedener Arten von Embryonen. (D) Entwicklungseffizienz von Embryonen, die von A-ROSI, ROSI-A, A und ICSI abstammen. **, P < 0,01. Abkürzungen: A= Aktivierung E= Embryonaler Tag; ROSI = Runde Spermatiden-Injektion; ICSI = Intrazytoplasmatische Spermieninjektion. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Der Vergleich der Raten erfolgt mit Hilfe des Chi-Quadrat-Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Runde Spermatiden wurden mittels durchflusszytometrischer Sortierung selektiert. (A) Für die Selektion der runden Spermatiden wurde ein durchflusszytometrisches Sortierdiagramm verwendet. (B) Repräsentative Bilder, die die Auswahl runder Spermatiden zeigen. Maßstab: 10 μm. Abkürzungen: FSC = Forward scatter; SSC = seitliche Streuung; 355 ist die Anregungswellenlänge; 460/50 und 670/30 sind zwei Detektionskanäle unter einem Laser mit 355 Wellenlängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

GruppenEntwicklung vor der ImplantationEntwicklung nach der Implantation
RepliziertSpaltungsrate (%)Blastozystenrate (%)2-zellige Embryonen übertragen/ Nr. der EmpfängerGeburtenrate (%)
A-ICSI599.33 (149/150)75.17 (112/149)49/548.98 (24/49)
A-ROSI599.33 (149/150)73.83 (110/149)44/518.18 (8/44) **
ROSI-A598.00 (147/150)64.63 (95/147)45/513.33 (6/45) **
Aktivierung5100.00 (150/150)12.00 (18/150) **51/50.00 (0/51) **
ICSI (Englisch)598.00 (147/150)73.47 (108/147)46/552.17 (24/46)

Tabelle 1. Die Entwicklungseffizienz von Embryonen, die aus verschiedenen Gruppen stammen.

Ergänzende Tabelle 1. Der Anteil verschiedener Zellpopulationen, die mittels Durchflusszytometrie sortiert werden. Der P3-Teil besteht aus runden Spermatiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

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Assistierte Aktivierung der Eizelle
Eine kritische Voraussetzung für ROSI ist die AOA, da runde Spermatiden allein die Eizellaktivierung nicht initiieren können. Die derzeit etablierteste Methode bei Mäusen ist die Verwendung von Strontiumchlorid23,24, während die am weitesten fortgeschrittene Anwendung beim Menschen die elektrische Aktivierung verwendet13,14. Der Zeitpunkt der Aktivierung der Eizellen ist ebenfalls von großer Bedeutung. Wie in der Literatur berichtet, besteht der optimalste Aktivierungsansatz bei Mäusen darin, zunächst die Eizelle zu aktivieren und dann die runde Spermatide25 zu injizieren. Dies steht im Gegensatz zum herkömmlichen Befruchtungsprozess, bei dem zunächst Spermien in die Eizellen gelangen und anschließend Phospholipase C ζ freisetzen, um die Eizellezu aktivieren 26. Spezialisierte Forschungen, die von Satoshi Kishigami und Kollegen durchgeführt wurden, betonen die unterschiedliche Fähigkeit von ROSI, einen männlichen Zellkern in prä- oder postaktivierten Eizellen zu bilden. Um eine effiziente Nachkommenproduktion zu erreichen, müssen beide Injektionsarten durchgeführt werden, bevor die Eizellen in die G1-Phase25 gelangen.

Der Durchmesser der Injektionsnadel
Im Zusammenhang mit ROSI ist es wichtig zu beachten, dass ein größerer Durchmesser der Injektionsnadel nicht unbedingt zu besseren Ergebnissen führt. Die verwendete Injektionsnadel hat einen Durchmesser von 6-7 μm und ist damit etwas kleiner als eine runde Spermatide. Wenn also eine runde Spermatide aspiriert wird, wird die Zellmembran einem Quetscheffekt ausgesetzt, der möglicherweise zu einer direkten Freilegung des Zellkerns führt. Diese direkte Exposition kann der Depolymerisation und der anschließenden Bildung des männlichen Vorkernsförderlich sein 27.

Behandlung von Versiegelungen
Maus-Eizellen weisen im Vergleich zu anderen Spezies eine geringere zytoplasmatische Viskosität auf. Schon ein kleiner Riss in der Zellmembran kann dazu führen, dass das Zytoplasma leicht herausfließt, was zu einer Degeneration der Eizellen führt28. Um das Risiko zu mindern, ist es nach der Injektion der runden Spermatide in das Zytoplasma der Eizelle und dem Zurückziehen der Injektionsnadel zwingend erforderlich, einen kleinen Teil der Zellmembran in der Nähe der Öffnung der Eizellmembran zu aspirieren, um den Raum zu verschließen, ähnlich dem Verfahren bei ICSI21. Durch diesen Versiegelungsprozess wird das Risiko einer Eizelldegeneration deutlich reduziert.

Anwendung des ROSI als Modell
Über die klinische Anwendung hinaus hat die ROSI-Technologie verschiedene weitere Anwendungen als Vorbild. Es kann die Generationsrate von Mäusen beschleunigen29, die weibliche Letalität infolge einer väterlich vererbten Xist-Deletion bei Mäusenretten 17, Mäuse nach runder Spermatideninjektion in haploide parthenogenetische Zwei-Zell-Blastomere erzeugen15, transgene Mausnachkommenerzeugen 16 und die Fertilität bei jugendlichen Kindern vor der Krebsbehandlung bewahren30,31. Sorgfältige Forschung an der ROSI von Mäusen kann wesentlich zu Fortschritten in der Forschung im Bereich der reproduktiven Gesundheit beitragen.

Einschränkungen des Artikels
Dieser Artikel dient als methodischer Leitfaden mit mehreren Einschränkungen, einschließlich des Fehlens einer direkten vergleichenden Selektion von RS unter dem Mikroskop für die Injektion und eines wahrgenommenen Mangels an Innovation.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine finanziellen oder sonstigen Interessenkonflikte bestehen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Wenjie Zhao für ihre unschätzbare Hilfe bei der Sortierung runder Spermatiden durch Durchflusszytometrie und Fang Wang für ihre Expertise im Bereich des Embryotransfers von Mäusen. Diese Arbeit wurde teilweise von der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Jilin (Nr. YDZJ202301ZYTS461). Wir danken Bullet Edits Limited für das sprachliche Lektorat und Korrekturlesen des Manuskripts.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl22H2O SigmaC7902 Vorbereitung der CZB
Glukose SigmaG6152 Vorbereitung der CZB
HEPES-Na (basisch) SigmaH3784 Vorbereitung der CZB
Hoechst 33342Beyotime C1025FACS
humanes Choriongonadotropin (HCG)Ningbo Second Hormone CompanyHCGOvulation fördernde Medikamente
HyaluronidaseSigmaH3506Entfernung von Granulosazellen um die Eizelle
KCl SigmaP5405Vorbereitung von CZB
KH2PO4 SigmaP5655 Vorbereitung der CZB
KSOMaaCaisson LabsIVL04-100MLKalium-simplex-optimiertes Medium, ergänzt mit Aminosäuren
L-Glutamin SigmaG8540 Vorbereitung der CZB
M2SigmaM7167-50MLBetriebsmittel
MgSO47H2O SigmaM1880 Vorbereitung der CZB
Na2-EDTA2H2O SigmaE5134 Vorbereitung der CZB
NaCl SigmaS5886Vorbereitung von CZB
NaHCO3SigmaS5761 Vorbereitung der CZB
Na-Laktat 60% Sirup d = 1,32 g/LSigmaL7900 Vorbereitung der CZB
Na-pyruvat SigmaP4562 Vorbereitung der CZB
Piezo-Bohrspitzen (ICSI)Eppendorf piezoXpertPiezoelektrische Membranruptur
trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG)Ningbo Second Hormone CompanyPMSGOvulation fördernde Medikamente
PVA SigmaP8136Vorbereitung von CZB

References

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