Dieses Manuskript skizziert ein detailliertes Videoprotokoll für die Kultivierung von primären Linsenepithelzellen (LECs), das darauf abzielt, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Forschung bei Katarakten und hinterer Kapseltrübung (PCO) zu unterstützen. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Linsendissektion, LECs-Isolierung und Validierung und dient insbesondere für Neueinsteiger auf diesem Gebiet als wertvoller Leitfaden.
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Methodenartikel
Optimierung der Epithelzellkultur der Maus-Primärlinse: Ein umfassender Leitfaden zur Trypsinisierung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Linsenepithelzellen (LECs) spielen mehrere wichtige Rollen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und der normalen Funktion der Linse. LECs bestimmen das Wachstum, die Entwicklung, die Größe und die Transparenz von Linsen. Umgekehrt können dysfunktionale LECs zur Kataraktbildung und zur Trübung der hinteren Kapsel (PCO) führen. Daher ist die Etablierung eines robusten primären LEC-Kultursystems für Forscher wichtig, die sich mit Linsenentwicklung, Biochemie, Katarakttherapeutika und PCO-Prävention befassen. Der Anbau von primären LECs stellt jedoch aufgrund ihrer begrenzten Verfügbarkeit, langsamen Proliferationsrate und empfindlichen Natur seit langem eine Herausforderung dar.
Diese Studie befasst sich mit diesen Hürden, indem sie ein umfassendes Protokoll für die primäre LEC-Kultur vorstellt. Das Protokoll umfasst wesentliche Schritte wie die Formulierung eines optimierten Nährmediums, die präzise Isolierung von Linsenkapseln, Trypsinisierungstechniken, Subkulturverfahren, Ernteprotokolle sowie Richtlinien für Lagerung und Versand. Während des gesamten Kulturprozesses wurde die Zellmorphologie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie überwacht.
Um die Authentizität der kultivierten LECs zu bestätigen, wurden Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt, um das Vorhandensein und die subzelluläre Verteilung kritischer Linsenproteine, nämlich αA- und γ-Kristalline, nachzuweisen. Dieses detaillierte Protokoll stattet Forscher mit einer wertvollen Ressource für die Kultivierung und Charakterisierung primärer LECs aus und ermöglicht Fortschritte in unserem Verständnis der Linsenbiologie und der Entwicklung therapeutischer Strategien für linsenbedingte Erkrankungen.
Einleitung
Die Augenlinse spielt eine entscheidende Rolle beim Sehen, indem sie das einfallende Licht auf die Netzhaut fokussiert. Es besteht aus einer transparenten, avaskulären Struktur, die aus spezialisierten Zellen besteht, unter denen Linsenepithelzellen (LECs) eine Schlüsselrolle spielen. LECs befinden sich an der vorderen Oberfläche der Linse und sind für die Aufrechterhaltung ihrer Transparenz, die Regulierung des Wasserhaushalts und die Teilnahme am Wachstum und der Entwicklung der Linseverantwortlich 1,2. LECs sind eine einzigartige Art von Zellen, die sich im vorderen Teil der Linse befinden und eine entschei....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Die Verfahrensgenehmigung wurde vom Animal Care and Use Committee des Health Science Center der University of North Texas erteilt (Protokollnummer: IACUC-2022-0008). In diesen Studien wurden junge C57BL/6J-Mäuse verwendet, die in der Regel unter 2 Wochen alt waren.
1. Nährmediumvorbereitung und Linsendissektion
- Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie 50 ml fötales Kälberserum (FBS) und 0,1 ml 50 mg/ml Gentamicin zu 4....
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Ergebnisse
Wie in Abbildung 2 gezeigt, hafteten die primären LECs von C57BL/6J-Mäusen innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden an den Schüsseln. Insbesondere gab es sichtbare Überreste anderer Gewebe wie Abschnitte der hinteren Kapsel und Linsenfaserzellen. Diese unbeabsichtigten Elemente hafteten jedoch nicht an der Schale und konnten daher durch einen Wechsel des Nährmediums entfernt werden. Anschließend, zwischen dem dritten und fünften Tag, leiteten die LECs ihre Proliferationsphase ein. Zwischen de.......
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Diskussion
Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung für die erfolgreiche Isolierung, Kultur und Subkultur von primären LECs, komplett mit begleitender Videodokumentation. Der detaillierte visuelle Leitfaden neben den schriftlichen Anweisungen verbessert die Klarheit und Zugänglichkeit des Protokolls und fördert seine Verwendung und Reproduzierbarkeit bei Forschern auf diesem Gebiet. Das ultimative Ziel ist es, zum wachsenden Wissen über die Rolle von LECs bei der Kataraktbil.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von NEI R21EY033941 (an Hongli Wu); W81XWH2010896 des Verteidigungsministeriums (an Hongli Wu); R15GM123463-02 (für Kayla Green und Hongli Wu)
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | Für die Dissoziation von LECs |
| Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | Für die Zellvalidierung |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | Für die Zellvalidierung |
| Antikörperverdünnungspuffer | Licor | #927-60001 | Für die Zellvalidierung |
| Biber-Sicherheitsmesser | Beaver-Visitec International | #3782235 | Für die Linsendissektion |
| Blockierungspuffer | Licor | #927-60001 | Für die Zellvalidierung |
| Capsulorhexis Pinzette | Titan Medical Instruments | TMF-124 | Für die Isolierung von Linsenkapseln |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | Für LECs Kulturmedium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | Für die Herstellung von Einfriermedium |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Thermo Fisher | #J67802 | Für die Linsendissektion |
| Dumont Pinzette | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-4976 | Für die Isolierung von Linsenkapseln |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | Für LECs Kulturmedium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Für LECs Kulturmedium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | Für LECs Kulturmedium |
| Hoechst 33342 Lösung | Thermo Fisher | #62249 | Für die Zellvalidierung |
| Mikro-Präparierschere | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5983 | Für die Linsendissektion |
| Mikrodisparierpinzette | Roboz Chirurgisches Instrument | RS5137 | Für die Linsendissektion |
| PROX1 Antikörper | Thermo Fisher | 11067-2-AP | Für die Zellvalidierung |
| Vannas Mikropräparierfederschere | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5608 | Für die Isolierung von Linsenkapseln |
| α A-Kristallin-Antikörper | Santa Cruz | sc-28306 | Für die Zellvalidierung |
| γ-kristalliner Antikörper | Santa Cruz | sc-365256 | Für die Zellvalidierung |
Referenzen
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cel....
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Nachdrucke und Genehmigungen
