Der Active Place Avoidance (APA) Test, eine effektive, vielseitige und wiederholbare räumliche Lernaufgabe für Mäuse

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für den aktiven Ortsvermeidungstest vor, ein Hippocampus-abhängiges räumliches Lernparadigma, das für Nagetiere entwickelt wurde. Die Änderung wichtiger Parameter ermöglicht es, Tiere vor und nach der Behandlung oder im Laufe der Zeit erneut zu testen.

Abstract

Das Hippocampus-abhängige räumliche Lernen bei Nagetieren wurde mit einer Vielzahl von Methoden getestet. Dazu gehören das Morris-Wasserlabyrinth (MWM), das Y-Labyrinth und die NOL-Aufgaben (Novel Object Location). In jüngerer Zeit wurde die aktive Ortsvermeidung (APA) als Alternative zu diesen traditionelleren Ansätzen entwickelt. In der APA-Aufgabe müssen Mäuse räumliche Hinweise verwenden, die um eine rotierende Arena herum platziert sind, um eine stationäre Schockzone zu vermeiden. Aufgrund der vielfältigen Parameter, die angepasst werden können, hat sich gezeigt, dass die APA-Aufgabe ein sehr vielseitiger Ansatz ist. Es eignet sich für die Verwendung im Längsschnitt und wiederholt für dieselbe Kohorte von Mäusen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die APA-Aufgabe erfolgreich durchzuführen. Wir beleuchten auch alternative APA-Ansätze, mit denen verschiedene Komponenten des räumlichen Lernens untersucht werden können. Wir beschreiben die Prozesse der Datenerhebung und -analyse. Kritische Schritte während der APA-Aufgabe werden besprochen, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Durchführung des Tests zu erhöhen. Die APA-Aufgabe hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tests der räumlichen Navigation. Es ist geeignet für die Anwendung bei gealterten Mäusen oder Mäusen mit Krankheitsphänotypen wie der Alzheimer-Krankheit. Die Komplexität der Aufgabe kann leicht verändert werden, so dass eine breite Palette von Mausstämmen getestet werden kann. Darüber hinaus eignet sich die APA-Aufgabe für die Untersuchung von Tieren, die sich einer Operation oder experimentellen Eingriffen unterzogen haben, die die motorische oder neuronale Funktion beeinträchtigt haben könnten, wie z. B. Schlaganfall oder traumatische Hirnverletzung.

Introduction

Die aktive Ortsvermeidung (APA) ist ein wirksames Instrument, um das Hippocampus-abhängige räumliche Lernen bei Nagetieren zu testen 1,2,3,4. Während der APA-Aufgabe wird das Tier auf eine rotierende Arena gesetzt und muss visuelle Hinweise verwenden, um sich zu orientieren und eine aversive Schockzone⁵ zu vermeiden. Die Drehung der Arena stellt sicher, dass die Maus weder einen idiothetischen Ansatz für die Navigation verwenden kann, noch können Duftmarken verwendet werden, da sich diese Hinweise auf der Plattform drehen, während die Schockzone stationär bleibt⁵. Die Änderung der Geschwindigkeit und Richtung der Arena sowie der Position der Schockzone und der visuellen Hinweise ermöglicht es, Mäuse mehrmals zu testen ^6,7,8. Der APA bietet mehrere deutliche Vorteile im Vergleich zum Morris-Wasserlabyrinth (MWM), einem der am weitesten verbreiteten räumlichen Lerntests. Wichtig ist, dass Mäuse eine Abneigung gegen das Schwimmen haben und die MWM-Aufgabe als extrem stressig empfinden⁹. Darüber hinaus wurde berichtet, dass gealterte Mäuse während der MWM-Aufgabe¹⁰ schweben, was sie in vielen Fällen als räumliche Lernaufgabe ungeeignet macht. Darüber hinaus erfordert die MWM-Aufgabe eine versteckte, untergetauchte Plattform, die die Mäuse während des Tests lokalisieren können. Dies erfordert, dass das Wasser undurchsichtig ist, was typischerweise durch die Zugabe von weißer Farbe erreicht wird. Die Verfolgung und Analyse von Tieren während verhaltensbezogener Aufgaben erfordert einen ausreichenden Kontrast zwischen Probanden und Umgebung, wobei bestimmte Mausstämme wie Swiss oder BALB/c von der Prüfung im MWM ausgeschlossen werden. In der APA-Aufgabe wird dieses Problem durch die Zugabe von schwarzem Kunststoff unter dem Gitter umgangen.

Mehrere APA-Paradigmen wurden entwickelt, um räumliches Lernen zu testen und seine Nützlichkeit als effektives Verhaltenswerkzeug zu demonstrieren. Zum Beispiel wird der Erwerb, die Beibehaltung und die Konsolidierung des räumlichen Lernens typischerweise durch tägliche Tests an Tieren erreicht, die zwischen 3 und 5 Tagen liegen können 6,7,11,12. Gedächtnis und Lernen werden quantifiziert, indem die Anzahl der an jedem Erfassungstag erhaltenen Schocks verglichen wird. Die Zeit bis zum ersten Eintritt und die maximale Zeit, in der die Schockzone umgangen wird, sind ebenfalls wichtige Parameter, anhand derer Veränderungen der Lernfähigkeit während der Aufgabe festgestellt werden können. Alternativ kann das räumliche Arbeitsgedächtnis getestet werden, indem eine einzelne 30-minütige APA-Sitzung ^2,13 durchgeführt wird, in der das räumliche Lernen gemessen wird, da sich die Leistung innerhalb der Sitzung ändert, indem die Leistung, wie z. B. die Schockzahl, in 5-Minuten-Bins verglichen wird.

In diesem Artikel beschreiben wir die APA-Aufgabe und heben die wichtigsten Merkmale hervor, die bei der Durchführung dieses räumlichen Lerntests berücksichtigt werden müssen.

Protocol

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Tierethikkommission der University of Queensland gemäß den Richtlinien des National Health and Medical Research Council of Australia genehmigt (Zulassungsnummer: QBI/189/15).

1. Einrichtung des APA-Raums

HINWEIS: Das APA-Gerät besteht aus einer erhöhten Arena mit einem Metallgitterboden, der von einer 32 cm hohen transparenten kreisförmigen Begrenzung umgeben ist. Die Metallstangen haben einen gleichmäßigen Abstand (0,5 cm Abstand) und einen Durchmesser von 0,3 cm.

1. Stellen Sie sicher, dass sich das APA-Gerät innerhalb des an der Decke montierten Kamerarahmens befindet. Verfolgen Sie die Maus mit handelsüblicher Tierverfolgungssoftware.
2. Die APA-Arena dreht sich in der Regel mit einer Geschwindigkeit von 1 U/min, und innerhalb der rotierenden Arena befindet sich eine vorher festgelegte stationäre Schockzone von 60°. Wenn die Maus in die Schockzone eintritt, erzeugen Sie einen leichten Fußstoß von 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
3. Stellen Sie sicher, dass die Position der Schockzone während der Prüfung konstant bleibt und innerhalb des Versuchsaufbaus elektronisch eingestellt wird. Die rotierende Arena trägt die Maus in die Schockzone, es sei denn, die Maus bewegt sich aktiv, um ihr auszuweichen.
4. Platzieren Sie vier neuartige visuelle Hinweise an vier verschiedenen Raumwänden auf der gleichen Höhe wie die rotierende Plattform, typischerweise 30-50 cm von der Arena entfernt. Stellen Sie sicher, dass die Hinweise in neutralen Farben gehalten sind, z. B. Schwarz-Weiß-Symbole oder Formen, die auf A3-Papier gedruckt und für eine einfache Reinigung laminiert sind (Abbildung 1A).
5. Stellen Sie sicher, dass die Lichtintensität des Raumes zwischen 30 und 70 Lux liegt. Eine Erhöhung der Lichtintensität führt zu angstähnlichem Verhalten und reduziert die Erkundung.
6. Bevor Sie beginnen, öffnen Sie das Tracker-Programm und wählen Sie die APA-Aufgabe aus.
7. Wählen Sie in den Optionen für Tracker 2D die Registerkarte Experiment aus. Stellen Sie hier sicher, dass die Option Ortsvermeidung - Ein Frame - Nur Position ausgewählt ist. Auf diese Weise können Sie die erforderlichen Parameter konfigurieren. Speichern Sie die Konfigurationsdatei und passen Sie sie nach Bedarf an.
8. Legen Sie auf der Registerkarte Experiment die Dauer des Experiments im Feld Experimentzeit fest. Eine typische Versuchsdauer beträgt 600 s oder 10 min.
9. Stellen Sie sicher, dass die Option Timer aktivieren ausgewählt ist. Ändern Sie die Schockparameter im Timer-Bereich wie oben beschrieben.
10. Geben Sie die allgemeinen experimentellen Details in das Feld ein, das im Bereich Raumrahmen der Registerkarte Experiment angezeigt wird. Stellen Sie z. B. sicher, dass der Name der Standardausgabedatei mit dem Datum, einem einfachen experimentellen Bezeichner und dem Tag des Tests gefüllt ist. Beenden Sie den Namen mit einem Unterstrich "_", um das Hinzufügen einer eindeutigen Maus-ID während des Experiments zu ermöglichen.
11. Im Bereich Raumrahmen befindet sich auch die Registerkarte Ziele . Klicken Sie auf die Schaltfläche Bearbeiten , um sicherzustellen, dass die gesamte Arena im Interessenbereich enthalten ist. Wählen Sie dann Bogen aus, um die einstellbaren Parameter für die Größe und Position der Schockzielzone bereitzustellen (Abbildung 1B).
12. Öffnen Sie die Registerkarte Tracking , um die Parameter anzupassen und ein erfolgreiches Tracking der Mäuse zu gewährleisten. Das Kontrastfeld verfügt über die Optionen "Dunkel" oder "Hell", um sowohl dunkle (z. B. C57Bl/6) als auch helle (z. B. BALB/c) Mäuse zu berücksichtigen. Dadurch entsteht ein wirkungsvoller Kontrast zwischen dem Hintergrund und den Mäusen. Wenn Sie Albino-Stämme von Mäusen verwenden, legen Sie ein Stück schwarzen Kunststoff unter die Arena, um diesen Kontrast zu erzielen (Abbildung 2).
13. Legen Sie die Größen- und Bereichsbereiche der Mäuse in diesem Bereich fest. Stellen Sie diese Parameter so ein, dass die Maus in der Arena effektiv erkannt wird. Alternativ können Sie diese einstellen, nachdem Sie die Taste Vom Kalibrator gedrückt haben.
14. Wählen Sie die Schaltfläche Aus Kalibrator , um sicherzustellen, dass sich die Arena vollständig in der Maske für den Interessenbereich befindet.
    1. Starte die Arena in diesem Tab, um sicherzustellen, dass die Arena in der Maske bleibt, wenn sie sich dreht. Diese Registerkarte ist auch wichtig, um den geeigneten Kontrastschwellenwert auszuwählen. Verschieben Sie die rote Linie im Bereich Schwellenwert , um den Kontrastschwellenwert anzupassen.
       HINWEIS: Abbildung 3A zeigt eine optimale Schwellenwertauswahl, die durch einen durchgehend orangefarbenen Bereich und ein blaues "X" an der Stelle, an der sich die Maus befindet, dargestellt wird. In Abbildung 3B ist ein schlechter Schwellenwert dargestellt, der nur orange gesprenkelt und kein "X" zeigt.
15. Verwenden Sie die Registerkarte Geräte und stellen Sie die Drehrichtung und Geschwindigkeit der Arena mit der Geschwindigkeitstaste ein. Wählen Sie sowohl positive als auch negative Geschwindigkeiten aus, die Umdrehungen im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn darstellen. Stellen Sie die Schockintensität im Abschnitt "Stromquelle " ein. Die gebräuchlichste Einstellung für Mäuse ist eine Drehung von 1 U/min und ein Schock von 0,5 mA.
16. Ändern Sie, wie oder wann die Schocks auf der Registerkarte "Aktuelle Quelle" ausgelöst werden sollen.
    1. Stellen Sie sicher, dass der aktuelle Modus auf Spurabhängig ausgewählt ist. Dies führt zu einem elektrischen Schlag, wenn sich die Maus in die Schockzone bewegt.
    2. Wählen Sie Zeit aus, um Schocks in einem vom Benutzer festgelegten Zeitintervall auszulösen. Verwenden Sie zuvor aufgenommene Spuren, um eine Maus zu schocken, indem Sie Aus Datei auswählen. Dies dient dazu, eine gejochte Steuermaus unabhängig vom räumlichen Lernen einer identischen Anzahl von Schocks bei gleicher Dauer und Intensität auszusetzen.
       HINWEIS: Auf den Registerkarten Dateiausgabe und Fenster können Daten- und Videodateien in einem bestimmten Verzeichnis gespeichert werden. Die Schaltfläche "Aus Bild " auf der Registerkarte "Dateiausgabe" ermöglicht es auch, den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, der ausgewählt werden soll.
17. Ziehe dich hinter den Vorhang zurück und beginne den Prozess. Die Anwesenheit des Versuchsleiters in der Nähe der Arena und unnötiger Lärm können die Leistung der Tiere beeinträchtigen.
18. Stellen Sie sicher, dass Geräusche und Gerüche während der Testphase begrenzt sind, da dies der Maus einen weiteren Hinweis geben und ihre Leistung beeinträchtigen kann. Beispiele zur Minimierung dieses Problems sind die Sicherstellung eines geschlossenen Behälters für klinische Abfälle, die Verwendung von Räumen, die aus lauten Laborräumen entfernt wurden, und die gründliche Reinigung der Geräte zwischen Mäusen. Forscher könnten in Erwägung ziehen, den Generator für weißes Rauschen zu verwenden, um nicht zusammenhängende externe Geräusche zu maskieren.
19. Lassen Sie die Einstreu im Käfig während des gesamten Verhaltenstestzeitraums gleich bleiben, da dies neue Stimulationen bieten und das Verhalten beeinflussen kann.
20. Um Tagesschwankungen zu vermeiden, führen Sie die Tests jeden Tag zu einer konstanten Zeit durch.

2. Gewöhnung an den Umgang mit dem Experimentator

1. Berühren Sie jede Maus täglich für 30 s bis 1 Minute für mindestens 2-3 Tage vor dem Test. Der Umgang mit den Tieren reduziert stress- und angstbedingtes Verhalten während der Tests erheblich.
2. Verwenden Sie den gleichen Laborkittel und vermeiden Sie das Tragen von starken Deodorants, Kölnisch Wasser oder Parfüm während der Gewöhnung und des Tests.

3. Gewöhnung an die APA-Arena (1 Tag)

1. Bringen Sie die Maus zur Gewöhnung in den Vorraum oder Testraum. Lassen Sie die Maus mindestens 30 Minuten lang gewöhnen. Stellen Sie die Lichtintensität im Vorraum oder Testraum ein, bevor Mäuse zur Gewöhnung herangezogen werden.
2. Richten Sie die Tracker-Software ein.
   1. Erstellen Sie einen experimentspezifischen Ordner. Je nach experimentellem Paradigma sollten Sie für jeden Tag oder Versuch separate Ordner haben. Richten Sie Experimentkonfigurationen wie oben beschrieben ein, und speichern Sie diese Konfigurationen, um sie in Zukunft zu verwenden.
   2. Bevor Sie eine Testversion starten, öffnen Sie die gespeicherte Konfiguration, indem Sie auf die Registerkarte Datei und dann auf das Symbol Speichern klicken, fügen Sie im neu geöffneten Fenster eine eindeutige Maus-ID hinzu und führen Sie die Testversion aus, indem Sie auf die Registerkarte Wiedergabe klicken.
3. Gewöhnen Sie die Maus an das APA-Gerät, indem Sie sie 5 Minuten lang der rotierenden Arena aussetzen, ohne Stöße abzugeben.
4. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig, indem Sie sie von der Basis des Schwanzes anheben und vorsichtig auf die behandschuhte Hand legen. Transportieren Sie die Maus zum APA-Gerät und platzieren Sie sie abseits der Stoßzone mit dem Gesicht zur Wand.
5. Ziehe dich hinter den Vorhang zurück und beginne den Prozess.
6. Entfernen Sie am Ende des Tests die Maus und kehren Sie in den Heimkäfig zurück.
7. Sammeln Sie den gesamten Urin und Kot und reinigen Sie das Gitter gründlich mit 80 % (v/v) Ethanol.
8. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 bis 3.7 für alle Mäuse.

4. Akquisitionstraining mit APA (1-6 Tage)

1. Stellen Sie die Raumbeleuchtung auf die gleichen Bedingungen wie am Gewöhnungstag ein.
2. Bringen Sie die Maus in den Vorraum oder Testraum und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten lang gewöhnen.
3. Richten Sie die Tracker-Software wie oben beschrieben ein.
4. Legen Sie die Dauer der Testversion fest.
5. Stellen Sie sicher, dass die Stromquelle eingeschaltet und eingestellt ist (d. h. 0,5 mA).
6. Platziere die Maus auf der Arena, weg von der Schockzone und mit dem Gesicht zur Wand.
7. Ziehen Sie sich hinter den Vorhang zurück und beginnen Sie die Testversion, indem Sie die Play-Taste drücken. Überwachen Sie die Maus auf dem Computerbildschirm und greifen Sie bei Bedarf ein. Zum Beispiel erhält die Maus keine Stöße oder wirkt übermäßig gestresst, was sich durch übermäßiges Springen oder Lautäußerungen zeigt.
8. Entfernen Sie am Ende des Tests die Maus und kehren Sie in den Heimkäfig zurück.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Mäuse die Stöße empfangen und darauf reagieren. Mäuse reagieren auf den Schock, indem sie sich aufbäumen und Laute ausstoßen. Wenn dies nicht der Fall ist, erhalten sie den Schock möglicherweise nicht. Dies kann an einem Skat auf dem Gitter oder an einer unzureichenden Nachverfolgung liegen. Daher ist es wichtig, das Gitter nach jedem Versuch zu reinigen und das Maus-Tracking zu optimieren, wie oben beschrieben.

5. Schulung zur Umkehrerwerbung (optional, 1-6 Tage)

1. Positionieren Sie die Schockzone bei der Umkehraufgabe an eine neue Position, in der Regel 180° von der vorherigen Position entfernt. Beurteilen Sie die Fähigkeit der Maus, flexibel eine neue Position in der Schockzone zu erlernen. Die Raumhinweise werden während des Umkehrlernens in der Regel nicht verändert.
2. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 bis 3.7 für alle Mäuse.

6. Sondenversuch (optional, 1 Tag)

1. Messen Sie beim Sondenversuch die Zeit bis zum ersten Eintritt und/oder die maximale Zeit, um die Schockzone zu umgehen.
   HINWEIS: Dies deutet auf eine Speicherkonsolidierung nach der Erfassungsphase hin. Eine gut trainierte Maus vermeidet es, die Schockzone über einen längeren Zeitraum (>60 Sekunden) zu betreten, was Anzeichen von räumlichem Lernen zeigt.
2. Stellen Sie die Intensität des Raumlichts wie am Tag des Akquisitionstrainings ein.
3. Gewöhnen Sie die Maus für 30 min in den Testraum oder Vorraum.
4. Richten Sie die Tracker-Software ein.
5. Legen Sie die Testdauer auf die gleiche Zeit wie den zuvor durchgeführten Testzeitraum fest (z. B. 10 Minuten oder 30 Minuten, abhängig von den Testparametern).
6. Geben Sie keine Schocks für diese Testversion ab.
7. Platzieren Sie die Maus auf der gegenüberliegenden Seite der aversiven Schockzone mit Blick auf die Wand.
8. Starten Sie den Prozess und ziehen Sie sich hinter den Vorhang zurück.
9. Stellen Sie sicher, dass die Maus effizient verfolgt wird.
10. Überwachen Sie die Maus auf dem Computerbildschirm und stoppen Sie den Test, wenn sie in die Schockzone eintritt. Einige Forscher ziehen es vor, den Versuch 5 Minuten lang fortzusetzen, um zu sehen, ob die Maus weiterhin in die Schockzone zurückkehrt.
11. Heben Sie die Maus vorsichtig auf und kehren Sie in den Heimkäfig zurück.
12. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Urin und Kot aufgefangen wird und das Gitter gründlich mit 80 % (v/v) Ethanol gereinigt wird.

7. Track-Analyse

HINWEIS: Die Leistung der Aufgabe kann über verschiedene Tracking-Software erreicht werden. Im Folgenden wird beschrieben, wie die mitgelieferte Software verwendet wird, um die Leistung während der APA-Aufgabe zu bestimmen. In diesem Fall werden die Daten mit dem Programm Track Analysis analysiert.

1. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie das Programm "Spuranalyse " und wählen Sie "Vermeidung" aus dem Dropdown-Menü im Hauptfenster.
2. Klicken Sie auf Aufgabe hinzufügen , um die während der Erfassungsphase gespeicherten Datendateien in einem neuen Fenster hochzuladen. Erstellen Sie unter Gruppenname eine zu analysierende Gruppe, z. B. Tag 1 oder Zeitpunkt der Analyse.
3. Klicken Sie auf das Ausgabeverzeichnis , um den Speicherort für die analysierten Daten auszuwählen.
4. Fügen Sie die zu analysierenden Dateien hinzu, indem Sie auf die Registerkarte Dateien hinzufügen klicken und die Dateien vom lokalen Laufwerk auswählen.
5. Legen Sie die zu analysierende Zeit fest, indem Sie auf die Registerkarte Zeit einstellen klicken. Dies bietet die Möglichkeit, den Zeitraum zu definieren, der analysiert werden soll, d.h. 0 bis 600 s. Alternativ können Sie die Daten in Bins analysieren, d. h. 60 s.
6. Nachdem alle Tracks hinzugefügt wurden, klicken Sie auf die Registerkarte Analyse und wählen Sie Analyse ausführen aus, um die Daten zu analysieren. Bei der Analyse werden mehrere Ordner erstellt. Die Daten für die Analyse befinden sich im Ordner TBLfiles . Öffnen Sie diese Datendateien in einer Tabelle und verwenden Sie sie für weitere Analysen, z. B. paarweise Vergleiche oder ANOVA mit wiederholten Messungen.
   HINWEIS: Bei der Analyse werden auch andere Ordner erstellt, einschließlich PS-Dateien, die eine einseitige Beschreibung der Mäuse während des Tests enthalten, die eine Trace-Karte und den Ort zeigen, an dem die Schocks empfangen wurden.

Results

Mäuse mit intakter räumlicher Lernfähigkeit zeigen eine Abnahme der Anzahl von Schocks während aufeinanderfolgender Akquisitionsversuche (Abbildung 4A). Ebenso erhöht sich die maximale Zeit, die die Schockzone umgangen werden kann, wenn die Maus lernt, erfolgreich von der Schockzone weg zu navigieren (Abbildung 4B). Mäuse, die nicht in der Lage sind, eine effektive Vermeidungsstrategie zu erlernen, zeigen jedoch bei jedem Akquisitionsversuch eine konstante Anzahl von Schocks (Abbildung 4A). Oft erhalten Mäuse, die die Schockzone nicht identifizieren, bei jedem Eintritt in die Zone mehrere Schocks. Trace Maps sind nützlich, um Beispiele von Mäusen zu liefern, die lernen, die Schockzone zu meiden (Abbildung 4C), und von Mäusen, die die Schockzone nicht vermeiden können (Abbildung 4D). In beiden Fällen stellen diese Trace Maps den letzten Tag der Erfassung dar. Die Maus in Abbildung 4C erhielt nur 2 Stöße, wie durch die beiden Kreise dargestellt. Beachten Sie auch, dass die Trace-Map zeigt, dass die Maus die meiste Zeit auf der gegenüberliegenden Seite der Schockzone verbringt, die durch den roten Keil dargestellt wird. Umgekehrt erhielt die Maus in Abbildung 4D mehr Stöße, und die Trace-Map zeigt ein ungeordnetes Muster. Beispiele für Mäuse, die nicht in der Lage sind, erfolgreich zu lernen, die Schockzone zu vermeiden, sind solche, die eine reduzierte hippokampale Neurogenese aufweisen, entweder aufgrund des höheren Alters, wie die 18 Monate alten Mäuse gezeigt haben (Abbildung 4A, B- modifiziert von Blackmore et al., 2021⁷), der chemischen Ablation unreifer Neuronen⁶ oder hippokampaler Läsionen (siehe Codd et al., 2020)⁸.

Es ist wichtig, zwischen einem erfolglosen Versuch, weil die Maus nicht lernt, und einem Versagen bei der Einrichtung des Geräts zu unterscheiden. Die beiden häufigsten Ursachen für schlechte Ergebnisse aufgrund eines Geräteausfalls sind eine schlechte Verfolgung der Maus (Abbildung 5A) oder ein fehlender Schock der Maus. Eine schlechte Nachführung kann verhindern, dass die Maus einen Schock erleidet, wenn sie sich in der Schockzone befindet. Alternativ kann eine schlechte Nachführung einen Schock auslösen, wenn sich die Maus nicht in der Zone befindet. In beiden Fällen wird dies die Maus daran hindern, eine effektive Vermeidungsstrategie zu entwickeln. Schlechtes Tracking kann behoben werden, indem der Schwellenwert auf der Registerkarte "Aus Kalibrator" angepasst wird. Schlechtes Tracking ist in der Regel definiert als mehr als 1000 fehlerhafte Frames während eines Zeitraums von 10 Minuten und tritt sehr selten auf. Eine schlechte Nachverfolgung kann bei älteren Mäusen, bei denen sich Alopezie entwickeln kann, zu einem Problem werden. Wenn die Maus einen Schock erhält, reagiert sie entweder mit Anspannung oder gelegentlich mit Lautäußerungen. Die Maus bewegt sich normalerweise, wenn auch nur leicht, und ist auf der Live-Tracking-Software zu sehen. Wenn sich die Maus vollkommen ruhig in der Stoßzone befindet, wird eine klare Linie von Stößen angezeigt (Abbildung 5B). Dies kann daran liegen, dass die Schockbox nicht eingeschaltet ist oder dass der Kot zwischen den Stangen steckt, wodurch die Amplitude des Schocks, der an das Tier abgegeben wird, verringert wird.

Abbildung 1: APA-Gerät, Verhaltensraum und Schockzoneneinstellung. (A) Ein Beispiel für die Einrichtung der Testarena und des Raums. Das APA-Gerät wird angehoben und in der Mitte des Raumes platziert, umgeben von neuartigen visuellen Reizen. Schwarz-Weiß-visuelle Hinweise werden auf der gleichen Höhe wie die Plattform verwendet. (B). Die Zielfunktion im Experiment-Tab ermöglicht die Maskierung der gesamten Arena und erstellt einen Ort der Schockzone. In diesem Beispiel wurde eine Schockzone erstellt, die durch den roten Keil dargestellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: APA-Setup für Albino-Mausstämme. Die APA-Arena kann für Albino-Stämme von Mäusen, wie z. B. BALB/c, eingerichtet werden, indem Sie auf der Registerkarte "Tracking " die Option "Licht" auswählen und einen schwarzen Arena-Hintergrund erstellen. Eine Albino-Maus auf schwarzem Hintergrund erreicht einen hohen Kontrast und bietet ein besseres Maus-Tracking. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Das Anpassen des Schwellenwerts für das Maus-Tracking ist unerlässlich. Der Schwellenwert muss entsprechend angepasst werden, um eine gute Rückverfolgbarkeit der Tiere während des Versuchs zu gewährleisten. Der Schwellenwert wird angepasst, indem die rote Linie im Schwellenwertbereich auf der Registerkarte Aus Kalibrator verschoben wird. (A) Ein Beispiel für eine gute Schwellenwertauswahl mit einem durchgehenden orangefarbenen Bereich und einem blauen X auf dem Objekt. (B) Ein schlechter Schwellenwert mit orangefarbenen Flecken. Eine schlechte Verfolgung führt zum Verlust eines Tieres in der Arena oder verhindert, dass die Maus einen Schock erhält, wenn sie sich in der Schockzone befindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich der Leistung zwischen jungen (10 Wochen) und älteren (18 Monaten) Mäusen auf einem 5-Tage-Lernparadigma und Trace-Karten. (A) Die 10 Wochen alten Mäuse erhielten im Vergleich zu den 18 Monate alten Mäusen während der 5-tägigen Testphase signifikant weniger Schocks; Beachten Sie, dass der Unterschied in der Anzahl der erlittenen Schocks am ersten Tag des Tests zwischen den Gruppen minimal war, aber junge Mäuse mit intaktem Gedächtnis lernten, den Eintritt in die Schockzone schneller zu vermeiden als die ältere Gruppe. (B) Die maximale Zeitvermeidung wurde berechnet als die maximale Zeit, die während des 10-minütigen Versuchs zur Vermeidung des Schocks aufgewendet wurde. Die jüngeren Mäuse lernten im Vergleich zu älteren Mäusen schnell, den Eintritt in die Schockzone zu vermeiden, was darauf hindeutet, dass die jungen Mäuse effektiv lernen. (C) Die Maus in dieser Spurenkarte erhielt nur zwei Schocks, wie durch die beiden Kreise in diesem Aufnahmeversuch dargestellt. Diese Maus verbrachte auch mehr Zeit in der Arena gegenüber der Schockzone, die durch den roten Keil dargestellt wird. (D) Diese Maus erhielt mehr Schocks und verbrachte mehr Zeit in der Nähe der Schockzone, was darauf hindeutet, dass bei dieser Maus kein räumliches Lernen erreicht wurde. Zur Überprüfung der Signifikanz wurde eine bidirektionale, wiederholte Mess-ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Tests verwendet. P<0.0001. Die Panels A und B wurden von Blackmore et ^al.7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Trace Maps liefern wichtige Informationen für jede Maus während jedes Versuchs. (A) Beachten Sie die geraden Linien, die in diesem Beispiel für die Verfolgung vorhanden sind. Dies liegt daran, dass die Tracking-Software eine Maus während der Aufgabe fälschlicherweise identifiziert. (B) Ein Beispiel für eine gute Nachverfolgung während der Testphase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Track-Visualisierung und Heatmap auf verschiedenen Tierverfolgungsprogrammen. Sowohl (A) Programm 1 als auch (B) Programm 2 erfassen den Standort und die Bewegung des Tieres, um Spurdiagramme zu erstellen, mit denen visuell überprüft werden kann, ob das Tier die Aufgabe oder die Wirkung der experimentellen Behandlung lernt. Beide Programme zeigen identische Spurplots eines Tieres, das die Aufgabe effizient gelernt hat. (C) Es kann auch eine Heatmap erstellt werden, die die Identifizierung von Hotspots und das Clustern der Datenpunkte erleichtert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der aktive Ortsvermeidungstest eine effektive räumliche Lernaufgabe ist, die auf einer Vielzahl von Mausstämmen und experimentellen Bedingungen angewendet werden kann. Die APA-Aufgabe überwindet Einschränkungen, die mit anderen räumlichen Lernparadigmen^{verbunden sind 14}, wie z. B. dem MWM, das für die Mäuse stressig ist und anhand des Cortisolspiegels^{gemessen wird 9}. Das MWM ist auch ungeeignet für gealterte Mäuse, bei denen berichtet wurde, dass sie während der Aufgabe^{schweben 10}. Obwohl andere räumliche Lerntests, wie das Barnes-Labyrinth und der neuartige Objektortungstest, weniger stressig sind, sind sie dadurch begrenzt, wie oft Wiederholungstests an derselben Kohorte von Mäusen durchgeführt werden können. Daher besteht der Hauptvorteil der APA-Aufgabe darin, dass sie mehrfach verwendet werden kann, da mehrere Parameter angepasst werden können, um die Neuheit zu erhalten. In der Tat haben wir die APA-Aufgabe bis zu 5 Mal an derselben Kohorte von Mäusen verwendet, um die Wirkung der Hippocampus-Ablation und die anschließende Wirkung von Übung^{zu untersuchen 8}. In jedem Fall wurden die Parameter, einschließlich der Arenadrehung, der Schockzone und der räumlichen Hinweise, zwischen den Tests geändert. Dies stellte sicher, dass die Mäuse räumliche Navigationshinweise verwendeten, um die Aufgabe neu zu erlernen, wie von den Kontrolltieren gezeigt, beginnend mit einer hohen Anzahl von Schocks und dann abnehmend während der nachfolgenden Testtage für jeden Testzeitraum⁸. In der Regel gehen wir am Ende eines 5-Tage-Testparadigmas davon aus, dass jedes Tier, das am letzten Tag mehr als 10 Schocks erhalten hat oder eine maximale Vermeidung von weniger als 60 s aufweist, das Paradigma nicht gelernt hat.

Neben der Möglichkeit, Einstellungen einfach zu ändern, um mehrere Runden räumlicher Tests zu ermöglichen, stellt die APA-Aufgabe sicher, dass Mäuse die räumliche Navigation verwenden müssen, um die Schockzone effektiv zu vermeiden. Zum Beispiel müssen Tiere externe Signale verwenden, um die stationäre Schockzone zu lokalisieren und zu vermeiden, indem sie sich von ihr weg bewegen⁵. Da sich die Arena dreht, sind Tiere nicht in der Lage, einen idiothetischen Ansatz für die Navigation zu verwenden, noch können sie exterozeptive Signale wie Gerüche verwenden, da sich diese Signale mit der Arena drehen, während die Schockzone und die räumlichen Signale stationär bleiben⁵.

Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass Mäuse angemessen an den Forscher- und APA-Bereich gewöhnt sind. Die Intensität des Fußschocks muss ebenfalls optimiert werden, da sowohl eine zu niedrige als auch eine zu hohe Schockintensität die Lernfähigkeit der Mäuse beeinträchtigen können, zu lernen und die Aufgabe^{auszuführen 5}. Die Schockintensität ist in der Regel auf 0,5 mA eingestellt und sollte 0,7 mA nicht überschreiten. Bei Tieren, die verstärktes angstähnliches Verhalten aufweisen, sollten Sie in Betracht ziehen, sowohl die Lichtintensität als auch die Intensität des Fußschocks zu reduzieren. Erhöhte Angst während der APA-Aufgabe kann sich entweder in übermäßigem Springen, unkontrolliertem Laufen innerhalb der Arena oder längerem Einfrieren äußern. Das hier beschriebene Protokoll verwendete eine Schockintensität von 0,5 mA, die gleiche Intensität, die zuvor bei BALB/c verwendet wurde, von der bekannt ist, dass sie ein höheres angstähnliches Verhalten aufweist¹⁵.

Hier beschreiben wir die Tierverfolgungssoftware, die von dem Unternehmen bereitgestellt wurde, das das verwendete aktive Ortsvermeidungsgerät bereitgestellt hat. Alternative Video-Tracking-Software eignet sich auch für die Analyse der Verhaltensleistung. Diese Programme können auch die Leistung der Maus während APA-Aufgaben genau messen und analysieren. Diese Programme ermöglichen die Schaffung mehrerer Zonen und Orte innerhalb der APA-Arena, um das Verhalten zu bewerten. Die Arena-Umgebung für eine APA besteht aus einer dreieckigen Schockzone, in der die Anzahl der Eingänge, die Zeit bis zum ersten Betreten und die in der Schockzone verbrachte Zeit gemessen werden. Innerhalb der Arena können auch zusätzliche Zonen hinzugefügt werden. Zum Beispiel können wir eine zentrale Zone oder eine Zone gegenüber der Schockzone hinzufügen, um die verbrachte Zeit und die in diesen Zonen zurückgelegte Strecke als Tierstrategie zu messen, um die aversive Zone zu vermeiden. Diese Programme verfolgen den Massenschwerpunkt der Maus, der dann gespeichert und zur visuellen Inspektion über dem Referenzrahmen angezeigt wird (Abbildung 6A,B). Schließlich ist es auch möglich, eine Dichte-Heatmap für die Leistung von Einzelpersonen und Gruppen zu erstellen (Abbildung 6C).

Bei der Durchführung der APA-Aufgabe gibt es potenzielle Probleme, die angegangen werden müssen. Gelegentlich müssen Mäuse von der Analyse ausgeschlossen werden, weil sie nicht auf die Schockzone reagieren. Wie immer sollte ein Ausschluss nur in Betracht gezogen werden, wenn sie vordefinierte Ausreißerbedingungen erfüllen, z. B. wenn sie außerhalb von 2 Standardabweichungen vom Mittelwert liegen. Komplexe Verhaltensaufgaben wie die APA erfordern typischerweise hohe N-Werte von Tieren. Wir empfehlen, vor der APA eine Power-Analyse durchzuführen, um die geeignete Stichprobengröße zu berechnen. Dies hängt vom verwendeten Stamm und den Behandlungsgruppen ab. Aus Erfahrung stellen wir fest, dass ein n-Wert von 10 oder mehr für jede Gruppe bei der Durchführung von APA-Experimenten eine ausreichende Leistung liefert. Das Hauptproblem bei dieser Aufgabe besteht darin, eine qualitativ hochwertige Verfolgung der Maus während der Aufgabe sicherzustellen. Die Gewöhnungsphase der Aufgabe sollte verwendet werden, um zu bestätigen, dass dies geschieht. Mäuse, die nicht auf einen Schock reagieren, sind oft auf Kot zwischen den Gitterstäben zurückzuführen. Es ist daher wichtig, das Rig nach jedem Tier zu reinigen und Kot oder Urin zu entfernen. Dadurch wird auch der Stress für die nachfolgenden Tiere reduziert. Die APA-Aufgabe beinhaltet in der Regel ein 5-Tage-Paradigma, was für Studien mit Interventionen, die weniger als 5 Tage wirksam sind, einige Einschränkungen mit sich bringen kann; Das Kurzzeitgedächtnis oder der räumliche Lernerwerb können jedoch weiterhin für solche Studien mit dem 30-minütigen Ansatz in einer Sitzung bewertet werden.

Zusammenfassend bietet dieser Artikel eine detaillierte Beschreibung, wie das aktive Ortsvermeidungsparadigma eingerichtet und verwendet werden kann, um das räumliche Lernen von Mäusen zu testen. Die Möglichkeit, die Bedingungen so zu ändern, dass mehrere Mausstämme unterschiedlicher Farbe getestet werden können, ist ein deutlicher Vorteil gegenüber anderen, traditionelleren räumlichen Tests wie dem MWM. Darüber hinaus ermöglicht die Modifikation mehrerer Parameter wiederholte Tests, so dass die Veränderungen des räumlichen Lernens während verschiedener experimenteller Paradigmen oder während des physiologischen Alterns genau verglichen werden können. In kurzer Zeit hat sich der APA-Test als genaue und effektive Alternative zum Hippocampus-abhängigen räumlichen Lernen erwiesen. In Zukunft kann die APA-Aufgabe als zuverlässige Methode zur Bewertung von therapeutischen oder körperlichen Interventionen auf kognitives und räumliches Verhalten sowohl bei Wildtyp- als auch bei transgenen Mäusen verwendet werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Konstantstromquelle CS02	BioSignal-Gruppe	N/A	Acton, Massachusetts, Vereinigte Staaten
Schaltkasten	BioSignal-Gruppe	N/A	Acton, Massachusetts, Vereinigte Staaten
Ethovision	Noldus	Variante 16	Wageningen, Niederlande
Dämpfer Scrambler	BioSignal-Gruppe	N/A	Acton, Massachusetts, Vereinigte Staaten
Track-Analyse	BioSignal-Gruppe	Version 2.2	Acton, Massachusetts, Vereinigte Staaten
Tracker-Programm	BioSignal-Gruppe	Ausführung: 2.36	Acton, Massachusetts, Vereinigte Staaten