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Methodenartikel

Optimierung der Epithelzellkultur der Maus-Primärlinse: Ein umfassender Leitfaden zur Trypsinisierung

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DOI:

10.3791/65912

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21. Juni 2024

 ,  , 
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript skizziert ein detailliertes Videoprotokoll für die Kultivierung von primären Linsenepithelzellen (LECs), das darauf abzielt, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Forschung bei Katarakten und hinterer Kapseltrübung (PCO) zu unterstützen. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Linsendissektion, LECs-Isolierung und Validierung und dient insbesondere für Neueinsteiger auf diesem Gebiet als wertvoller Leitfaden.

Zusammenfassung

Linsenepithelzellen (LECs) spielen mehrere wichtige Rollen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion der Linse. LECs bestimmen das Wachstum, die Entwicklung, die Größe und die Transparenz von Linsen. Umgekehrt können dysfunktionale LECs zur Kataraktbildung und zur Trübung der hinteren Kapsel (PCO) führen. Daher ist die Etablierung eines robusten primären LEC-Kultursystems für Forscher wichtig, die sich mit Linsenentwicklung, Biochemie, Katarakttherapeutika und PCO-Prävention befassen. Der Anbau von primären LECs stellt jedoch aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit, langsamen Proliferationsrate und empfindlichen Natur seit langem eine Herausforderung dar.

Diese Studie befasst sich mit diesen Hürden, indem sie ein umfassendes Protokoll für die primäre LEC-Kultur vorstellt. Das Protokoll umfasst wesentliche Schritte wie die Formulierung eines optimierten Nährmediums, die präzise Isolierung von Linsenkapseln, Trypsinisierungstechniken, Subkulturverfahren, Ernteprotokolle sowie Richtlinien für Lagerung und Versand. Während des gesamten Kulturprozesses wurde die Zellmorphologie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht.

Um die Authentizität der kultivierten LECs zu bestätigen, wurden Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt, um das Vorhandensein und die subzelluläre Verteilung kritischer Linsenproteine, nämlich αA- und γ-Kristalline, nachzuweisen. Dieses detaillierte Protokoll stattet Forscher mit einer wertvollen Ressource für die Kultivierung und Charakterisierung primärer LECs aus und ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der Linsenbiologie und der Entwicklung therapeutischer Strategien für linsenbedingte Erkrankungen.

Einleitung

Die Augenlinse spielt eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie das einfallende Licht auf die Netzhaut fokussiert. Es besteht aus einer transparenten, avaskulären Struktur, die aus spezialisierten Zellen besteht, unter denen Linsenepithelzellen (LECs) eine Schlüsselrolle spielen. LECs befinden sich an der vorderen Oberfläche der Linse und sind für die Aufrechterhaltung ihrer Transparenz, die Regulierung des Wasserhaushalts und die Teilnahme am Wachstum und der Entwicklung der Linseverantwortlich 1,2. LECs sind eine einzigartige Art von Zellen, die sich im vorderen Teil der Linse befinden und eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit und Funktion der Linse spielen, indem sie während des gesamten Lebens kontinuierlich Linsenfasern produzieren.

Katarakte sind durch eine fortschreitende Trübung der Linse gekennzeichnet, die zu einer Verzerrung und Streuung des Lichts führt, was zu einer Beeinträchtigung des Sehvermögens führt 3,4. Die genauen Mechanismen, die der Kataraktbildung zugrunde liegen, sind komplex und multifaktoriell und umfassen verschiedene zelluläre und molekulare Prozesse wie UV-Strahlung, oxidative Schäden und Glykation 5,6. Es wurde festgestellt, dass LECs erheblich zur Entwicklung von Katarakten beitragen, was sie zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt macht 1,2,7,8,9.

Darüber hinaus ist eines der drängendsten Probleme in der heutigen Augenheilkunde die relativ hohe Inzidenz der hinteren Kapseltrübung (PCO), auch bekannt als sekundärer Katarakt. PCO ist nach wie vor die häufigste Komplikation nach Kataraktoperationen und betrifft bis zu 20-40% der erwachsenen Patienten und 100% der Kinder innerhalb von 5 Jahren nach der Operation10. PCO wird hauptsächlich durch die verbleibenden LECs verursacht, die nach der Kataraktextraktion im Kapselsack verbleiben. Diese Zellen durchlaufen eine facettenreiche pathophysiologische Transformation, die nicht nur den Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT), sondern auch die Differenzierung von LECs zu Linsenfasern umfasst, was zu einer Zellpopulation führt, die eine Mischung aus LECs, Fasern und Myofibroblasten ist 11,12,13. Die transformierten Zellen vermehren sich und wandern durch die hintere Linsenkapsel, was zu Sehstörungen führt. Das Verständnis des Verhaltens und der Kontrollmechanismen von LECs in Kulturmodellen kann wertvolle Einblicke in die Prävention und das Management von PCO liefern. Daher stellt dieses Protokoll zur Kultivierung von LECs ein wichtiges Werkzeug für Augenforscher dar, die darauf abzielen, diese weit verbreitete postoperative Komplikation zu untersuchen, zu verstehen und letztendlich zu bekämpfen.

Um die Feinheiten der LEC-Biologie und ihre Rolle bei der Kataraktbildung und PCO zu entschlüsseln, ist es wichtig, robuste und reproduzierbare In-vitro-Primärzellkultursysteme zu etablieren. Die primäre LEC-Kultur bietet Forschern eine kontrollierte Umgebung, um die Funktionen, Signalwege und molekularen Eigenschaften von LECs zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung zellulärer Prozesse und der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen und liefert wertvolle Einblicke in die Linsenphysiologie und -pathologie.

Frühere Forschungen haben unser Verständnis der LEC-Kulturtechniken bereichert 14,15,16,17,18,19,20. Obwohl diese Studien verschiedene Methoden angewendet und signifikante Erkenntnisse über das Verhalten und die Eigenschaften von LECs geliefert haben, fehlt in der aktuellen Literatur ein umfassendes und zugängliches Videoaufzeichnungsprotokoll für die Kultivierung von LECs. Diese Einschränkung kann die Fähigkeit von Anfängern behindern, die Techniken genau zu reproduzieren, und kann zu Inkonsistenzen und Abweichungen in den experimentellen Ergebnissen führen. Durch die Bereitstellung eines Videoaufzeichnungsprotokolls zielt diese Forschungsarbeit darauf ab, diese Lücke zu schließen und eine standardisierte Ressource bereitzustellen, die die Reproduzierbarkeit verbessern und den Wissenstransfer im Bereich der LEC-Kultur erleichtern kann.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Die Verfahrensgenehmigung wurde vom Animal Care and Use Committee des Health Science Center der University of North Texas erteilt (Protokollnummer: IACUC-2022-0008). In diesen Studien wurden junge C57BL/6J-Mäuse verwendet, die in der Regel unter 2 Wochen alt waren.

1. Nährmediumvorbereitung und Linsendissektion

  1. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie 50 ml fötales Kälberserum (FBS) und 0,1 ml 50 mg/ml Gentamicin zu 450 ml DMEM hinzufügen.
  2. C57BL/6J-Mäuse, die jünger als 2 Wochen sind, human einschläfern.
    HINWEIS: Wir euthanasierten mit der CO2 - Inhalationsmethode. Eine optimale Durchflussrate für CO2 -Euthanasiesysteme sollte 30 % bis 70 % des Kammer- oder Käfigvolumens/min verdrängen.
  3. Entfernen Sie die Augenlider vorsichtig mit einer chirurgischen Schere und üben Sie mit einer gebogenen Pinzette leichten Druck auf gegenüberliegende Seiten der Augenhöhle aus, wodurch das Auge nach außen ragt. Machen Sie mit dem Kataraktmesser einen vorsichtigen Schnitt in der Hornhaut und ziehen Sie die Linse vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette heraus, um sicherzustellen, dass die Linse oder ihre Kapsel nicht beschädigt werden.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie diese Schritte ausführen, um die Integrität der Objektivkapsel zu erhalten. Aufgrund der empfindlichen Beschaffenheit der Linse ist es wichtig, Präparierwerkzeuge mit gebogenen und stumpfen Spitzen zu verwenden, um das Risiko einer Linsenbeschädigung zu minimieren.
  4. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette mit stumpfen Spitzen, um die Linsen in eine 60-mm-Kunststoff-Gewebekulturschale zu geben, die mit 5 ml vorgewärmter und steriler Dulbecco-Lösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gefüllt ist, die 10 μg/ml Gentamicin enthält.
  5. Spülen Sie die Linsen vorsichtig mit DPBS-Lösung mit 10 μg/ml Gentamicin ab, um mögliche Ablagerungen oder Verunreinigungen zu entfernen, die Linsen für die weitere Verarbeitung vorzubereiten und eine sterile Kulturumgebung aufrechtzuerhalten.
  6. Um eine ausreichende Anzahl von LECs zu erhalten, werden vier Linsen für eine 24-Well-Kulturplatte und sechs Linsen für eine 6-Well-Kulturplatte gepoolt.

2. Isolierung von LECs

  1. Legen Sie die Linse nach Abschluss des Spülvorgangs auf ein Stück Filterpapier und lassen Sie sie trocknen.
  2. Sobald die Linse ausreichend trocken ist, legen Sie sie vorsichtig auf die Abdeckung einer Petrischale, um die Entfernung der Linsenkapsel vorzubereiten.
  3. Drehen Sie die Linse nach oben und stellen Sie sicher, dass der vordere Augenabschnitt nach oben zeigt. Während Sie die vordere Kapsel mit der Pinzette halten, verwenden Sie die Kapselzange in der dominanten Hand, um einen kleinen Riss in der Kapsel zu erzeugen. Ziehen Sie die beiden Werkzeuge vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen, um die Kapsel zu entfernen, und legen Sie sie in DPBS, bis alle Linsendissektionen abgeschlossen sind.
    HINWEIS: Um Unstimmigkeiten zu vermeiden, sollten Forscher jede Linsenepithelkapsel umgehend sezieren und vorübergehend in DPBS lagern. Erst nach Abschluss aller Dissektionen werden die Kapseln kollektiv auf Trypsin überführt, das bei 37 °C gehalten wird, um eine synchronisierte und gleichmäßige Exposition zu gewährleisten.
  4. Übertragen Sie die Linsenkapsel vorsichtig auf eine 6-Well-Platte. Geben Sie 1 ml 0,05%ige Trypsinlösung in jede Vertiefung, um den enzymatischen Verdauungsprozess einzuleiten.
  5. Rühren Sie die Trypsinlösung vorsichtig um, um eine gleichmäßige Permeation zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Kapsel 8-10 min bei 37 °C verdauen.
    HINWEIS: Dieser Schritt erleichtert den Abbau des Linsenkapselgewebes und die anschließende Freisetzung einzelner Epithelzellen.
  6. Nach der Inkubation die verdaute Linsenkapsel vorsichtig mit einer Präparierschere zerkleinern, um verbleibende Gewebeklumpen aufzubrechen und die Zelltrennung zu fördern.
    HINWEIS: Die Gründlichkeit beim Zerkleinern des Gewebes wird betont, um eine effiziente Zellfreisetzung aus den verdauten Linsenkapseln zu gewährleisten.
  7. Fügen Sie 0,5 ml des Kulturmediums mit 10 % FBS hinzu, um das Trypsin abzuschrecken. Geben Sie die Gewebeproben in ein Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 5 min.
  8. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Verwenden Sie 1 ml Kulturmedium, um die Zellen zu resuspendieren und die Zellen in einer 24-Well-Platte zu säen.
  9. Wechseln Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage.

3. LECs-Subkultur

  1. Sobald die Zellen zusammenfließen, entfernen Sie das Medium aus der Kulturschale. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml DPBS.
  2. Fügen Sie 200 μl Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und legen Sie die Zellen für 5 Minuten in den Inkubator.
  3. Nehmen Sie die Zellen nach der Inkubation aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich von der Kulturschale gelöst haben und zu schwimmen beginnen.
  4. Fügen Sie 1 ml Kulturmedium hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 3-5x, um alle Zellen zu lösen.
  5. Die Zellen in Zentrifugenröhrchen umfüllen und bei 1.000 × g 5 min zentrifugieren.
  6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im vollständigen Wachstumsmedium.
  7. Zählen Sie bei Bedarf die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
  8. Unterteilen Sie die Zellsuspension im Verhältnis 1:2 oder 1:3 für Subkulturzwecke.
  9. Wenn die Kultur wieder zusammenfließt, wiederholen Sie die oben genannten Verfahren.
    HINWEIS: LECs gedeihen unter Kulturbedingungen mit hoher Dichte. Vermeiden Sie es, die Zellen übermäßig zu verdünnen, da dies ihr Wachstum behindern kann.

4. Lagerung und Versand

HINWEIS: Die ideale Zellennummer für die Speicherung ist ~1 × 106.

  1. Waschen Sie die Zellen 3x gründlich mit 1 ml DPBS. Nach dem Waschen 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und die Zellen für 5 Minuten in den Inkubator legen.
  2. Fügen Sie 2 ml vollständiges Kulturmedium hinzu und geben Sie die Zellsuspension in das Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 1.000 × g .
  3. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in einem Gefriermedium aus 90 % FBS und 10 % DMSO resuspendiert, wobei eine Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml angestrebt wird. Übertragen Sie die Zellsuspension in das Kryofläschchen.
  4. Bringen Sie die Zellen sofort für 1 h in eine Umgebung von -20 °C, gefolgt von -80 °C über Nacht, bevor Sie sie dauerhaft in flüssigem Stickstoff lagern.
    HINWEIS: Wenn kein flüssiger Stickstoff verfügbar ist, können die Zellen nach einer ersten Stunde bei -20 °C bei -80 °C gelagert werden.
  5. Wenn eine Sendung erforderlich ist, versenden Sie die Zellen im Kryofläschchen in einem Paket mit Trockeneis für die Lieferung über Nacht.
  6. Stellen Sie nach Erhalt der Zellen eine schnelle Genesung sicher und legen Sie die Zellen in die Subkultur. Wenn eine sofortige Kultur nicht möglich ist, übertragen Sie die Zellen zur längeren Lagerung in flüssigen Stickstoff.
    HINWEIS: Wenn die Zellen versendet werden sollen, stellen Sie sicher, dass die Proben tief im Trockeneis vergraben sind, um mögliche Schäden durch Temperaturschwankungen zu vermeiden.

5. LECs-Validierung

  1. LECs in 35-mm-Kulturschalen mit abgedeckten Gläsern anrichten und ca. 48 h kultivieren.
  2. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS und fixieren Sie die Zellen mit kaltem Methanol für 10 min bei -20 °C.
  3. Waschen Sie die fixierten Zellen 3 x 5 min lang mit PBS und inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.
  4. Nach der Blockierung werden die Zellen über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei die Primärantikörper (αA-Kristallin-, γ-Kristallin- und PROX1-Antikörper) einzeln im Verhältnis 1:50 in Verdünnungspuffer verdünnt werden.
  5. Waschen Sie die Zellen 3 x 5 min lang mit PBS und inkubieren Sie die Zellen mit dem 1:100 in Verdünnungspuffer verdünnten Sekundärantikörper 1 h lang.
  6. Waschen Sie die Zellen 3 x 5 min mit PBS und färben Sie die Zellen mit 5 μg/mL Hoechst 33342 in PBS für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellkerne sichtbar zu machen.
  7. Waschen Sie die Zellen 2 x 5 Minuten lang mit PBS, um überschüssige Färbelösung zu entfernen, und nehmen Sie Fluoreszenzbilder der Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des DAPI-Kanals für Zellkerne und des FITC-Kanals für αA-, γ-Kristalline und PROX1 auf.

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Ergebnisse

Wie in Abbildung 2 gezeigt, hafteten die primären LECs von C57BL/6J-Mäusen innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden an den Schüsseln. Insbesondere gab es sichtbare Überreste anderer Gewebe wie Abschnitte der hinteren Kapsel und Linsenfaserzellen. Diese unbeabsichtigten Elemente hafteten jedoch nicht an der Schale und konnten daher durch einen Wechsel des Nährmediums entfernt werden. Anschließend, zwischen dem dritten und fünften Tag, leiteten die LECs ihre Proliferationsphase ein. Zwischen de...

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Diskussion

Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung für die erfolgreiche Isolierung, Kultur und Subkultur von primären LECs, komplett mit begleitender Videodokumentation. Der detaillierte visuelle Leitfaden neben den schriftlichen Anweisungen verbessert die Klarheit und Zugänglichkeit des Protokolls und fördert seine Verwendung und Reproduzierbarkeit bei Forschern auf diesem Gebiet. Das ultimative Ziel ist es, zum wachsenden Wissen über die Rolle von LECs bei der Kataraktbil...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von NEI R21EY033941 (an Hongli Wu); W81XWH2010896 des Verteidigungsministeriums (an Hongli Wu); R15GM123463-02 (für Kayla Green und Hongli Wu)

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054Für die Dissoziation von LECs
Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper Jackson ImmunoResearch#715-545-150Für die Zellvalidierung
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003Für die Zellvalidierung
AntikörperverdünnungspufferLicor#927-60001Für die Zellvalidierung
Biber-SicherheitsmesserBeaver-Visitec International#3782235Für die Linsendissektion
BlockierungspufferLicor#927-60001Für die Zellvalidierung
Capsulorhexis PinzetteTitan Medical InstrumentsTMF-124Für die Isolierung von Linsenkapseln
DMEMSigma AldrichD6429Für LECs Kulturmedium
DMSOSigma Aldrich#D2650Für die Herstellung von Einfriermedium 
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Thermo Fisher#J67802Für die Linsendissektion
Dumont PinzetteRoboz Chirurgisches InstrumentRS-4976Für die Isolierung von Linsenkapseln
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182Für LECs Kulturmedium
FBSSigma AldrichF2442Für LECs Kulturmedium
Gentamicin (50  mg/mL)Sigma-AldrichG1397Für LECs Kulturmedium
Hoechst 33342 LösungThermo Fisher#62249Für die Zellvalidierung
Mikro-PräparierschereRoboz Chirurgisches Instrument RS-5983Für die Linsendissektion
MikrodisparierpinzetteRoboz Chirurgisches Instrument RS5137 Für die Linsendissektion
PROX1 AntikörperThermo Fisher11067-2-APFür die Zellvalidierung
Vannas MikropräparierfederschereRoboz Chirurgisches InstrumentRS-5608Für die Isolierung von Linsenkapseln
α A-Kristallin-AntikörperSanta Cruzsc-28306Für die Zellvalidierung 
γ-kristalliner AntikörperSanta Cruzsc-365256Für die Zellvalidierung

Referenzen

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