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Neuroscience

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65978
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

Summary

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono una solida analisi a livello di popolazione della segnalazione sensoriale dei neuroni. Qui, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che consente la visualizzazione GECI in vivo dell'attività dei neuroni dei gangli trigeminali del ratto.

Abstract

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono alle tecniche di imaging di monitorare i cambiamenti nel calcio intracellulare nelle popolazioni cellulari bersaglio. Il loro elevato rapporto segnale/rumore rende i GECI un potente strumento per rilevare l'attività evocata dallo stimolo nei neuroni sensoriali. I GECI facilitano l'analisi a livello di popolazione della codifica dello stimolo con il numero di neuroni che possono essere studiati contemporaneamente. Questa codifica di popolazione viene eseguita in modo più appropriato in vivo. I gangli delle radici dorsali (DRG), che ospitano il soma dei neuroni sensoriali che innervano le strutture somatiche e viscerali sotto il collo, sono utilizzati più ampiamente per l'imaging in vivo perché queste strutture sono accessibili in modo relativamente semplice. Più recentemente, questa tecnica è stata utilizzata nei topi per studiare i neuroni sensoriali nel ganglio trigemino (TG) che innervano le strutture orali e craniofacciali. Ci sono molte ragioni per studiare la TG oltre alla DRG, inclusa la lunga lista di sindromi dolorose specifiche per le strutture orali e craniofacciali che sembrano riflettere cambiamenti nell'attività dei neuroni sensoriali, come la nevralgia del trigemino. I topi sono utilizzati più ampiamente nello studio dei neuroni DRG e TG a causa della disponibilità di strumenti genetici. Tuttavia, con le differenze nelle dimensioni, nella facilità di manipolazione e nelle differenze di specie potenzialmente importanti, ci sono ragioni per studiare i neuroni TG dei ratti piuttosto che quelli dei topi. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio per l'imaging dei neuroni TG di ratto in vivo. Abbiamo iniettato cuccioli neonatali (p2) per via intraperitoneale con un AAV codificante GCaMP6s, con conseguente infezione del >90% di entrambi i neuroni TG e DRG. La TG è stata visualizzata nell'adulto dopo craniotomia e decorticazione e i cambiamenti nella fluorescenza di GCaMP6s sono stati monitorati nei neuroni TG dopo la stimolazione delle regioni mandibolari e mascellari del viso. Abbiamo confermato che gli aumenti di fluorescenza sono stati stimolati con il blocco del nervo periferico. Sebbene questo approccio abbia molti usi potenziali, lo stiamo usando per caratterizzare le sottopopolazioni di neuroni TG modificati a seguito di lesioni dei nervi periferici.

Introduction

La somatosensazione, la codifica neurale di stimoli meccanici, termici e chimici che colpiscono la pelle o altre strutture corporee, inclusi muscoli, ossa e visceri, inizia con l'attività nei neuroni afferenti primari che innervano queste strutture1. Gli approcci elettrofisiologici basati su singole unità hanno fornito una grande quantità di informazioni sui sottotipi afferenti coinvolti in questo processo e su come le loro proprietà stimolo-risposta possono cambiare nel tempo 1,2,3. Tuttavia, mentre rimangono forti prove a sostegno della teoria della linea marcata, che suggerisce che specifiche modalità sensoriali sono veicolate da specifiche sottopopolazioni di neuroni, la capacità di molte sottopopolazioni di neuroni di rispondere agli stessi tipi di stimoli meccanici, termici e chimici suggerisce che la maggior parte degli stimoli somatosensoriali sono codificati da più sottopopolazioni di neuroni4, 5. Introduzione Pertanto, una migliore comprensione della somatosensazione arriverà solo con la capacità di studiare l'attività di 10, se non centinaia, di neuroni contemporaneamente.

I progressi negli approcci ottici con l'avvento relativamente recente delle tecniche di imaging confocale e, successivamente, multifotone e digitale hanno facilitato la capacità di eseguire analisi relativamente non invasive a livello di popolazione dell'attività neuronale 6,7. Uno degli ultimi ostacoli nell'applicazione di questa tecnologia è stato lo sviluppo di strumenti per consentire la valutazione ottica dell'attività neurale. Data la velocità di un potenziale d'azione che può iniziare e finire in meno di un millisecondo, un colorante sensibile al voltaggio con la capacità di seguire le variazioni del potenziale di membrana alla velocità di un potenziale d'azione sarebbe lo strumento ideale per questo scopo. Ma mentre ci sono stati enormi progressi in quest'area 7,8,9,10, il rapporto segnale-rumore per molti di questi coloranti non è ancora abbastanza alto da consentire un'analisi della popolazione di centinaia di neuroni a livello di singola cellula. Come approccio alternativo, i ricercatori si sono rivolti al monitoraggio dei cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i). I limiti di questa strategia sono stati chiari fin dall'inizio e includono il fatto che un aumento di [Ca2+]i è una misura indiretta dell'attività neurale11; che un aumento di [Ca2+]i può verificarsi indipendentemente dall'afflusso di Ca2+ associato all'attivazione dei canali Ca2+ voltaggio-dipendenti (VGCC)12,13; che l'entità e la durata di un transitorio di Ca2+ possono essere controllate da processi indipendenti dall'attività del VGCC 11,12,14; e che il decorso temporale dei transitori di Ca2+ supera di gran lunga quello di un potenziale d'azione15. Tuttavia, ci sono una serie di vantaggi significativi associati all'uso di Ca2+ come misura indiretta dell'attività neurale. Non ultimo di questi è il rapporto segnale-rumore associato alla maggior parte degli indicatori di Ca2+, che riflette sia l'entità del cambiamento nel Ca2+ intracellulare che il fatto che il segnale proviene dallo spazio tridimensionale del citosol piuttosto che dallo spazio bidimensionale della membrana cellulare. Inoltre, con lo sviluppo di indicatori di Ca2+ geneticamente codificati (GECI), è possibile sfruttare strategie genetiche per guidare l'espressione degli indicatori di Ca2+ in specifiche sottopopolazioni di cellule, facilitando le analisi a livello di popolazione in preparati intatti (ad esempio, vedi16).

Dato il numero di strumenti genetici ora disponibili nei topi, non dovrebbe sorprendere che i GECI siano stati utilizzati più ampiamente in questa specie. Sono state sviluppate linee murine con espressione GECI costitutiva in sottopopolazioni di neuroni sensoriali 7,16,17. Con lo sviluppo di linee murine che esprimono ricombinasi in specifici tipi di cellule, è possibile utilizzare strategie ancora più sofisticate per controllare l'espressione di GECI15. Tuttavia, mentre questi strumenti sono sempre più potenti, ci sono una serie di ragioni per cui altre specie, come i ratti, potrebbero essere più appropriate per alcune domande sperimentali. Questi includono le dimensioni maggiori, che facilitano una serie di manipolazioni sperimentali che sono difficili, se non impossibili, nel topo più piccolo; la facilità di addestrare i ratti in compiti comportamentali relativamente complessi; e almeno alcune prove che le proprietà biofisiche e i modelli di espressione di diversi canali ionici nei neuroni sensoriali di ratto possono essere più simili a quelli osservati nei neuroni sensoriali umani di quanto non lo siano gli stessi canali nel topo rispetto a quelli umani18.

Mentre la trasduzione degli stimoli somatosensoriali avviene generalmente nei terminali periferici delle afferenze primarie, il potenziale d'azione avviato in periferia deve passare attraverso la struttura che ospita i somati afferenti primari, denominati gangli della radice dorsale (DRG) o trigemino (TG) prima di raggiungere il sistema nervoso centrale19. Mentre ci sono prove che non tutti i potenziali d'azione che si propagano lungo un assone afferente primario invaderanno il corpo cellulare20, una conseguenza del fatto che i somati afferenti primari sono collegati all'assone afferente principale tramite una giunzione a T19, la maggior parte dei potenziali d'azione iniziati nella periferia sembrano invadere il soma21. Ciò conferisce tre vantaggi sperimentali quando si utilizzano GECI per valutare la codifica di popolazione nelle afferenze primarie: le grandi dimensioni del corpo cellulare rispetto agli assoni aumentano ulteriormente il rapporto segnale/rumore quando si utilizza [Ca2+]i come misura indiretta dell'attività afferente; i DRG sono generalmente di facile accesso; E la valutazione dell'attività in un sito spazialmente lontano dai terminali afferenti riduce al minimo il potenziale impatto dell'intervento chirurgico necessario per esporre i gangli sulle proprietà stimolo-risposta dei terminali afferenti. Tuttavia, poiché i TG si trovano sotto il cervello (o sopra la tavolozza), sono molto più difficili da accedere rispetto ai DRG. Inoltre, mentre ci sono molte somiglianze tra i neuroni DRG e TG, c'è anche un elenco crescente di differenze. Ciò include l'organizzazione approssimativamente somatotopica dei neuroni nel TG22, strutture uniche innervate, diversi modelli di terminazione terminale centrale 23,24,25,26 e ora un elenco crescente di differenze sia nell'espressione genica27,28 che nell'espressione funzionale del recettore29. Inoltre, poiché siamo interessati all'identificazione dei meccanismi periferici del dolore, il numero relativamente elevato di sindromi dolorose che sembrano essere uniche per il sistema trigemino (ad esempio, emicrania, nevralgia del trigemino, sindrome della bocca urente) che sembrano coinvolgere un'attività aberrante nelle afferenze primarie 30,31,32, suggerisce che la TG deve essere studiata direttamente.

Così, mentre le proprietà stimolo-risposta dei neuroni TG sono state studiate con GECI nel topo16, perché le ragioni sopra elencate suggeriscono che il ratto potrebbe essere una specie più appropriata per affrontare una varietà di domande sperimentali, lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare un approccio per utilizzare i GECI per studiare i neuroni TG nel ratto. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un approccio virale per guidare l'espressione dei GECI GCaMP6 nel sistema nervoso periferico. Abbiamo quindi rimosso il prosencefalo per consentire l'accesso al TG. Infine, sono stati applicati stimoli meccanici e termici al viso mentre le risposte neuronali sono state valutate al microscopio a fluorescenza. Insieme, questi dati supportano un ruolo per l'utilizzo del ratto per studiare i cambiamenti nel TG in molti stati, ampliando il kit di strumenti per i ricercatori interessati alla codifica sensoriale nel sistema trigemino.

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Protocol

Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di animali nella ricerca sono stati eseguiti in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health e dall'International Association for the Study of Pain e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Pittsburgh (protocollo #22051100). Alla fine di ogni esperimento, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia tramite eutanasia con perfusione cardiaca di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS), un approccio approvato dall'American Veterinary Medical Association e dall'Università di Pittsburgh IACUC.

1. Induzione GCaMP

  1. Ordina ratti Sprague Dawley in gravidanza in modo che i cuccioli possano essere iniettati al momento opportuno dopo la nascita.
  2. Spruzzare i guanti con EtOH al 70% prima di maneggiare ogni cucciolo di ratto. Questo dissuaderà la diga dal cannibalizzare i giovani.
  3. Tamponare i cuccioli di ratto (P1-2) con il 70% di EtOH e anestetizzare su ghiaccio per 3 min.
  4. Iniettare 15 μL di AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) per via intraperitoneale utilizzando una siringa Hamilton sterile da 25 μL a tenuta di gas.

2. Chirurgia dell'esposizione del ganglio trigemino

  1. Somministrare cocktail anestetico (55 mg/kg di ketamina, 5,5 mg/kg di xilazina, 1 mg/kg di acepromazina) per via intraperitoneale in base al peso corporeo a ratti di 6-8 settimane (circa 150-200 g).
    NOTA: Questo è generalmente sufficiente per mantenere un piano chirurgico di anestesia come valutato dall'assenza di un riflesso di astinenza al pizzico nocivo di una zampa posteriore. Tuttavia, integrare con isoflurano attraverso un cono nasale se gli animali diventano leggeri.
  2. Una volta completamente anestetizzato, radere i capelli e i baffi della testa e del viso.
  3. Montare il ratto su un telaio stereotassico con barre auricolari e posizionare un termoforo (~37 oC) sotto per mantenere la temperatura corporea.
  4. Monitorare i segni vitali (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, saturazione di ossigeno nel sangue) con un ossimetro per topi o equivalente.
    NOTA: La temperatura corporea viene monitorata da una sonda rettale e mantenuta posizionando i ratti su una coperta d'acqua circolante controllata da feedback.
  5. Metti una garza imbevuta di soluzione salina ghiacciata sulla testa per restringere i vasi sanguigni e ridurre al minimo il sanguinamento. Usando un bisturi misura 15, fai un'incisione sulla linea mediana della pelle e del muscolo sopra il cranio.
  6. Usa la dissezione smussata della pelle e del muscolo per esporre il cranio.
  7. Usando una punta da trapano rotonda da 1/4, perforare con cura la calotta cranica per esporre il prosencefalo. Quindi, usa i rongeur (coppa da 2,5 mm) per tagliare con cura il cranio.
  8. Usando un bisturi misura 15, praticare un'incisione nel cervello (Bregma: -3,80) e nel bulbo olfattivo.
    NOTA: Tagliare più caudalmente oltre questo punto provocherà la morte del ratto
  9. Usa una spatola per scollegare con cura la dura dal cranio e solleva delicatamente il cervello reciso per rivelare il TG e la base del cranio.
    NOTA: L'uso aggiuntivo della perfusione salina ghiacciata durante l'estrazione ridurrà al minimo lo spurgo e ottimizzerà il seguente campo di dissezione.
  10. Utilizzando una penna per cauterizzazione, arginare eventuali emorragie derivanti dall'estrazione.
    NOTA: Il taglio della dura provocherà un inevitabile sanguinamento. È meglio preparare aCSF ghiacciato (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM di glucosio, 2,5 mM CaCl2) per bagnare la cavità cranica per aiutare a restringere i vasi sanguigni mantenendo la salute neuronale.

3. Imaging GCaMP6s

NOTA: Date le dimensioni e la densità di questi neuroni, il sistema di imaging e acquisizione dati utilizzato (obiettivo, microscopio, sorgente luminosa, fotocamera) determinerà il numero di cellule GECI+ visualizzate. La sorgente luminosa, l'obiettivo e la fotocamera determineranno anche i parametri utilizzati per l'acquisizione dell'immagine, tra cui il tempo di esposizione e la velocità di acquisizione dell'immagine. Mentre le tecniche multifotone e confocali possono essere utilizzate a seconda dei parametri dell'esperimento, la microscopia a epifluorescenza può essere sufficiente per risolvere molte cellule. È possibile utilizzare qualsiasi pacchetto di acquisizione delle immagini. Idealmente, l'applicazione dello stimolo è bloccata nel tempo con il pacchetto software di acquisizione delle immagini.

  1. Posiziona la cavità cranica sotto l'obiettivo e metti a fuoco il TG usando la luce visibile.
  2. La lunghezza d'onda di eccitazione di GCaMP6s è di 496 nm e la sua lunghezza d'onda di emissione è di 513 nm; pertanto, utilizzare i cubi dicroici e di filtro appropriati per individuare le celle GCaMP+ . Regolare la messa a fuoco per individuare e risolvere l'area dei gangli in cui i neuroni rispondono agli stimoli applicati al campo recettivo di interesse.
  3. Utilizzare un obiettivo 10x per consentire la visualizzazione della maggior parte dei neuroni nel TG che rispondono a stimoli meccanici applicati a una regione di 1 cm2 del viso16. Utilizzare un obiettivo asciutto 20x con una lunga distanza di lavoro (10.8 mm) per aumentare la risoluzione.
  4. Utilizzare un software di acquisizione (ad esempio, Metamorph) per raccogliere i dati di fluorescenza nel tempo e in risposta all'applicazione dello stimolo.
    1. Per ridurre al minimo il foto-sbiancamento dei neuroni, utilizzare il tempo di esposizione più breve possibile per rilevare gli aumenti di fluorescenza al basale e evocati. Con l'obiettivo in aria 20x, 0,40 NA, una sorgente luminosa ad alogenuri di mercurio da 120 W e una fotocamera CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) utilizzata nel presente studio, un tempo di esposizione di 300 ms e una velocità di acquisizione delle immagini di 3 Hz, si ottengono registrazioni di base stabili per >90 min.
      NOTA: 1) Questi parametri di acquisizione delle immagini devono essere determinati empiricamente. 2) Al campo recettivo possono essere applicati metodi meccanici (pennello, punteggiatura, vibrazione, pizzico), termici (caldo e freddo) e chimici (capsaicina, mentolo, mediatori infiammatori). Un approccio soggettivo relativamente poco costoso consiste nell'applicare gli stimoli a mano. Tuttavia, si raccomandano approcci più oggettivi e riproducibili, in cui gli attuatori controllati dal feedback possono essere utilizzati per applicazioni ripetute a una forza nota. Sebbene i dispositivi Peltier controllati dal feedback siano utili per il riscaldamento e il raffreddamento controllati, non sono ideali per la stimolazione termica di un viso curvo. Le sorgenti luminose a infrarossi controllate dal feedback sono un'alternativa per il riscaldamento e lo spray freddo è un'alternativa tutt'altro che ideale per il raffreddamento.

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Representative Results

Poiché in precedenza abbiamo avuto successo con il sierotipo AAV9 per l'infezione dei neuroni sensoriali di ratto15, abbiamo usato questo sierotipo per l'espressione di GCaMP6 nei neuroni TG di ratto. Abbiamo quindi cercato di valutare l'efficienza dell'infezione da neuroni sensoriali di AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando questo virus è stato somministrato a cuccioli di rattoneonatale 20. Questo virus utilizza il promotore CAG, che guida e mantiene alti livelli di espressione genica. Inoltre, è stato dimostrato che AAV9 infetta efficacemente i neuroni sensoriali quando somministrato a ratti neonatali33. Le prime iniezioni hanno utilizzato 5 μL nei cuccioli postnatali al 5° giorno (p5), con un'efficienza di circa il 51,66% ± del 14,33% (Figura 1A). Per aumentare il tasso di infezione, alla fine abbiamo utilizzato un volume maggiore di virus (15 μL) nei ratti più giovani (p2), mantenendo lo stesso titolo virale di 2,4 x 1014 . Questa strategia ha portato al 91,84% ± al 3,18% (n = 8) dei neuroni infettati (Figura 1B).

Per visualizzare i neuroni TG che innervano il pad vibrissale, abbiamo successivamente sviluppato una strategia chirurgica per esporre i TG in vivo. Circa il 60% del prosencefalo può essere rimosso senza intaccare i principali centri respiratori. Ciò corrisponde al tessuto cerebrale rostrale a Bregma -3,80. Uno schema del TG esposto (a sinistra) e del territorio di innervazione del nervo infraorbitale (ION, a destra) è mostrato nella Figura 2. La regione del TG che dà origine all'innervazione del cuscinetto vibrissale è stata determinata con l'applicazione di una leggera stimolazione meccanica (spazzola) al cuscinetto vibrissale monitorando i cambiamenti di fluorescenza a 20x. Come previsto, la regione V2 del TG, che innerva la divisione mascellare del viso, era l'unica area attivata. Cioè, anche se non studiati sistematicamente, non sono stati rilevati cambiamenti nella fluorescenza in risposta agli stimoli applicati alle regioni V1 (pelle sulla fronte) o V3 (pelle sulla mandibola) quando i neuroni in studio potevano essere attivati con stimoli applicati al cuscinetto vibrissale. Sono stati quindi monitorati i cambiamenti nella fluorescenza al basale e in risposta agli stimoli applicati al pad vibrissale. La regione di interesse (V2) è delimitata nella Figura 3A. Coerentemente con i precedenti rapporti di livelli relativamente bassi di attività a riposo nei neuroni sensoriali34, la fluorescenza a riposo era relativamente bassa nella maggior parte dei neuroni e c'erano poche prove di aumenti spontanei della fluorescenza (Figura 3B). I criteri utilizzati per identificare l'attività evocata dallo stimolo nei neuroni della periferia 6,16,21 e del SNC 12,35,36 è un campo in evoluzione con diversi sofisticati pacchetti di flusso di lavoro che sono stati resi disponibili gratuitamente 37,38. Una discussione completa dei punti di forza e di debolezza dei vari approcci impiegati esula dallo scopo del presente manoscritto. Poiché questo non era l'obiettivo del presente studio, abbiamo utilizzato criteri relativamente arbitrari e soggettivi basati sulla risposta di picco osservata nelle regioni dei gangli in cui non c'erano neuroni chiaramente rilevabili (in base alla capacità di vedere il nucleo), in modo tale che un neurone fosse considerato reattivo a uno stimolo se l'aumento della fluorescenza era bloccato nel tempo rispetto all'applicazione dello stimolo (aumento della fluorescenza rilevato entro 1 s dall'applicazione dello stimolo ( sulla base dell'ipotesi che un potenziale d'azione iniziato negli assoni a conduzione più lenta (0,2 m/s) iniziato in un sito a non più di 3 cm dal corpo cellulare dovrebbe raggiungere il corpo cellulare in meno di un secondo) ed era >6 volte la deviazione standard della risposta di picco (ΔF/F) ha rilevato un sito di controllo (Figura 3C). Successivamente, abbiamo caratterizzato le proprietà di risposta di questi neuroni agli stimoli naturali: spazzola, punteggiatura, calore e freddo. Esempi di risposte a ciascuno di questi stimoli sono mostrati nella Figura 4. In particolare, la risposta alla stimolazione puntiforme, che viene spesso utilizzata negli studi sul dolore, ha la risposta più robusta (Figura 4B,F).

Il nostro obiettivo nello sviluppo di questa tecnica era quello di essere in grado di valutare i cambiamenti nella codifica della popolazione nei neuroni TG. Pertanto, abbiamo adattato la lesione da costrizione cronica allo ION (CCI-ION), come precedentemente impiegato29, per studiare i ratti 2 settimane dopo la lesione nervosa. A seguito dell'induzione del modello, abbiamo esposto il TG e valutato l'attività a riposo ed evocata nel TG omolaterale e controlaterale al sito di lesione. È interessante notare che l'entità della risposta evocata di picco allo spazzolino è aumentata di ~ 2 volte sul lato danneggiato dal nervo rispetto alla risposta di picco allo stesso stimolo applicato al lato controlaterale (Figura 5A-C). Inoltre, quando due stimoli a spazzola sono stati applicati in serie (con un intervallo tra gli stimoli di 10 s), c'è stata una significativa amplificazione dell'entità della risposta al secondo stimolo sul lato ferito ma non illeso (Figura 5D).

Infine, come esperimento di controllo iniziale per confermare che l'aumento della fluorescenza evocato dallo stimolo era dovuto ai potenziali d'azione avviati in periferia, abbiamo valutato l'impatto della tetrodotossina (1 μM) sulle risposte evocate dallo stimolo. TTX è stato iniettato in un volume di 200 μL per via percutanea come descritto in precedenza28 in modo da colpire il nervo infraorbitale. Come mostrato nella Figura 6, l'attività evocata è stata quasi completamente eliminata. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano l'utilità dell'utilizzo di AAV9-GCaMP per interrogare le risposte della popolazione TG in vivo.

Figure 1
Figura 1: Alta efficienza dell'infezione da GCaMP6s nei neuroni TG con iniezione neonatale di AAV. (A) I cuccioli di ratto P5 sono stati iniettati con 5 μL di virus pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 (titolo: 2,4 x 1014) per via intraperitoneale: l'espressione di GCaMP6s è stata rilevata nel 51,7 ± nel 14,3% dei neuroni TG (n = 3 fette per animale, 7 ratti). (B) L'aumento del volume di iniezione a 15 μL negli animali più giovani (p2) ha migliorato l'efficienza dell'infezione: l'espressione di GCaMP6s è stata rilevata nel 91,8 ± nel 3,2% dei neuroni TG (n = 3 fette per animale, 8 ratti). I pannelli a sinistra sono stati colorati per GCaMP6. I pannelli al centro sono stati colorati con NeuN, un marcatore neurone-specifico. I pannelli a destra sono un'immagine unita dei pannelli GCaMP6s e NeuN. La barra della scala nel primo pannello è la stessa per tutti i pannelli successivi. Il grafico a destra è un grafico dell'espressione di GCaMP6s (media ± SEM) come percentuale del numero totale di neuroni per fetta per animale, dove i singoli punti sono i dati per ogni animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Posizione del ganglio trigemino (TG), del nervo infraorbitale (ION) e dell'area del viso (cuscinetto vibrisale) stimolata. (A) Il prosencefalo è stato rimosso per consentire l'accesso al TG. (B) Area del viso in cui sono stati applicati stimoli naturali rispetto allo ION e al TG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Aumento della fluorescenza GCaMP6s evocato dallo stimolo. (A) Campo visivo totale con ingrandimento 20x. Sono indicate le divisioni oftalmiche (V1) e mascellari (V2) del TG. (B,C) La regione nel riquadro è mostrata nei pannelli B e C, che sono immagini di fluorescenza rispettivamente prima e dopo la stimolazione a spazzola del cuscinetto vibrissale. I cerchi bianchi sono regioni di interesse di confronto. I neuroni sono stati considerati responsivi a uno stimolo in base al picco di variazione della fluorescenza osservato nelle regioni di interesse del comparatore, come descritto nel testo. La barra della scala nel primo pannello è la stessa per entrambi i pannelli. (D) Cambiamenti rappresentativi nella fluorescenza dei neuroni mostrati in B e C in risposta a uno stimolo a pennello applicato al viso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Classificazione dei neuroni in base alla loro risposta agli stimoli applicati al viso. Immagini rappresentative dei neuroni TG prima (pannelli superiori - Basale) e dopo (pannello centrale - Stimolazione) delle risposte a una spazzola di pelo di cammello di 1 cm (A - Spazzola), 1 cm2 di griglia di monofilamenti (B - Punteggiatura), riscaldamento (C - Calore) e raffreddamento (D - Freddo) applicata alla stessa regione del viso. La barra della scala nel primo pannello è la stessa per tutti i pannelli successivi. I cerchi arancioni indicano un esempio di neurone reattivo. I cerchi bianchi sono regioni di interesse di confronto. (E-H) Tracce rappresentative di ogni risposta per stimolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: La lesione nervosa aumenta le risposte evocate dal pennello nei neuroni TG. Risposte tipiche dei neuroni TG allo spazzolino applicato due volte sul muso di ratto sul lato controlaterale di una lesione di costrizione cronica del nervo infraorbitale (A, Contro) o sul lato omolaterale alla lesione nervosa (B, Ipsi). (C) L'analisi dei dati aggregati provenienti da neuroni responsivi di sei ratti (i dati tracciati sono per ratto) ha confermato che la differenza nell'entità della prima risposta al pennello era significativa (test t accoppiato). (D) Quando la risposta di picco alla prima e alla seconda applicazione di stimolo è stata analizzata come rapporto (R2/R1), l'analisi dei dati aggregati ha confermato che l'aumento del rapporto di risposta sul lato nervoso era significativo. ** p < 0,01 Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Blocco dell'attività evocata nei neuroni TG con tetrodotossina (TTX). (A) Dati di fluorescenza da neuroni TG omolaterali a una lesione nervosa dopo iniezione di TTX (200 μL, 1 μM) adiacente al nervo infraorbitale in seguito all'applicazione di uno stimolo a spazzola (barra blu). (B) Dati aggregati di risposta al picco di tre ratti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, dimostriamo un modo rapido e non invasivo di generare un ratto GECI per l'imaging del TG. Abbiamo scelto un promotore CAG per guidare e mantenere alti livelli di espressione genica. Mentre studi precedenti suggeriscono che altri sierotipi AAV possono guidare in modo efficiente l'espressione genica nei neuroni DRG39, i nostri risultati sono coerenti con un recente studio che coinvolge l'iniezione intraperitoneale di AAV nei neonati32, indicando che il sierotipo AAV9 è altamente efficiente nell'infezione dei neuroni sensoriali neonatali di ratto.

Attraverso la risoluzione dei problemi di questa tecnica, vale la pena notare alcune insidie che possono prevenire un'infezione ottimale. La variabile principale da tenere a mente è l'età dei cuccioli. Il sistema nervoso del ratto si sviluppa rapidamente nei primi 7 giorni postnatali40. Abbiamo tentato infezioni in momenti successivi (ad esempio, p4-7), che hanno portato a un'efficienza variabile e scarsa. I punti temporali precedenti (p1-4) producono un'efficienza più robusta e coerente, con p1-2 che produce i tassi di infezione più elevati. La seconda variabile è il volume di iniezione. Indipendentemente dall'età, è stato necessario un minimo di 15 μL per produrre un'efficienza superiore al 70% nel TG o DRG con un titolo di 2,5 x 1014. Abbiamo scoperto che, anche a p2, le iniezioni intraperitoneali inferiori a 10 μL producono pochissima espressione nell'adulto. E' possibile che iniezioni più localizzate, cioè direttamente nel campo recettivo di interesse, a volumi più bassi producano effetti simili. Tuttavia, questo approccio richiederebbe che i cuccioli siano completamente anestetizzati e potrebbe causare traumi al tessuto di interesse. Infine, è possibile che vengano utilizzati volumi più piccoli con titoli più elevati.

L'esposizione del TG per l'imaging GECI è stata precedentemente eseguita nei topi16. Tuttavia, la traduzione di questo approccio al ratto ha rivelato diversi problemi che vale la pena considerare. Innanzitutto, lo spessore del cranio e della dura nel ratto è molto maggiore che in un topo. Pertanto, la rimozione della calotta cranica può rappresentare una sfida. Abbiamo scoperto che un piccolo trapano è un modo efficace per perforare la calotta cranica, che può quindi essere rimossa con i rongeur. Un secondo problema è il sanguinamento una volta che il cervello è stato rimosso. Questo può essere un problema continuo sia per la longevità del preparato che per la chiarezza dell'imaging, se non per le proprietà dei neuroni. La garza imbevuta di liquido cerebrospinale ghiacciato può essere applicata sulla superficie esposta del cervello per aiutare a chiudere le arterie principali. L'uso di una piccola penna per cauterizzazione può anche essere efficace nell'arginare ulteriori emorragie. Infine, il Gelfoam situato sul lato controlaterale della finestra di imaging può anche aiutare a prevenire che il sangue e il liquido cerebrospinale causino problemi di imaging. Una terza considerazione è la quantità di cervello da rimuovere. Abbiamo scoperto che la rimozione del cervello caudale a ~Bregma -3,80 provoca la morte entro un'ora dalla rimozione. Pertanto, il cervello dovrebbe essere rimosso in piccole sezioni, conservando il più possibile ed esponendo la maggior parte possibile del TG.

Come notato nell'introduzione, [Ca2+]i è una misura indiretta dell'attività neuronale e, di conseguenza, un aumento di [Ca2+]i non significa necessariamente che ci sia un aumento dell'attività neurale. Pertanto, gli esperimenti di controllo sono fondamentali per confermare che ciò che è considerato attività evocata è in realtà attività di per sé. Ad esempio, gli stimoli evocati elettricamente dovrebbero produrre un aumento bloccato nel tempo di [Ca2+]i, che è su una scala simile a quella degli stimoli evocati naturalmente. È importante sottolineare che questa attività dovrebbe essere eliminata con il blocco del nervo (cioè TTX). Tuttavia, è anche importante notare che, nonostante questi importanti controlli, è ancora possibile che alcuni degli aumenti apparentemente evocati di [Ca2+]i siano dovuti alla segnalazione all'interno dei gangli, ad esempio, a causa del rilascio del trasmettitore all'interno dei gangli41, piuttosto che a un potenziale d'azione iniziato nella periferia che ha invaso il soma cellulare.

Mentre i nostri risultati confermano che dei precedenti ricercatori 16,42,43 che indicano che il rapporto segnale-rumore associato ai cambiamenti nella fluorescenza GCaMP nei somata sensoriali è sufficiente per l'uso con un microscopio a epifluorescenza standard, manipolazioni come la lesione nervosa utilizzata nel presente studio possono essere associate a cambiamenti così drammatici nell'attività neuronale e nella segnalazione di Ca2+ 34, che le risposte in tutti i gangli possono essere associate a un aumento così grande dello sfondo apparente, che le risposte dei singoli neuroni possono essere attenuate artificialmente. Sebbene siano stati sviluppati approcci di elaborazione delle immagini che possono aiutare a risolvere questa limitazione,l'imaging confocale o multifotone può essere necessario per risolvere questo problema nel modo più efficace.

Nel complesso, questa tecnica fornisce un approccio per studiare le proprietà stimolo-risposta dei neuroni TG nel ratto a livello di popolazione. I nostri risultati con il CCI dello ION confermano la fattibilità di rilevare i cambiamenti in queste proprietà stimolo-risposta. Mentre nel presente studio sono stati impiegati solo stimoli meccanici e termici, questa preparazione dovrebbe essere suscettibile all'applicazione di stimoli chimici per definire completamente le proprietà stimolo-risposta dei neuroni TG. Allo stesso modo, mentre ci siamo concentrati sulle proprietà stimolo-risposta delle afferenze cutanee, a causa dell'emergere di fenomeni come l'allodinia meccanica dinamica a seguito di una lesione traumatica a un nervo cutaneo, dovrebbe anche essere possibile rilevare cambiamenti nelle proprietà delle afferenze che innervano altre strutture craniofacciali come l'articolazione temporo-mandibolare (in risposta a movimenti mascellari innocui rispetto a quelli nocivi), cornea o lingua. L'iniezione periferica del sierotipo AAV9 consente l'induzione neurone-specifica di GCaMP che è PNS-specifico. Uno dei principali vantaggi di questa strategia è che la marcatura virale fornisce un'espressione robusta e persistente nelle cellule post-mitotiche (ad esempio, i neuroni) ma non nelle cellule mitotiche (ad esempio, le cellule epiteliali). Inoltre, lo screening preliminare di diversi tessuti del SNP indica che questa strategia virale può essere utilizzata per studiare anche i gangli para/simpatici, il DRG e il sistema nervoso enterico (dati non mostrati).

Questa preparazione in vivo fornisce anche le basi per esplorare molti confronti che mancano nella letteratura attuale. Non sono ancora stati condotti studi di popolazione in vivo tra TG e DRG di ratto, TG di ratto vs. TG di topo. I dati qui presentati illustrano la nuova fattibilità di questi importanti esperimenti da condurre.

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Disclosures

Il Dr. Gold stava ricevendo sovvenzioni da Grunenthal durante lo sviluppo di questa preparazione. Non c'è stata alcuna sovrapposizione tra il focus dello studio di Grunenthal e la preparazione descritta in questo manoscritto. Nessuno degli altri autori ha altri potenziali conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare i dottori Kathy Albers e Brian Davis per l'uso del loro microscopio Leica e del programma Metamorph, Charles Warwick per aver contribuito a costruire il nostro dispositivo termico Peltier e il dottor Raymond Sekula per aver contribuito alla risoluzione dei problemi della preparazione chirurgica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) e R01NS122784 (MSG e RS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

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References

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Neuroscienze Numero 204
<em>In Vivo</em> Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto
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Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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