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Neuroscience

इन-वीवो चूहा ट्राइजेमिनल नाड़ीग्रन्थि में संवेदी न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) संवेदी न्यूरॉन सिग्नलिंग के एक मजबूत, जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण को सक्षम करते हैं। यहां, हमने एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया है जो चूहे ट्राइजेमिनल गैन्ग्लिया न्यूरॉन गतिविधि के विवो जीईसीआई दृश्य में अनुमति देता है।

Abstract

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) लक्षित सेल आबादी में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में परिवर्तन की निगरानी के लिए इमेजिंग तकनीकों को सक्षम करते हैं। उनका बड़ा सिग्नल-टू-शोर अनुपात जीईसीआई को संवेदी न्यूरॉन्स में उत्तेजना-विकसित गतिविधि का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है। जीईसीआई न्यूरॉन्स की संख्या के साथ उत्तेजना एन्कोडिंग के जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं जिनका एक साथ अध्ययन किया जा सकता है। यह जनसंख्या एन्कोडिंग विवो में सबसे उपयुक्त रूप से किया जाता है। पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी), जो गर्दन के नीचे दैहिक और आंत संरचनाओं को संक्रमित करने वाले संवेदी न्यूरॉन्स के सोमा का घर है, विवो इमेजिंग में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है क्योंकि इन संरचनाओं को अपेक्षाकृत आसानी से एक्सेस किया जाता है। हाल ही में, इस तकनीक का उपयोग चूहों में ट्राइजेमिनल गैंग्लियन (टीजी) में संवेदी न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए किया गया था जो मौखिक और क्रानियोफेशियल संरचनाओं को संक्रमित करते हैं। डीआरजी के अलावा टीजी का अध्ययन करने के कई कारण हैं, जिसमें मौखिक और क्रानियोफेशियल संरचनाओं के लिए विशिष्ट दर्द सिंड्रोम की लंबी सूची शामिल है जो संवेदी न्यूरॉन गतिविधि में परिवर्तन को दर्शाती है, जैसे कि ट्राइजेमिनल न्यूराल्जिया। आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता के कारण डीआरजी और टीजी न्यूरॉन्स के अध्ययन में चूहों का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। हालांकि, आकार में अंतर, हैंडलिंग में आसानी और संभावित रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के अंतर के साथ, माउस टीजी न्यूरॉन्स के बजाय चूहे का अध्ययन करने के कारण हैं। इस प्रकार, हम विवो में इमेजिंग चूहा टीजी न्यूरॉन्स के लिए एक दृष्टिकोण विकसित. हमने नवजात पिल्ले (पी 2) को एएवी एन्कोडिंग GCaMP6s के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट किया, जिसके परिणामस्वरूप टीजी और डीआरजी न्यूरॉन्स दोनों का >90% संक्रमण हुआ। टीजी क्रैनियोटॉमी और सजावट के बाद वयस्क में कल्पना की गई थी, और चेहरे के मैंडिबुलर और मैक्सिलरी क्षेत्रों की उत्तेजना के बाद टीजी न्यूरॉन्स में जीसीएएमपी 6 के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की निगरानी की गई थी। हमने पुष्टि की कि प्रतिदीप्ति में वृद्धि परिधीय तंत्रिका ब्लॉक के साथ उत्तेजना-विकसित थी। हालांकि इस दृष्टिकोण के कई संभावित उपयोग हैं, हम इसका उपयोग परिधीय तंत्रिका चोट के बाद बदले गए टीजी न्यूरॉन्स के उप-जनसंख्या (ओं) को चिह्नित करने के लिए कर रहे हैं।

Introduction

सोमाटोसेंसेशन, मांसपेशियों, हड्डी और आंत सहित त्वचा या अन्य शारीरिक संरचनाओं पर यांत्रिक, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाओं की तंत्रिका एन्कोडिंग, प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स में गतिविधि से शुरू होती है जो इन संरचनाओं को संक्रमित करती हैं1. एकल इकाई आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण ने इस प्रक्रिया में शामिल अभिवाही उपप्रकारों के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान किया है और साथ ही साथ उनके उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुण समय 1,2,3 के साथ कैसे बदल सकते हैं। हालांकि, जबकि लेबल लाइन सिद्धांत के समर्थन में मजबूत सबूत बने हुए हैं, जो बताता है कि विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों को न्यूरॉन्स के विशिष्ट उप-जनसंख्या (ओं) द्वारा व्यक्त किया जाता है, न्यूरॉन्स के कई उप-जनसंख्या की क्षमता एक ही प्रकार के यांत्रिक, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए सुझाव देती है कि अधिकांश सोमैटोसेंसरी उत्तेजनाओं को न्यूरॉन्स4 के कई उप-जनसंख्या द्वारा एन्कोड किया गया है, 5. इस प्रकार, सोमैटोसेंसेशन की बेहतर समझ केवल 10 की गतिविधि का अध्ययन करने की क्षमता के साथ आएगी, यदि सैकड़ों नहीं, तो न्यूरॉन्स की।

कन्फोकल के अपेक्षाकृत हाल के आगमन के साथ ऑप्टिकल दृष्टिकोण में प्रगति और, बाद में, मल्टीफोटन और डिजिटल इमेजिंग तकनीकों ने न्यूरोनल गतिविधि 6,7 के अपेक्षाकृत गैर-इनवेसिव जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण करने की क्षमता की सुविधा प्रदान की है। इस तकनीक के अनुप्रयोग में अंतिम बाधाओं में से एक तंत्रिका गतिविधि के ऑप्टिकल मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए उपकरणों का विकास रहा है। एक ऐक्शन पोटेंशिअल की गति को देखते हुए जो एक मिलीसेकंड से भी कम समय में शुरू और समाप्त हो सकती है, एक ऐक्शन पोटेंशिअल की गति से झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का पालन करने की क्षमता वाला एक वोल्टेज-संवेदनशील डाई इस उद्देश्य के लिए आदर्श उपकरण होगा। लेकिन जबइस क्षेत्र 7,8,9,10 में जबरदस्त प्रगति हुई है, तो इनमें से कई रंगों के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात अभी भी एकल कोशिका स्तर पर सैकड़ों न्यूरॉन्स के जनसंख्या विश्लेषण को सक्षम करने के लिए काफी अधिक नहीं है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, जांचकर्ताओं ने इंट्रासेल्युलर सीए2 + एकाग्रता ([सीए2+] आई) में परिवर्तनों की निगरानी की है। इस रणनीति के साथ सीमाएं शुरू से ही स्पष्ट हैं और इस तथ्य को शामिल करती हैं कि [सीए2+] आई में वृद्धि तंत्रिका गतिविधि11 का एक अप्रत्यक्ष उपाय है; कि [सीए2+] में वृद्धि वोल्टेज-गेटेड सीए2+ चैनल (वीजीसीसी)12,13के सक्रियण से जुड़े सीए2+ प्रवाह से स्वतंत्र रूप से हो सकती है; कि सीए2+ क्षणिक की परिमाण और अवधि को वीजीसीसी गतिविधि 11,12,14 से स्वतंत्र प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है; और यह कि सीए2+ यात्रियों का समय-पाठ्यक्रम एक ऐक्शन पोटेंशिअल15 से कहीं अधिक है। फिर भी, तंत्रिका गतिविधि के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में सीए2 + के उपयोग से जुड़े कई महत्वपूर्ण फायदे हैं। इनमें से कम से कम अधिकांश सीए2+ संकेतकों से जुड़ा सिग्नल-टू-शोर अनुपात नहीं है, जो इंट्रासेल्युलर सीए2+ में परिवर्तन के परिमाण और इस तथ्य को दर्शाता है कि सिग्नल कोशिका झिल्ली के दो-आयामी स्थान के बजाय साइटोसोल के त्रि-आयामी स्थान से उत्पन्न हो रहा है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2+ संकेतक (जीईसीआई) के विकास के साथ, कोशिकाओं के विशिष्ट उप-जनसंख्या में सीए2+ संकेतकों की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए आनुवंशिक रणनीतियों का लाभ उठाना संभव है, जिससे बरकरार तैयारी में जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण की सुविधा मिलती है (उदाहरण के लिए,16 देखें)।

चूहों में अब उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की संख्या को देखते हुए, इसमें कोई आश्चर्य नहीं होना चाहिए कि इस प्रजाति में जीईसीआई का सबसे बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। संवेदी न्यूरॉन्स की उप-जनसंख्या में संवैधानिक जीईसीआई अभिव्यक्ति के साथ माउस लाइनें 7,16,17 विकसित की गई हैं। विशिष्ट सेल प्रकारों में recombinases व्यक्त माउस लाइनों के विकास के साथ, यह GECI अभिव्यक्ति15 को नियंत्रित करने के लिए और भी अधिक परिष्कृत रणनीतियों का उपयोग करने के लिए संभव है. हालांकि, जबकि ये उपकरण कभी अधिक शक्तिशाली होते हैं, ऐसे कई कारण हैं कि अन्य प्रजातियां, जैसे चूहे, कुछ प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकती हैं। इनमें बड़े आकार शामिल हैं, जो कई प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की सुविधा प्रदान करते हैं जो मुश्किल हैं, यदि असंभव नहीं है, तो छोटे माउस में; अपेक्षाकृत जटिल व्यवहार कार्यों में चूहों को प्रशिक्षित करने में आसानी; और कम से कम कुछ सबूत है कि बायोफिजिकल गुण और चूहे संवेदी न्यूरॉन्स में कई आयन चैनलों की अभिव्यक्ति पैटर्न मानव संवेदी न्यूरॉन्स में मनाया कि मानव18 के सापेक्ष माउस में एक ही चैनल हैं की तुलना में अधिक समान हो सकता है.

सोमैटोसेंसरी उत्तेजनाओं का पारगमन आम तौर पर प्राथमिक afferents के परिधीय टर्मिनलों में होता है, जबकि परिधि में शुरू कार्रवाई क्षमता प्राथमिक अभिवाही सोमाटा, पृष्ठीय जड़ (DRG) या trigeminal (टीजी) गैन्ग्लिया के रूप में संदर्भित संरचना के माध्यम से पारित करना चाहिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र19. जबकि इस बात के प्रमाण हैं कि प्राथमिक अभिवाही अक्षतंतु के साथ प्रचारित प्रत्येक क्रिया क्षमता कोशिका शरीर20 पर आक्रमण नहीं करेगी, इस तथ्य का एक परिणाम है कि प्राथमिक अभिवाही सोमता एक टी-जंक्शन19 के माध्यम से मुख्य अभिवाही अक्षतंतु से जुड़े हैं, परिधि में शुरू की गई अधिकांश क्रिया क्षमता सोम21 पर आक्रमण करती दिखाई देती है. प्राथमिक अभिवाही में जनसंख्या कोडिंग का आकलन करने के लिए जीईसीआई का उपयोग करते समय यह तीन प्रयोगात्मक लाभ प्रदान करता है: अक्षतंतु के सापेक्ष सेल बॉडी का बड़ा आकार अभिवाही गतिविधि के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में [सीए2+] i का उपयोग करते समय शोर के संकेत को और बढ़ाता है; डीआरजी आमतौर पर उपयोग करना आसान होता है; और अभिवाही टर्मिनलों से स्थानिक रूप से दूरस्थ साइट पर गतिविधि का आकलन अभिवाही टर्मिनलों के उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुणों पर गैन्ग्लिया को उजागर करने के लिए आवश्यक सर्जरी के संभावित प्रभाव को कम करता है। हालांकि, क्योंकि टीजी मस्तिष्क के नीचे (या पैलेट के ऊपर) स्थित हैं, इसलिए वे डीआरजी की तुलना में उपयोग करना अधिक कठिन हैं। इसके अलावा, जबकि डीआरजी और टीजी न्यूरॉन्स के बीच कई समानताएं हैं, मतभेदों की बढ़ती सूची भी है। इसमें टीजी22 में न्यूरॉन्स के मोटे तौर पर सोमैटोटोपिक संगठन, अद्वितीय संरचनाएं, विभिन्न केंद्रीय टर्मिनल समाप्ति पैटर्न23,24,25,26, और अब जीन अभिव्यक्ति27,28 और कार्यात्मक रिसेप्टर अभिव्यक्ति29 दोनों में अंतर की बढ़ती सूची शामिल है. इसके अलावा, क्योंकि हम दर्द के परिधीय तंत्र की पहचान में रुचि रखते हैं, अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में दर्द सिंड्रोम जो ट्राइजेमिनल सिस्टम (जैसे, माइग्रेन, ट्राइजेमिनल न्यूराल्जिया, बर्निंग माउथ सिंड्रोम) के लिए अद्वितीय प्रतीत होते हैं जो प्राथमिक afferents30,31,32 में असामान्य गतिविधि को शामिल करते हैं, सुझाव देते हैं कि टीजी को सीधे अध्ययन करने की आवश्यकता है।

इस प्रकार, जबकि टीजी न्यूरॉन्स की उत्तेजना प्रतिक्रिया गुणों माउस16 में GECIs के साथ अध्ययन किया गया है, क्योंकि ऊपर सूचीबद्ध कारणों से पता चलता है कि चूहा प्रयोगात्मक सवालों की एक किस्म को संबोधित करने के लिए एक और अधिक उपयुक्त प्रजाति हो सकता है, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य चूहे में टीजी न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए GECIs का उपयोग करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित करने के लिए किया गया था. इसे प्राप्त करने के लिए, हमने परिधीय तंत्रिका तंत्र में GECI GCaMP6s की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक वायरल दृष्टिकोण का उपयोग किया। फिर हमने टीजी तक पहुंच की अनुमति देने के लिए अग्रमस्तिष्क को हटा दिया। अंत में, यांत्रिक और थर्मल उत्तेजनाओं को चेहरे पर लागू किया गया था, जबकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया था। साथ में, ये डेटा कई राज्यों के तहत टीजी में परिवर्तनों की जांच करने के लिए चूहे का उपयोग करने के लिए एक भूमिका का समर्थन करते हैं, ट्राइजेमिनल सिस्टम में संवेदी कोडिंग में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए टूलकिट का विस्तार करते हैं।

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Protocol

अनुसंधान में जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और दर्द के अध्ययन के लिए इंटरनेशनल एसोसिएशन द्वारा लगाए गए मानकों के अनुसार किया गया था और पिट्सबर्ग संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल # 22051100) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रत्येक प्रयोग के अंत में, चूहों बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के कार्डियक छिड़काव के साथ exanguination के माध्यम से euthanized थे, एक दृष्टिकोण अमेरिकी पशु चिकित्सा मेडिकल एसोसिएशन और पिट्सबर्ग IACUC विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित.

1. GCaMP प्रेरण

  1. समय-गर्भवती स्प्रैग डॉली चूहों को ऑर्डर करें ताकि जन्म के बाद उचित समय पर पिल्ले को इंजेक्शन दिया जा सके।
  2. प्रत्येक चूहे पिल्ला को संभालने से पहले 70% EtOH के साथ दस्ताने स्प्रे करें। यह बांध को युवाओं को नरभक्षण करने से रोकेगा।
  3. 70% EtOH के साथ स्वाब चूहे पिल्ले (P1-2) और 3 मिनट के लिए बर्फ पर संवेदनाहारी।
  4. AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) के 15 μL को 25 μL बाँझ, गैस-तंग हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करके इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट करें।

2. ट्राइजेमिनल गैंग्लियन एक्सपोजर सर्जरी

  1. 6-8 सप्ताह के चूहों (लगभग 150-200 ग्राम) को शरीर के वजन के आधार पर संवेदनाहारी कॉकटेल (55 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन, 5.5 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़ीन, 1 मिलीग्राम / किग्रा एप्रोमाज़िन) का प्रशासन करें।
    नोट: यह आम तौर पर संज्ञाहरण के एक शल्य विमान को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है जैसा कि एक हिंदपॉ के हानिकारक चुटकी के लिए वापसी पलटा की अनुपस्थिति द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। हालांकि, एक नाक शंकु के माध्यम से isoflurane के साथ पूरक अगर जानवरों प्रकाश बन जाते हैं.
  2. एक बार पूरी तरह से संवेदनाहारी हो जाने पर, सिर और चेहरे के बालों और मूंछों को शेव करें।
  3. कान सलाखों के साथ एक stereotaxic फ्रेम करने के लिए चूहे माउंट और शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए नीचे एक हीटिंग पैड (~ 37 हेसी) जगह.
  4. माउस ऑक्सीमीटर या तुलनीय के साथ महत्वपूर्ण संकेतों (हृदय गति, श्वसन दर, रक्त ऑक्सीजन संतृप्ति) की निगरानी करें।
    नोट: शरीर के तापमान की निगरानी एक रेक्टल जांच द्वारा की जाती है और चूहों को एक प्रतिक्रिया नियंत्रित परिसंचारी पानी के कंबल पर रखकर बनाए रखा जाता है।
  5. रक्तस्राव को कम करने के लिए रक्त वाहिकाओं को संकुचित करने के लिए सिर पर बर्फ-ठंडे खारा में डूबा हुआ धुंध रखें। एक आकार 15 स्केलपेल का प्रयोग, खोपड़ी पर त्वचा और मांसपेशियों की एक midline चीरा बनाने.
  6. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा और मांसपेशियों के कुंद विच्छेदन का प्रयोग करें.
  7. एक 1/4 दौर ड्रिल बिट का प्रयोग, ध्यान से forebrain बेनकाब करने के लिए खोपड़ी टोपी perforate. फिर, ध्यान से खोपड़ी के माध्यम से कटौती करने के लिए rongeurs (2.5 मिमी कप) का उपयोग करें.
  8. आकार 15 स्केलपेल का उपयोग करके, मस्तिष्क (ब्रेग्मा: -3.80) और घ्राण बल्ब में एक चीरा बनाएं।
    नोट: इस बिंदु से अधिक caudally काटने चूहे की मौत में परिणाम होगा
  9. ध्यान से खोपड़ी से ड्यूरा डिस्कनेक्ट करने के लिए एक रंग का प्रयोग करें और धीरे टीजी और खोपड़ी के आधार प्रकट करने के लिए कटे हुए मस्तिष्क उठा.
    नोट: निष्कर्षण के दौरान बर्फ-ठंडा खारा छिड़काव का अतिरिक्त उपयोग रक्तस्राव को कम करेगा और निम्नलिखित विच्छेदन क्षेत्र का अनुकूलन करेगा।
  10. एक दाग़ना कलम का उपयोग करके, निष्कर्षण के परिणामस्वरूप होने वाले किसी भी रक्तस्राव को रोकें।
    नोट: ड्यूरा काटने अपरिहार्य खून बह रहा है में परिणाम होगा. यह बर्फ ठंडा एसीएसएफ (119 मिमी NaCl, 26.2 मिमी NaHCO3, 2.5 मिमी KCl, 1 मिमी NaH2पीओ4, 1.3 मिमी MgCl2, 10 मिमी ग्लूकोज, 2.5 मिमी CaCl2) तैयार करने के लिए सबसे अच्छा है न्यूरोनल स्वास्थ्य को बनाए रखते हुए रक्त वाहिकाओं को संकुचित करने में मदद करने के लिए खोपड़ी गुहा स्नान करने के लिए।

3. GCaMP6s इमेजिंग

नोट: इन न्यूरॉन्स के आकार और घनत्व को देखते हुए, इमेजिंग और डेटा अधिग्रहण प्रणाली (उद्देश्य, माइक्रोस्कोप, प्रकाश स्रोत, कैमरा) जीईसीआई + कोशिकाओं की कल्पना की संख्या निर्धारित करेगी। प्रकाश स्रोत, उद्देश्य और कैमरा छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को भी निर्धारित करेगा, जिसमें एक्सपोज़र समय और छवि कैप्चर दर शामिल हैं। जबकि मल्टीफोटन और कॉन्फोकल तकनीकों का उपयोग प्रयोग के मापदंडों के आधार पर किया जा सकता है, एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कई कोशिकाओं को हल करने के लिए पर्याप्त हो सकती है। किसी भी छवि अधिग्रहण पैकेज का उपयोग किया जा सकता है। आदर्श रूप में, उत्तेजना आवेदन छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ समय बंद कर दिया है.

  1. उद्देश्य के नीचे खोपड़ी गुहा रखें और दृश्य प्रकाश का उपयोग करके टीजी को ध्यान में लाएं।
  2. GCaMP6s की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 496 एनएम है, और इसकी उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 513 एनएम है; इस प्रकार, GCaMP+ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयुक्त डाइक्रोइक और फ़िल्टर क्यूब्स का उपयोग करें। गैन्ग्लिया के क्षेत्र का पता लगाने और हल करने के लिए फोकस को समायोजित करें जिसमें न्यूरॉन्स ब्याज के ग्रहणशील क्षेत्र पर लागू उत्तेजनाओं का जवाब दे रहे हैं।
  3. टीजी में अधिकांश न्यूरॉन्स के दृश्य को सक्षम करने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग करें, यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी चेहरे के 1 सेमी2 क्षेत्र में लागू होता है,16. संकल्प बढ़ाने के लिए लंबी कामकाजी दूरी (20 मिमी) के साथ 10.8x शुष्क उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. समय के साथ और उत्तेजना आवेदन के जवाब में प्रतिदीप्ति डेटा एकत्र करने के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (जैसे, मेटामॉर्फ) का उपयोग करें।
    1. न्यूरॉन्स की फोटो विरंजन को कम करने के लिए, आधारभूत और प्रतिदीप्ति में वृद्धि पैदा का पता लगाने के लिए संभव के रूप में कम जोखिम समय के रूप में उपयोग करें. 20x, 0.40 NA वायु उद्देश्य, एक 120 W पारा हलाइड प्रकाश स्रोत, और वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एक पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक (CMOS) कैमरा, 300 ms का एक्सपोज़र समय, और 3 हर्ट्ज की छवि अधिग्रहण दर के साथ, >90 मिनट के लिए स्थिर आधारभूत रिकॉर्डिंग प्राप्त करें।
      नोट: 1) इन छवि अधिग्रहण मापदंडों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। 2) यांत्रिक (ब्रश, पंचर, कंपन, चुटकी), थर्मल (गर्मी और ठंड), और रासायनिक (कैप्सैकिन, मेन्थॉल, भड़काऊ मध्यस्थों) को ग्रहणशील क्षेत्र पर लागू किया जा सकता है। एक अपेक्षाकृत सस्ता व्यक्तिपरक दृष्टिकोण उत्तेजनाओं को हाथ से लागू करना है। अधिक उद्देश्य और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण की सिफारिश की जाती है, हालांकि, जहां प्रतिक्रिया-नियंत्रित एक्ट्यूएटर्स का उपयोग ज्ञात बल पर बार-बार आवेदन के लिए किया जा सकता है। जबकि प्रतिक्रिया-नियंत्रित पेल्टियर डिवाइस नियंत्रित हीटिंग और कूलिंग के लिए उपयोगी होते हैं, वे घुमावदार चेहरे की थर्मल उत्तेजना के लिए आदर्श नहीं होते हैं। प्रतिक्रिया-नियंत्रित अवरक्त प्रकाश स्रोत हीटिंग के लिए एक विकल्प हैं, और ठंडा स्प्रे ठंडा करने के लिए आदर्श विकल्प से कम है।

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Representative Results

क्योंकि हमें पहले चूहे संवेदी न्यूरॉन्स15 के संक्रमण के लिए एएवी 9 सीरोटाइप के साथ सफलता मिली है, हमने चूहे टीजी न्यूरॉन्स में जीसीएएमपी 6 की अभिव्यक्ति के लिए इस सीरोटाइप का उपयोग किया है। इसलिए हमने पहली बार AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) की संवेदी न्यूरॉन संक्रमण दक्षता का आकलन करने की मांग की, जब इस वायरस को नवजात चूहेपिल्ले 20 को प्रशासित किया गया था। यह वायरस सीएजी प्रमोटर का उपयोग करता है, जो जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को चलाता है और बनाए रखता है। इसके अलावा, एएवी 9 को नवजात चूहों33 को प्रशासित करते समय संवेदी न्यूरॉन्स को कुशलतापूर्वक संक्रमित करने के लिए दिखाया गया है। पहले इंजेक्शन प्रसवोत्तर दिन 5 (पी 5) पिल्ले में 5 माइक्रोन का उपयोग करते थे, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 51.66% ± 14.33% दक्षता(चित्रा 1ए)। संक्रमण दर बढ़ाने के लिए, हमने अंततः छोटे चूहों (p15) में वायरस (2 μL) की एक बड़ी मात्रा का उपयोग किया, वायरस के टिटर को 2.4 x 1014 समान रखा। इस रणनीति के परिणामस्वरूप 91.84% ± 3.18% (एन = 8) न्यूरॉन्स संक्रमित (चित्रा 1बी)।

कंपन पैड innervating टीजी न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए, हम अगले में विवो में टीजी बेनकाब करने के लिए एक शल्य चिकित्सा रणनीति विकसित. प्रमुख श्वसन केंद्रों को प्रभावित किए बिना लगभग 60% अग्रमस्तिष्क को हटाया जा सकता है। यह ब्रेग्मा -3.80 के लिए मस्तिष्क के ऊतकों रोस्ट्रल से मेल खाती है। उजागर टीजी (बाएं) का एक योजनाबद्ध और इन्फ्राऑर्बिटल तंत्रिका (आईओएन, दाएं) के संक्रमण क्षेत्र को चित्रा 2 में दिखाया गया है। कंपन पैड के संक्रमण को जन्म देने वाले टीजी के क्षेत्र को 20x पर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की निगरानी करते हुए वाइब्रिसल पैड पर प्रकाश यांत्रिक उत्तेजना (ब्रश) के आवेदन के साथ निर्धारित किया गया था। जैसा कि अनुमान लगाया गया था, TG का V2 क्षेत्र, जो चेहरे के मैक्सिलरी डिवीजन को संक्रमित करता है, सक्रिय एकमात्र क्षेत्र था। यही है, जबकि व्यवस्थित अध्ययन नहीं किया गया है, V1 (माथे पर त्वचा) या V3 (अनिवार्य पर त्वचा) क्षेत्रों पर लागू उत्तेजनाओं के जवाब में प्रतिदीप्ति में कोई बदलाव नहीं पाया गया था, जब अध्ययन के तहत न्यूरॉन्स को कंपन पैड पर लागू उत्तेजनाओं के साथ सक्रिय किया जा सकता था। बेसलाइन पर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन और कंपन पैड पर लागू उत्तेजनाओं के जवाब में तब निगरानी की गई थी। ब्याज के क्षेत्र (V2) चित्रा 3A में सीमांकित है. संवेदी न्यूरॉन्स34 में आराम गतिविधि के अपेक्षाकृत निम्न स्तर की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, आराम प्रतिदीप्ति अधिकांश न्यूरॉन्स में अपेक्षाकृत कम था, और प्रतिदीप्ति (चित्रा 3बी) में सहज वृद्धि के बहुत कम सबूत थे। परिधि 6,16,21 और सीएनएस 12,35,36 में न्यूरॉन्स में उत्तेजना-विकसित गतिविधि की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानदंड कई परिष्कृत वर्कफ़्लो पैकेजों के साथ एक विकसित क्षेत्र है जिसे स्वतंत्र रूप से 37,38 उपलब्ध कराया गया है। नियोजित विभिन्न दृष्टिकोणों की ताकत और कमजोरियों की पूरी चर्चा वर्तमान पांडुलिपि के दायरे से परे है। चूंकि यह वर्तमान अध्ययन का फोकस नहीं था, इसलिए हमने गैन्ग्लिया के क्षेत्रों में देखी गई चोटी की प्रतिक्रिया के आधार पर अपेक्षाकृत मनमाना और व्यक्तिपरक मानदंडों का उपयोग किया जिसमें कोई स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य न्यूरॉन्स (नाभिक को देखने की क्षमता के आधार पर) नहीं थे, जैसे कि एक न्यूरॉन को उत्तेजना के लिए उत्तरदायी माना जाता था यदि प्रतिदीप्ति में वृद्धि उत्तेजना आवेदन के लिए समय-बंद थी (प्रतिदीप्ति में वृद्धि उत्तेजना आवेदन के 1 एस के भीतर पता चला ( इस धारणा के आधार पर कि कोशिका शरीर से 3 सेमी से अधिक नहीं होने वाली साइट पर शुरू की गई सबसे धीमी गति से चलने वाले अक्षतंतु (0.2 मीटर/सेकंड) में शुरू की गई एक क्रिया क्षमता एक सेकंड से भी कम समय में सेल बॉडी तक पहुंच जानी चाहिए), और >6 बार थी शिखर प्रतिक्रिया के मानक विचलन (ΔF/F) ने एक नियंत्रण स्थल(चित्रा 3C)का पता लगाया। इसके बाद, हमने इन न्यूरॉन्स के प्रतिक्रिया गुणों को प्राकृतिक उत्तेजनाओं के लिए चित्रित किया: ब्रश, पंचर, गर्मी और ठंड। इन उत्तेजनाओं में से प्रत्येक के लिए प्रतिक्रियाओं के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाए जाते हैं. विशेष रूप से, पंचर उत्तेजना की प्रतिक्रिया, जो अक्सर दर्द से संबंधित अध्ययनों में उपयोग की जाती है, में सबसे मजबूत प्रतिक्रिया होती है (चित्र 4 बी, एफ)।

इस तकनीक को विकसित करने में हमारा लक्ष्य टीजी न्यूरॉन्स में जनसंख्या कोडिंग में परिवर्तन का आकलन करने में सक्षम होना था। इस प्रकार, हमने आईओएन (सीसीआई-आईओएन) के लिए पुरानी कसना चोट को अनुकूलित किया, जैसा कि पहले29 नियोजित था, तंत्रिका चोट के 2 सप्ताह बाद चूहों का अध्ययन करने के लिए। मॉडल को शामिल करने के बाद, हमने टीजी को उजागर किया और टीजी ipsilateral और चोट की साइट के विपरीत में आराम और विकसित गतिविधि का आकलन किया। दिलचस्प बात यह है कि ब्रश के लिए शिखर पैदा प्रतिक्रिया की भयावहता ~ 2 गुना विपरीत पक्ष (चित्रा 5 ए-सी) पर लागू एक ही उत्तेजना के लिए चोटी प्रतिक्रिया के सापेक्ष तंत्रिका घायल पक्ष पर वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, जब दो ब्रश उत्तेजनाओं को श्रृंखला में लागू किया गया था (10 एस के एक अंतर उत्तेजना-अंतराल के साथ), घायल लेकिन घायल पक्ष (चित्रा 5डी) पर दूसरी उत्तेजना की प्रतिक्रिया की भयावहता का एक महत्वपूर्ण प्रवर्धन नहीं था।

अंत में, प्रतिदीप्ति में उत्तेजना-विकसित वृद्धि परिधि में शुरू की गई कार्रवाई क्षमता के कारण होने की पुष्टि करने के लिए एक प्रारंभिक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, हमने उत्तेजना-विकसित प्रतिक्रियाओं पर टेट्रोडोटॉक्सिन (1 माइक्रोन) के प्रभाव का आकलन किया। TTX को 200 μL की मात्रा में इंजेक्ट किया गया था, जैसा कि पहले28 में वर्णित किया गया था, ताकि इन्फ्राऑर्बिटल तंत्रिका को लक्षित किया जा सके। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, विकसित गतिविधि लगभग पूरी तरह से समाप्त हो गई थी। एक साथ लिया गया, ये परिणाम इन-विवो में टीजी जनसंख्या प्रतिक्रियाओं से पूछताछ करने के लिए एएवी 9-जीसीएएमपी का उपयोग करने की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: नवजात एएवी इंजेक्शन के साथ टीजी न्यूरॉन्स में GCaMP6s संक्रमण की उच्च दक्षता। (ए) पी 5 चूहे पिल्ले को पीएएवी 9-सीएजी-जीसीएएमपी 6 एस-डब्ल्यूपीआरई-एसवी 40 (टिटर: 2.4 x 1014) वायरस के 5 माइक्रोन के साथ इंजेक्ट किया गया था: जीसीएएमपी 6 एस अभिव्यक्ति टीजी न्यूरॉन्स के 51.7 ± 14.3% (एन = 3 स्लाइस प्रति जानवर, 7 चूहों) में पाया गया था। (बी) युवा जानवरों (पी 2) में 15 माइक्रोन तक इंजेक्शन की मात्रा बढ़ाने से संक्रमण दक्षता में सुधार हुआ: जीसीएएमपी 6 एस अभिव्यक्ति 91.8 ± 3.2% टीजी न्यूरॉन्स (एन = 3 स्लाइस प्रति जानवर, 8 चूहों) में पाई गई थी। बाईं ओर के पैनल GCaMP6s के लिए दाग दिए गए थे। बीच में पैनलों को न्यूएन, एक न्यूरॉन-विशिष्ट मार्कर के साथ दाग दिया गया था। दाईं ओर के पैनल GCaMP6s और NeuN पैनलों की मर्ज की गई छवि हैं। पहले पैनल में स्केल बार बाद के सभी पैनलों के लिए समान है। दाईं ओर का ग्राफ GCaMP6s अभिव्यक्ति (मतलब ± SEM) का एक प्लॉट है, जो प्रति जानवर प्रति टुकड़ा न्यूरॉन्स की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में है, जहां व्यक्तिगत बिंदु प्रत्येक जानवर के लिए डेटा हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्राइजेमिनल गैंग्लियन (टीजी), इन्फ्राऑर्बिटल तंत्रिका (आईओएन), और चेहरे के क्षेत्र (वाइब्रिसल पैड) का स्थान उत्तेजित होता है। (ए) टीजी तक पहुंच को सक्षम करने के लिए अग्रमस्तिष्क को हटा दिया गया था। (बी) चेहरे का क्षेत्र जिसमें आईओएन और टीजी के सापेक्ष प्राकृतिक उत्तेजनाओं को लागू किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: GCaMP6s प्रतिदीप्ति में उत्तेजना-विकसित वृद्धि। (ए) 20x आवर्धन के तहत कुल दृश्य क्षेत्र। TG के नेत्र (V1) और मैक्सिलरी (V2) डिवीजनों का संकेत दिया गया है। (बी, सी) बॉक्स में क्षेत्र पैनल बी और सी में दिखाया गया है, जो क्रमशः वाइब्रिसल पैड के ब्रश उत्तेजना से पहले और बाद में प्रतिदीप्ति छवियां हैं। सफेद वृत्त रुचि के तुलनित्र क्षेत्र हैं। न्यूरॉन्स को पाठ में वर्णित ब्याज के तुलनित्र क्षेत्रों में देखे गए प्रतिदीप्ति में चरम परिवर्तन के आधार पर एक उत्तेजना के प्रति उत्तरदायी माना जाता था। पहले पैनल में स्केल बार दोनों पैनलों के लिए समान है। (डी) चेहरे पर लागू ब्रश उत्तेजना के जवाब में बी और सी में दिखाए गए न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति में प्रतिनिधि परिवर्तन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चेहरे पर लागू उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के आधार पर न्यूरॉन्स का वर्गीकरण। टीजी न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छवियां (शीर्ष पैनल - बेसलाइन) और बाद में (मध्य पैनल - उत्तेजना) 1 सेमी ऊंट-बाल ब्रश (ए - ब्रश), मोनोफिलामेंट्स के 1 सेमी2 ग्रिड (बी - पंचर), हीटिंग (सी - गर्मी) और शीतलन (डी - ठंडा) चेहरे के एक ही क्षेत्र पर लागू होता है। पहले पैनल में स्केल बार बाद के सभी पैनलों के लिए समान है। ऑरेंज सर्कल एक उत्तरदायी न्यूरॉन का एक उदाहरण दर्शाते हैं। सफेद वृत्त रुचि के तुलनित्र क्षेत्र हैं। (ईएच) प्रति उत्तेजना प्रत्येक प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि निशान। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: तंत्रिका की चोट टीजी न्यूरॉन्स में ब्रश-विकसित प्रतिक्रियाओं को बढ़ाती है। ब्रश करने के लिए टीजी न्यूरॉन्स की विशिष्ट प्रतिक्रियाएं चूहे के चेहरे पर दो बार लागू होती हैं, जो कि इन्फ्राऑर्बिटल तंत्रिका (ए, कॉन्ट्रा) की पुरानी कसना चोट के विपरीत या तंत्रिका चोट (बी, आईपीएसआई) के पक्ष में होती हैं। (सी) छह चूहों से उत्तरदायी न्यूरॉन्स से पूल किए गए डेटा का विश्लेषण (प्लॉट किए गए डेटा प्रति चूहे हैं) ने पुष्टि की कि ब्रश की पहली प्रतिक्रिया के परिमाण में अंतर महत्वपूर्ण था (युग्मित टी-टेस्ट)। (डी) जब पहले और दूसरे उत्तेजना आवेदन के लिए शिखर प्रतिक्रिया का विश्लेषण अनुपात (आर 2 / आर 1) के रूप में किया गया था, तो पूल किए गए डेटा के विश्लेषण ने पुष्टि की कि तंत्रिका-घायल पक्ष पर प्रतिक्रिया अनुपात में वृद्धि महत्वपूर्ण थी। ** पी < 0.01 कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) के साथ टीजी न्यूरॉन्स में विकसित गतिविधि का ब्लॉक। (ए)टीएक्स (200 माइक्रोन, 1 माइक्रोन) के इंजेक्शन के बाद एक तंत्रिका चोट के लिए टीजी न्यूरॉन्स ipsilateral से प्रतिदीप्ति डेटा एक ब्रश उत्तेजना (नीली पट्टी) के आवेदन के बाद इन्फ्राऑर्बिटल तंत्रिका से सटे। (बी) तीन चूहों से जमा शिखर प्रतिक्रिया डेटा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम टीजी इमेजिंग के लिए जीईसीआई चूहा पैदा करने का एक त्वरित, गैर-आक्रामक तरीका प्रदर्शित करते हैं। हमने जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को चलाने और बनाए रखने के लिए एक सीएजी प्रमोटर चुना। जबकि पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि अन्य एएवी सीरोटाइप डीआरजी न्यूरॉन्स39 में जीन अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक चला सकते हैं, हमारे परिणाम नवजात शिशुओं32 में एएवी के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से जुड़े हालिया अध्ययन के अनुरूप हैं, यह दर्शाता है कि एएवी 9 सीरोटाइप अत्यधिक कुशल है चूहे के नवजात संवेदी न्यूरॉन्स के संक्रमण।

इस तकनीक के समस्या निवारण के माध्यम से, यह कुछ नुकसानों पर ध्यान देने योग्य है जो इष्टतम संक्रमण को रोक सकते हैं। ध्यान में रखने के लिए मुख्य चर पिल्ले की उम्र है। चूहे तंत्रिका तंत्र पहले 7 दिनों के बाद40 में तेजी से विकसित होता है। हमने बाद के समय बिंदुओं (जैसे, पी 4-7) पर संक्रमण का प्रयास किया, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तनशील और खराब दक्षता हुई। पहले के समय बिंदु (p1-4) अधिक मजबूत और सुसंगत दक्षता का उत्पादन करते हैं, जिसमें p1-2 उच्चतम संक्रमण दर पैदा करता है। दूसरा चर इंजेक्शन की मात्रा है। उम्र के बावजूद, 2.5 x 1014 के टिटर के साथ टीजी या डीआरजी में 70% से अधिक दक्षता का उत्पादन करने के लिए न्यूनतम 15 माइक्रोन की आवश्यकता थी। हमने पाया कि, पी 2 पर भी, 10 माइक्रोन से कम के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन वयस्क में बहुत कम अभिव्यक्ति पैदा करते हैं। यह संभव है कि अधिक स्थानीयकृत इंजेक्शन, यानी, सीधे ब्याज के ग्रहणशील क्षेत्र में, कम मात्रा में समान प्रभाव पैदा करेंगे। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए पिल्ले को पूरी तरह से संवेदनाहारी करने की आवश्यकता होगी और ब्याज के ऊतक को आघात हो सकता है। अंत में, यह संभव है कि उच्च टाइटर्स के साथ छोटे संस्करणों का उपयोग किया जा सके।

जीईसीआई इमेजिंग के लिए टीजी को उजागर करना पहले चूहों16 में किया गया है। हालांकि, चूहे के लिए इस दृष्टिकोण का अनुवाद करने से विचार करने योग्य कई मुद्दों का पता चला। सबसे पहले, चूहे में खोपड़ी और ड्यूरा की मोटाई माउस की तुलना में बहुत अधिक है। इसलिए, खोपड़ी की टोपी को हटाने से चुनौतियां पैदा हो सकती हैं। हमने पाया कि एक छोटी सी ड्रिल खोपड़ी की टोपी को छिद्रित करने का एक प्रभावी तरीका है, जिसे बाद में रोंगर्स के साथ हटाया जा सकता है। एक दूसरा मुद्दा मस्तिष्क को हटा दिए जाने के बाद रक्तस्राव है। यह तैयारी की दीर्घायु के साथ-साथ इमेजिंग की स्पष्टता दोनों के लिए एक निरंतर मुद्दा हो सकता है, यदि न्यूरॉन्स के गुण नहीं हैं। बर्फ-ठंडे सीएसएफ में डूबा हुआ धुंध मुख्य धमनियों को बंद करने में मदद करने के लिए मस्तिष्क की उजागर सतह पर लागू किया जा सकता है। एक छोटे से दाग़ना पेन का उपयोग आगे रक्तस्राव को रोकने में भी प्रभावी हो सकता है। अंत में, इमेजिंग विंडो के contralateral पक्ष पर स्थित Gelfoam भी इमेजिंग समस्याओं के कारण से रक्त और सीएसएफ को रोकने में मदद कर सकते हैं. एक तीसरा विचार मस्तिष्क की मात्रा को हटाया जाना है। हमने पाया कि मस्तिष्क की दुम को ~ ब्रेग्मा -3.80 तक हटाने से हटाने के एक घंटे के भीतर मृत्यु हो जाएगी। इस प्रकार, मस्तिष्क को छोटे वर्गों में हटा दिया जाना चाहिए, जितना संभव हो उतना टीजी को उजागर करते हुए जितना संभव हो उतना रखते हुए।

जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, [सीए2+] मैं न्यूरोनल गतिविधि का एक अप्रत्यक्ष उपाय है, और इसके परिणामस्वरूप, [सीए2+] में वृद्धि का मतलब यह नहीं है कि तंत्रिका गतिविधि में वृद्धि हुई है। इस प्रकार, नियंत्रण प्रयोगों क्या विकसित गतिविधि माना जाता है कि वास्तव में प्रति से गतिविधि माना जाता है की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. उदाहरण के लिए, विद्युत रूप से विकसित उत्तेजनाओं को [सीए2+] i में एक समय-बंद वृद्धि का उत्पादन करना चाहिए, जो स्वाभाविक रूप से विकसित उत्तेजनाओं के समान पैमाने पर है। महत्वपूर्ण रूप से, इस गतिविधि को तंत्रिका के ब्लॉक (यानी, टीटीएक्स) के साथ समाप्त किया जाना चाहिए। हालांकि, यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन महत्वपूर्ण नियंत्रणों के बावजूद, यह अभी भी संभव है कि [सीए2+] i में स्पष्ट रूप से विकसित कुछ वृद्धि गैन्ग्लिया के भीतर सिग्नलिंग के कारण होती है, उदाहरण के लिए, गैन्ग्लिया41 के भीतर ट्रांसमीटर रिलीज के कारण, परिधि में शुरू की गई एक कार्रवाई क्षमता के कारण जिसने सेल सोमा पर आक्रमण किया है।

जबकि हमारे परिणाम पुष्टि करते हैं कि पिछले जांचकर्ताओं में से 16,42,43 संवेदी सोमाता में GCaMP प्रतिदीप्ति में परिवर्तन से जुड़े सिग्नल-टू-शोर अनुपात का संकेत एक मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए पर्याप्त है, वर्तमान अध्ययन में उपयोग की जाने वाली तंत्रिका चोट जैसे जोड़तोड़ न्यूरोनल गतिविधि और सीए 2+ सिग्नलिंग34 में ऐसे नाटकीय परिवर्तनों से जुड़े हो सकते हैं, कि गैन्ग्लिया में प्रतिक्रियाएं स्पष्ट पृष्ठभूमि में इतनी बड़ी वृद्धि से जुड़ी हो सकती हैं, कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को कृत्रिम रूप से क्षीण किया जा सकता है। इमेजिंग प्रसंस्करण दृष्टिकोण है कि इस सीमा44 को संबोधित करने में मदद कर सकते हैं विकसित किया गया है, सबसे प्रभावी ढंग से इस समस्या को हल करने के लिए confocal या multiphoton इमेजिंग की आवश्यकता हो सकती है.

एक साथ लिया, इस तकनीक एक जनसंख्या स्तर पर चूहे में टीजी न्यूरॉन्स की उत्तेजना प्रतिक्रिया गुणों की जांच के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है. आईओएन के सीसीआई के साथ हमारे परिणाम इन उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुणों में परिवर्तन का पता लगाने की व्यवहार्यता की पुष्टि करते हैं। जबकि वर्तमान अध्ययन में केवल यांत्रिक और थर्मल उत्तेजनाओं को नियोजित किया गया था, यह तैयारी टीजी न्यूरॉन्स के उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुणों को पूरी तरह से परिभाषित करने के लिए रासायनिक उत्तेजनाओं के आवेदन के लिए उत्तरदायी होनी चाहिए। इसी तरह, जब हमने त्वचीय afferents के उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुणों पर ध्यान केंद्रित किया, क्योंकि एक त्वचीय तंत्रिका को दर्दनाक चोट के बाद गतिशील यांत्रिक एलोडोनिया के रूप में इस तरह की घटनाओं के उद्भव के कारण, अन्य क्रैनियोफेशियल संरचनाओं जैसे कि temporomandibular संयुक्त (अहानिकर बनाम हानिकारक जबड़े आंदोलनों के जवाब में) को संक्रमित करने वाले afferents के गुणों में परिवर्तन का पता लगाना भी संभव होना चाहिए, कॉर्निया या जीभ। AAV9 सीरोटाइप का परिधीय इंजेक्शन GCaMP के न्यूरॉन-विशिष्ट प्रेरण की अनुमति देता है जो PNS-विशिष्ट है। इस रणनीति का एक प्रमुख लाभ यह है कि वायरल लेबलिंग पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं (यानी, न्यूरॉन्स) में एक मजबूत, लगातार अभिव्यक्ति प्रदान करता है, लेकिन माइटोटिक कोशिकाओं (जैसे, उपकला कोशिकाओं) में नहीं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न पीएनएस ऊतकों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग इंगित करती है कि इस वायरल रणनीति का उपयोग पैरा / सहानुभूति गैन्ग्लिया, डीआरजी और एंटरिक तंत्रिका तंत्र की जांच के लिए किया जा सकता है, साथ ही साथ (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

विवो तैयारी में यह कई तुलनाओं का पता लगाने की नींव भी प्रदान करता है जिनकी वर्तमान साहित्य में कमी है। चूहे टीजी और डीआरजी के बीच विवो जनसंख्या अध्ययन में, चूहा बनाम माउस टीजी, अभी तक आयोजित किया जाना है। यहां प्रस्तुत डेटा आयोजित किए जाने वाले इन महत्वपूर्ण प्रयोगों की नई व्यवहार्यता को दर्शाता है।

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Disclosures

गोल्ड इस तैयारी के विकास के दौरान ग्रुनेंथल से अनुदान सहायता प्राप्त कर रहा था। ग्रुनेंथल अध्ययन और इस पांडुलिपि में वर्णित तैयारी के फोकस में कोई ओवरलैप नहीं था। अन्य लेखकों में से किसी के पास खुलासा करने के लिए ब्याज के किसी भी अन्य संभावित संघर्ष नहीं हैं।

Acknowledgments

कैथी अल्बर्स और ब्रायन डेविस को उनके लीका माइक्रोस्कोप और मेटामॉर्फ प्रोग्राम के उपयोग के लिए, चार्ल्स वारविक को हमारे थर्मल पेल्टियर डिवाइस के निर्माण में मदद करने के लिए, और सर्जिकल तैयारी के समस्या निवारण में मदद करने के लिए डॉ रेमंड सेकुला का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG), और R01NS122784 (MSG और RS)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 204
<em>इन-वीवो</em> चूहा ट्राइजेमिनल नाड़ीग्रन्थि में संवेदी न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग
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Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., … More

Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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