Etablierung eines ex vivo Lungenperfusionsmodells an Ratten für translationale Einblicke in die Lungentransplantation

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Etablierung eines Ratten-EVLP-Modells und zeigen das Entzündungsprofil, das mit der perfundierten Lunge assoziiert ist. Ziel ist es, das Wissen und die Erfahrungen über das EVLP-Modell von Ratten zu verbreiten und so ein ganzheitliches Verständnis der biologischen Reaktionen zu ermöglichen, die mit dieser revolutionären Technik verbunden sind.

Zusammenfassung

Seit der Etablierung der Lungentransplantation als therapeutische Strategie für fortgeschrittene Lungenerkrankungen steht die wissenschaftliche Gemeinschaft vor dem Problem, dass nur eine geringe Anzahl von Lungen für den Spendeprozess als geeignet angesehen wird. In den letzten Jahrzehnten hat sich dieses Szenario jedoch positiv verändert, da sich die ex vivo Lungenperfusion (EVLP) als Strategie zur Bewertung und Rekonditionierung marginaler Lungen entwickelt hat. Die Etablierung von EVLP in großen Transplantationszentren hat zu einer Erhöhung der Anzahl von Lungentransplantationen geführt, sowohl durch die Erhöhung der diagnostischen Genauigkeit der Lungenfunktion als auch durch die Schaffung einer effektiven Plattform für die Rekonditionierung von Lungentransplantaten. In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung von EVLP-Modellen für Nagetiere angesichts ethischer und logistischer Fragen sowie bei der Untersuchung immunologischer Faktoren im Zusammenhang mit Lungentransplantationen aufgrund ihrer Zuverlässigkeit, der Möglichkeit der genetischen Manipulation und der geringeren Kosten wichtig geworden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Etablierung eines EVLP-Modells an Ratten und zeigt das Entzündungsprofil, das mit der perfundierten Lunge assoziiert ist. Dies wird dazu beitragen, das Wissen über das EVLP-Modell der Ratte zu verbreiten und unser Verständnis der biologischen Reaktionen zu fördern, die mit dieser revolutionären Technik verbunden sind.

Einleitung

Die Lungentransplantation hat sich in den letzten Jahrzehnten als therapeutische Strategie für Erkrankungen im Endstadium erwiesen und die chirurgischen Methoden und die Immunsuppression verbessert. Trotz der hohen Nachfrage ist die Anzahl der akzeptablen verstorbenen Lungenspender geringer als bei anderen soliden Organen, was zu einer geringeren Anzahl von Lungentransplantationen führt ^1,2,3. Um dem Mangel an Spendern entgegenzuwirken, hat die medizinische Gemeinschaft die Kriterien für die Lungenspende erweitert und Organe, die bisher als nicht lebensfähig galten, in potenzielle Organe für eine Transplantation umgewandelt. Die erweiterten Kriterien erfordern jedoch unterschiedliche Anstrengungen zum besseren Verständnis und Eingreifen im Hinblick auf die möglichen systemischen Folgen, die vom gespendeten Organ ausgehen. Die Ex-vivo-Lungenperfusion (EVLP) hat sich als eine Technik herausgestellt, die die normotherme Lungenerhaltung, die Beurteilung der Lungenfunktionen und die Rekonditionierung der Lunge ermöglicht, die zuvor für den Spendeprozess als nicht durchführbar galt ^4,5,6.

Angesichts der wachsenden Zahl von Lungentransplantationen seit der Etablierung von EVLP in großen Transplantationszentren werden zunehmend Strategien zur Erhaltung und Reparatur der Lunge untersucht. In diesem Sinne ist die Entwicklung von EVLP-Modellen für Nagetiere angesichts ethischer und logistischer Fragen sowie bei der Untersuchung immunologischer Faktoren im Zusammenhang mit Lungentransplantationen aufgrund ihrer Zuverlässigkeit, der Möglichkeit der genetischen Manipulation und der geringeren Kosten wichtig geworden ^7,8,9. Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Etablierung eines EVLP-Modells an Ratten und zeigen das Entzündungsprofil, das mit der perfundierten Lunge verbunden ist.

Protokoll

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem vom Animal Care Committee des Universitären Gesundheitsnetzwerks genehmigten Animal Use Protocol durchgeführt. Männliche Lewis-Ratten (255-330 g) erhielten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Anschließend wurden sie in einer kontrollierten Umgebung (18-22 °C) mit einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus gehalten. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Lösungen und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Initialisierung des ex vivo Lungenperfusionssystems

1. Stellen Sie sicher, dass alle Schallköpfe an die isolierte Perfusionsorganausrüstung und das Datenerfassungssystem angeschlossen sind (Abbildung 1). Öffnen Sie dann die Datenerfassungssoftware.
2. Füllen Sie den EVLP-Kreislauf vor der Perfusion mit 150 ml Steen-Lösung, ergänzt mit 1.000 USP-Einheiten Natriumheparin, 50 mg Cefazolin und 50 mg Methylprednisolon.
3. Stellen Sie das warme Wasserbad auf 20 °C ein. Beginnen Sie mit der Zirkulation von warmem Wasser, um das gesamte EVLP-System aufzuwärmen.

2. Verfahren zur Entnahme der Spenderlunge

1. Betäuben Sie die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) oder gemäß der örtlichen Praxis. Bestätigen Sie die richtige Anästhesietiefe, indem Sie den Zehenquetschreflex überprüfen.
2. Führen Sie eine orotracheale Intubation durch (14 G intravenöser Katheter). Verbinden Sie nach der Intubation den Trachealtubus mit dem Beatmungssystem für Kleintiere. Beatmung der Ratte mit einem Atemzugvolumen von 10 ml/kg, einer Frequenz von 60 Atemzügen/min, einem eingeatmeten Sauerstoffanteil (FiO₂) von 0,5 und einem positiven exspiratorischen Enddruck (PEEP) von 2 cmH₂O.
3. Bringen Sie die Ratte in Rückenlage.
4. Mit Hilfe einer entsprechenden Schere und Pinzette wird die Bauchhöhle betreten und der Schnitt kranial durchgeführt, wobei eine mediane Laparotomie durchgeführt und Natriumheparin (400 USP-Einheiten) in die Pfortader injiziert wird.
5. Anschließend gelangen Sie durch den Xyphoid-Prozess in die Brusthöhle. Führen Sie die Sternotomie mit der kranialen Resektion des Brustbeins und einer vorsichtigen radialen Öffnung des Zwerchfells durch, um die Lunge nicht zu schädigen.
6. Um den Herz- und Lungenblock zu entfernen, machen Sie einen Schnitt in der unteren Hohlvene (IVC) und entlang der Spitze des linken Herzens.
7. Führen Sie mit einer Mikroschere einen vorderen Schnitt im rechtsventrikulären Ausflusstrakt durch. Führen Sie dann einen intravenösen 18-G-Katheter in den Lungenstamm ein und spülen Sie die Lunge mit 20 ml kaliumarmer Dextranlösung (LPD), die 10 μg/ml Prostaglandin E1 enthält.
8. Unmittelbar nach dem Spülen klemmen Sie das untere Drittel der Luftröhre am Ende der Einatmung ein, um die Lunge in einem aufgeblähten Zustand zu halten.
9. Entnehmen Sie den Herz- und Lungenblock und legen Sie ihn zur Lagerung in LPD-Lösung.
   HINWEIS: Das Lungentransplantat kann je nach Forschungszweck bei Temperaturen und unterschiedlichen Zeitabständen gelagert werden. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse von Lungen, die unterschiedlich lange kalte ischämische Zeit (CIT) auf Eis durchlaufen haben.

3. Ex-vivo-Verfahren der Lungenperfusion

1. Platzieren Sie eine 0-Seiden-Ligatur unter der Hauptpulmonalarterie (PA) und um die Ventrikel herum und binden Sie sie, um die Kanülierung zu erleichtern.
2. Schließen Sie die PA-Kanüle an die Zuflussleitung des EVLP-Systems an und starten Sie die Peristaltikpumpe mit 10 % des Erhaltungsflusses, so dass die Luft aus der PA-Kanüle entfernt werden kann.
3. Platzieren und fixieren Sie die Zulaufkanüle in die Haupt-PA (AD: 2,0 mm/Kopfdurchmesser: 2,5 mm), gefolgt von der Drainagekanüle von der Herzspitze in den linken Vorhof (LA-Kopfdurchmesser: 4,0 mm) durch die Mitralklappe für die anschließende Perfusion. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mitralklappe zu erweitern und so die Kanülierung zu erleichtern.
4. Machen Sie ein kleines Loch in die Luftröhre und führen Sie die Trachealkanüle ein (AD: 2,0 mm/L: 14 mm). Schließen Sie es dann an die Lüftungsleitung des Systems an.
5. Verbinden Sie die LA-Kanüle mit der Abflussleitung des Systems.
6. HINWEIS: Wir legen 10 % des Erhaltungsflusses als Beginn der Perfusion fest. Um das Eindringen von Luftblasen in die Lunge zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Blasenfalle gefüllt ist.
7. Erhöhen Sie die Durchflussrate allmählich auf 20 % des Herzzeitvolumens (CO).
   HINWEIS: Um beide Lungen zu perfundieren, verwendeten wir einen geschätzten CO von 75 ml/min für 250 g Ratten^10,11. Die Flussrate der Perfusion wurde schrittweise auf 1 h erhöht, um die Zielflussrate gemäß unserem klinischen EVLP-Protokoll¹² zu erreichen. Die Perfusionsparameter sind in Tabelle 1¹³ zusammengefasst.
8. Entfernen Sie die Trachealklemme 20 Minuten nach Beginn der Perfusion und beginnen Sie mit der Lungenventilation, gefolgt von einem Start des EVLP-Gasflusses (8 % CO₂, 6 % O₂, 86 % N₂), um den Zufluss von Perfusat PCO₂ zwischen 35 und 45 mmHg aufrechtzuerhalten.
   HINWEIS: Die Lüftungsparameter sind in Tabelle 1¹³ zusammengefasst.

4. Parameter und Probenmanagement

1. Zeichnen Sie während der EVLP stündlich in Echtzeit die dynamische Lungencompliance und den pulmonalen Gefäßwiderstand (PVR) auf.
   HINWEIS: 5 Minuten vor den physiologischen Untersuchungen sollte die Lunge auf einen Aufblasdruck ausgedehnt werden.
2. Stündlich werden Perfusatproben aus dem Probenanschluss entnommen und für weitere Analysen in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
   HINWEIS: Zusätzlich führen wir 5 Minuten vor der Beurteilung ein Rekrutierungsmanöver (bis zu 20 cmH₂O) durch, wonach wir Perfusate für Blutgasanalysen zur Messung von pH, PCO₂, PO₂, Elektrolyten, Glukose und Laktat entnehmen.
3. Stoppen Sie die Durchblutung und klemmen Sie die Luftröhre ab, um die Lunge in einem aufgeblähten Zustand zu halten. Isolieren Sie anschließend Lungenproben und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein oder legen Sie sie für weitere Studien in Fixierlösungen.
   HINWEIS: Hier wurde die Lunge für 4 h perfundiert.

Ergebnisse

Alle Lungen mit CIT im Bereich von 20 min bis 18 h konnten für 4 h perfundiert werden (Abbildung 2)¹³. Die Compliance war in den meisten Gruppen stabil, mit Ausnahme der 18-stündigen CIT, die während der 4-stündigen Perfusionsperiode allmählich abnahm (Abbildung 2A). Trotzdem wurden für die Gruppen keine signifikanten Unterschiede im Gefäßwiderstand, der Sauerstoffversorgung des Lungentransplantats und de...

Diskussion

In dieser Studie wurden die notwendigen Schritte zur Erstellung eines EVLP-Protokolls für Ratten beschrieben. Hier zeigen wir, dass Spenderlungen nach einer kalten statischen Konservierung von bis zu 18 h bei 4 °C für 4 h perfundiert werden können. Dies wurde durch die Beurteilung der Lungencompliance, des pulmonalen Gefäßwiderstands, der Perfusatglukose/Laktatkonzentration und des P/F-Verhältnisses nachgewiesen.

Der Aufstieg der EVLP-Plattform als wichtiges ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
14 g intravenöser Katheter	BD	381167	Orotracheale Intubation
16 g intravenöser Katheter	BD	381157	Katheter zum Spülen der Lunge
2-0 Suture Sofsilk	Covidien	S-305	Trachealrohrfixierung
3-0 Naht Sofsilk	Covidien	S303	Fixierung von Arterien- und Vorhofkanülen
IPL-2-Kern isoliertes perfundiertes Lungensystem für Ratten	Harvard-Apparat	734276	Ex-vivo-Lungenperfusionssystem (EVLP)
Ketamin (Narketan)	Vetoquinol	440894	Sedierung/Anästhesie
Große Lungenarterienkanüle;	Harvard-Apparat	73-0711
Linke Vorhofkanüle	Harvard-Apparat	73-0712
Low-Potassium-Dextran-Glukoselösung (Perfadex)	XVIVO	19811	Erhaltungslösung
Methylprednisolon-Natriumsuccinat (SOLU-MEDROL)	Pfizer	14705	Entzündungshemmende
Prostaglandin E1 (Prostin VR)	Pfizer	RX297945
Beatmungsgerät für kleine Tiere (Modell 683)	Harvard-Apparat	55-0000
Natriumheparin	Leo Pharma	453811
Steen-Lösung	XVIVO	19004	Gepufferte extrazelluläre Lösung zur Perfundation der Lunge während EVLP
Sugita Aneur Clip Curv	Mizuho	07-940-86	Trachealklemme
Trachealkanüle	Harvard-Apparat	73-3384
Xylazin (Rompun)	Bayer Healthcare	2169592	Sedierung/Anästhesie