Vakuumforcierte Agroinfiltration zur In-planta-Transformation widerspenstiger Pflanzen: Kakao als Fallstudie

Zusammenfassung

Hier stellen wir das erste Protokoll für die lokalisierte Vakuuminfiltration für in vivo-Studien zur genetischen Transformation von Großpflanzen vor. Mit dieser Methodik haben wir zum ersten Mal die Agrobacterium-vermittelte transiente Transformation von Kakao erreicht.

Zusammenfassung

Die transiente in planta-Transformation ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zur pflanzengenetischen Transformation. Die meisten Protokolle für die In-planta-Transformation basieren auf der Verwendung von Agrobacterium-vermittelter Transformation. Die derzeit verwendeten Protokolle sind jedoch aufgrund der physikalischen und wirtschaftlichen Einschränkungen, die mit einer Vakuumbehandlung verbunden sind, für kleine Anlagen standardisiert. Diese Arbeit stellt ein effektives Protokoll für die lokalisierte vakuumbasierte Agroinfiltration vor, das auf große Pflanzen zugeschnitten ist. Um die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Methode zu bewerten, testeten wir ihre Anwendung in Kakaopflanzen, einer tropischen Pflanzenart, die gegen genetische Transformation resistent ist. Unser Protokoll ermöglichte es, ein Vakuum von bis zu 0,07 MPa mit Wiederholungen auf einen lokalisierten oberirdischen Teil der Kakaoblätter anzuwenden, wodurch es möglich wurde, die Infiltration von Agrobacterium in die Interzellularräume der anhaftenden Blätter zu erzwingen. Als Ergebnis erreichten wir die Agrobacterium-vermittelte transiente in planta-Transformation von anhaftenden Kakaoblättern, die für das RUBY-Reportersystem exprimiert werden. Dies ist auch die erste Agrobacterium-vermittelte transiente Umwandlung von Kakao in planta . Dieses Protokoll würde die Anwendung der vakuumbasierten Agroinfiltrationsmethode auf andere Pflanzenarten mit ähnlichen Größenbeschränkungen ermöglichen und die Tür für die In-planta-Charakterisierung von Genen in widerspenstigen holzigen, großformatigen Arten öffnen.

Einleitung

Pflanzengenetische Transformationsmethoden sind unerlässlich, um die biologischen Funktionen von Genen zu testen, und sind heute besonders nützlich angesichts der großen Anzahl uncharakterisierter Gene, die in der postgenomischen Ära^{vorhergesagt wurden 1}. Diese Methoden können verwendet werden, um vollständig transformierte Linien zu erhalten oder Gene vorübergehend zu exprimieren. Eine stabile Transformation tritt auf, wenn die fremde DNA, die der Wirt aufgenommen hat, vollständig und irreversibel in das Wirtsgenom integriert wird und die genetischen Veränderungen an nachfolgende Generationen weitergegeben werden. Die vorübergehende Expression....

Protokoll

1. Agrobacterium tumefaciens-Kultur

1. Elektrokompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 auftauen.
2. Fügen Sie 1 ml Hefemalz (YM; Tabelle 1) Brühe in ein 17 mm x 100 mm großes Kulturröhrchen. Bewahren Sie dieses Röhrchen für später auf und bewahren Sie es bei Raumtemperatur (RT) auf.
3. In ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen 30 μl der aufgetauten Agrobacterium-Zellen und 100-250 ng (bis zu 5 μl) der DNA mit 35S:RUBY geben. Vorsichtig mischen.
   HINWEIS: Der 35S:RUBY war ein Geschenk von Yunde Zhao. Um Probenlichtbögen zu vermeiden, reduz....

Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt eine effektive Agroinfiltrationsmethode für große Gehölze dar. Mit diesem Protokoll konnten wir einen Vakuumdruck von -0,07 MPa erreichen, was zu einer effektiven, lokalisierten Infiltration von Kakaoblättern führte. In Abbildung 4 sehen wir den Einrichtungsprozess des Infiltrationssystems und in Abbildung 5 die endgültige Konfiguration.

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir ein effizientes, kostengünstiges Agroinfiltrationsprotokoll für die transiente Transformation von Gehölzen in planta am Beispiel von Kakaopflanzen vorgestellt. Angesichts der bekannten Einschränkung, die die Kutikula von Blättern für die Transformation von Pflanzengewebe darstellt, konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer Strategie zur Erleichterung der Agroinfiltration durch Vakuum bei Gehölzen, die diesem Verfahren normalerweise widerspenstig gegenüberstehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35S:RUBY Plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm Elektroporationsküvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand  Elektroporationsküvetten plus
Exsikkator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Gefriertrockner	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	Für YM-Medium 0,38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	Für YM-Medium 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(Für LB, YM und Resuspensionsmedium) 1,95 g/L (10 mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	Für Resuspensionsmedium 0,952 g/L (10 mM) hinzufügen
MgSO4· 7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	Für YM-Medium fügen Sie 0,204 g/L
MicroPulser Elektroporationsgerät	hinzu Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	Für LB Medium 5 g/L zugeben; Für YM-Medium fügen Sie 0,1 g/L
NanoDrop hinzu, ein Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silikon Abformmaterial	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg / ml)
Silikon Abdruckpistole	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg / ml)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg / ml)
Enzymatischer Trypton-Aufschluss aus Kasein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	Für LB-Medium fügen Sie 10 g / l
Hefe hinzu Extrakt	MCD LAB	9031	Für LB-Medium 5 g/L hinzufügen; Für YM-Medium 0,4 g/L hinzufügen

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