Echtzeit-Detektion der dynamischen Affinität zwischen Biomolekülen mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Technologie

Summary

Die vorliegende Studie zielt darauf ab, das Prinzip und die Methodik der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Technologie aufzuklären, die vielseitige Anwendungen in mehreren Bereichen findet. Dieser Artikel beschreibt die SPR-Technologie, ihre einfache Bedienung und ihre bemerkenswerte Wirksamkeit, mit dem Ziel, ein breiteres Bewusstsein und eine breitere Akzeptanz dieser Technologie bei den Lesern zu fördern.

Abstract

Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Technologie ist eine empfindliche, präzise Methode zum Nachweis von Viren, pathogenen molekularen Proteinen und Rezeptoren, zur Bestimmung von Blutgruppen und zum Nachweis von Lebensmittelverfälschungen, neben anderen biomolekularen Nachweisen. Diese Technologie ermöglicht die schnelle Identifizierung potenzieller Bindungen zwischen Biomolekülen und ermöglicht ein schnelles und benutzerfreundliches, nicht-invasives Screening verschiedener Indikatoren, ohne dass eine Markierung erforderlich ist. Darüber hinaus erleichtert die SPR-Technologie die Echtzeit-Detektion für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening. In diesem Programm werden das Anwendungsgebiet und die Grundprinzipien der SPR-Technologie kurz vorgestellt. Der Betriebsprozess wird detailliert beschrieben, beginnend mit der Instrumentenkalibrierung und dem grundlegenden Systembetrieb, gefolgt von der Ligandenerfassung und der Mehrzyklusanalyse des Analyten. Die Echtzeitkurve und experimentelle Ergebnisse der Bindung von Quercetin und Calycosin an das KCNJ2-Protein wurden ausgearbeitet. Insgesamt bietet die SPR-Technologie eine hochspezifische, einfache, empfindliche und schnelle Methode für das Wirkstoffscreening, den Echtzeitnachweis der damit verbundenen Pharmakokinetik, den Virusnachweis sowie die Identifizierung von Umwelt- und Lebensmittelsicherheit.

Introduction

Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Technologie ist eine optische Detektionstechnik, die eine Markierung des Analyten überflüssig macht. Es ermöglicht die Echtzeit- und dynamische Überwachung der quantitativen Bindungsaffinität, Kinetik und Thermodynamik. Diese hohe Durchsatzkapazität ist hochempfindlich und reproduzierbar und ermöglicht die Messung verschiedener Öffnungsraten, Ausweichraten und Affinitäten. Darüber hinaus erhöht die geringe erforderliche Probenmenge den Nutzen dieses Verfahrens^{weiter 1,2}. Die biomolekulare Detektionsmethode

Protocol

HINWEIS: Die vollständige experimentelle Erfassungskurve zeigt, dass der experimentelle Prozess in acht verschiedene Stufen eingeteilt werden kann.

1. Proben- und Puffervorbereitung

1. Bereiten Sie die Sensorchips vor dem Experiment vor.
   1. Die Chips mit der Piranha-Lösung (30% H₂O₂: H₂SO₄=1:3; v/v) 2 min behandeln. Reinigen Sie den Chip anschließend gründlich mit einer großen Menge entionisiertem Wasser und weichen Sie ihn dann in wasserfreiem Ethanol ein, damit er auf natürliche Weise trocknen kann.
   2. Als nächstes weiche....

Results

Um zu bestimmen, ob das Protein auf der Chipoberfläche fixiert ist, wird die Ordinate (Antwortsignal) der SPR-Sensorkarte (Abbildung 1) verwendet, während die Winkelverschiebung der SPR-Kurve erhalten wird. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen die SPR-Kurve der Wechselwirkung zwischen Quercetin und Calycosin mit dem rekombinanten KCNJ2-Protein auf der immobilisierten Oberfläche des rekombinanten KCNJ2-Proteins nach Kontrollreduktion b.......

Discussion

Der SPR-Analysezyklus ist in vier Stufen unterteilt. Die erste Phase, die Baseline, beinhaltet die Injektion des Puffers. Darauf folgt die zweite Phase, die Ligandenerfassung. Der Sensorchip COOH wird mit EDC/NHS (1:1) bei einer Durchflussrate von 20 μL/min aktiviert. Anschließend wird der Chip mit 1 M Ethanolaminhydrochlorid-NaOH bei einer Durchflussrate von 20 μL/min deaktiviert. Weiter geht es mit der dritten Stufe, der Mehrzyklus-Analytmethode. Der Analyt wird mit einer Flussrate von.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC)	Nan Jing Reagenz, Nanjing, China	C08296594
wasserfreies Ethanol	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalisierungslösung	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
Blockierungslösung	Bosheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	110050
Bromessigsäure	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd., Shanghai, China	PM10036
Epichlorhydrin	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China
Ethanolaminhydrochlorid	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycin-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong High-Tech Industrial Development Zone, China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Rekombinantes Protein	Abnova, West Meijie Technology Co., Ltd., Peking, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Natriumacetat	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873