Mikro-Computertomographie-Analyse des Knies bei gealterten Dunkin-Hartley-Meerschweinchen nach intraartikulärer Injektion

32,5 Millionen Erwachsene in den USA sind von Osteoarthritis (OA) betroffen. Sie wird durch einen fortschreitenden Verlust des Gelenkknorpels, eine leichte Entzündung des Gewebes in und um die Gelenke und die Bildung von Osteophyten und Knochenzysten verursacht ^1,2. Die Symptome manifestieren sich typischerweise in den späteren Stadien der Krankheit, wobei die derzeitigen Behandlungen nur palliative Linderung bieten und systemische Nebenwirkungen haben. Der Mangel an krankheitsmodifizierenden Medikamenten ist auf ein mangelndes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Krankheit zurückzuführen³. Infolgedessen besteht ein kritischer und anhaltender medizinischer Bedarf an verbesserten Wirkstoffen zur Behandlung von OA.

Es stehen mehrere Tiermodelle von OA zur Verfügung, die verschiedene Komponenten der Krankheitsprozesse untersuchen⁴. Es gibt zwar mehrere chirurgische Modelle, darunter die Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes und die Destabilisierung des Innenmeniskus, diese sind jedoch invasiv und erfordern ein hohes Maß an technischer Kompetenz⁵. Chemisch induzierte Modelle sind vergleichsweise weniger invasive Verfahren, die typischerweise zur Untersuchung von OA-Schmerzmechanismen eingesetzt werden⁶. Eines dieser weit verbreiteten Mausmodelle beinhaltet die OA-Induktion durch eine intraartikuläre Knieinjektion von Mononatriumiodacetat (MIA). Dieses Modell erzeugt einen reproduzierbaren, robusten und schnellen schmerzähnlichen Phänotyp, der durch Änderung der MIA-Dosierung⁷ abgestuft werden kann. Die technischen Einzelheiten der Induktion dieses Modells wurden bereits beschrieben⁷. Die Übertragung dieser Technik auf größere Nagetiere, wie z. B. Meerschweinchen, ist aufgrund ihrer anatomischen Unterschiede schwierig. Zu den Unterschieden gehören eine erhöhte Muskulatur um die angrenzenden Knochen und den Gelenkraum beim Meerschweinchen sowie eine artikulierende Fibula und Tibia im Vergleich zur distalen Fusion, die bei Mäusen beobachtet wurde⁸. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen, ein weit verbreiteter Meerschweinchenstamm, sind ein etabliertes OA-Tiermodell, da sie diese Krankheit auf natürliche Weise entwickeln, und bieten damit ein robustes Modell für die Untersuchung der Auswirkungen neuartiger Therapeutika, die durch intraartikuläre Injektion verabreicht werden, auf das Fortschreiten der Krankheit⁹. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen beginnen mit der Entwicklung von OA im Alter von drei Monaten, wobei die Männchen eine beschleunigte Entwicklung und einen schwereren Phänotyp¹⁰ aufweisen. Bei Meerschweinchen schreitet die Arthrose mit dem Alter fort, und nach 12 Monaten ist die damit verbundene Pathologie in der Bildgebung erkennbar¹¹. Spontane OA-Modelle, wie das Dunkin-Hartley-Modell, erfordern keine Intervention, um OA zu induzieren und somit die Entwicklung und das Fortschreiten des Krankheitsphänotyps beim Menschen zu rekapitulieren, wodurch ein leistungsfähiges translationales Modell bereitgestellt^{wird 10}. Darüber hinaus ermöglicht die spontane Entwicklung von OA die interne Kontrolle, wenn neuartige Therapeutika einseitig in einem einzelnen Knie eines bestimmten Tieres verabreicht werden. Diese interne Kontrolle minimiert die Auswirkungen von Variabilitäten zwischen den Tieren bei der Datenanalyse und kann dazu beitragen, die Gesamtzahl der Tiere zu reduzieren.

Die Röntgen-Mikro-Computertomographie (μCT) ist ein leistungsstarkes Instrument, das eine quantitative Beurteilung des OA-Schweregrads¹² ermöglicht. Bei der μCT werden mehrere hochauflösende Röntgenbilder abgetastet, die von einer rotierenden Probe oder einer rotierenden Röntgenquelle und einem rotierenden Röntgendetektor¹³ gewonnen wurden. Dann werden dreidimensionale (3D) volumetrische Daten in Form von gestapelten Bildscheiben¹⁴ rekonstruiert. Da mineralisierter Knochen im μCT einen hervorragenden Kontrast aufweist, kann diese Modalität zur Beurteilung von 3D-Merkmalen und zur Durchführung quantitativer Analysen von Veränderungen im Zusammenhang mit OA verwendet werden 15,16,17. μCT bietet mehrere Vorteile gegenüber weiter verbreiteten Werkzeugen, einschließlich der Histopathologie und der Ganganalyse. Im Gegensatz zur histologischen Beurteilung eines oder weniger Gewebeabschnitte wird bei der μCT das gesamte Gelenk gescannt und eine ganzheitlichere Beurteilung von OA-Läsionen^{ermöglicht 18}. Während die Ganganalyse symptomatische Veränderungen der Gelenkfunktion im Laufe der Zeit erkennen kann, entwickeln sich Gelenkveränderungen lange vor den funktionellen Veränderungen, die mit OA verbunden sind. Die μCT kann ein sensitiveres Maß für die OA-Entwicklung vor dem Auftreten von Lahmheiten liefern. Zwei besonders relevante quantitative Messungen sind die Knochenmineraldichte und die Trabekeldicke, da beide im Laufe der Progression von OA zunehmen^19,20. Es kann hilfreich sein, die Analyse in subchondrale Platte und trabekulären Knochen aufzuteilen, da sie unterschiedliche Merkmale aufweisen, um robustere Messungen und Vergleiche zu erhalten.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Forschern dabei zu helfen, intraartikuläre Injektionen bei Meerschweinchen erfolgreich durchzuführen. Das vorgestellte Protokoll verwendete fünf (n=2), neun (n=1) und 12 (n=2) alte, männliche Dunkin-Hartley-Meerschweinchen; Die Verfahren können auf andere Meerschweinchenstämme und Altersgruppen extrapoliert werden, die intraartikuläre Knieinjektionen erfordern. In spontanen Modellen der Arthrose, wie dem Dunkin-Hartley-Modell, werden das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf die serielle Behandlung oft über lange Zeiträume von Wochen bis Monaten überwacht⁹. Dieses erweiterte Protokoll führt zu mehreren intraartikulären Injektionen, und daher ist es wichtig, über die richtige Injektionstechnik zu verfügen, um unerwünschte Ereignisse wie Schmerzen, Lahmheiten oder Infektionen zu verhindern, die sich alle auf das Wohlergehen der Tiere auswirken und die Studienergebnisse verfälschen können, während zusätzliche Tiere in der Studie erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methodik der intraartikulären Injektionen bei Meerschweinchen und die anschließende Analyse der μCT-Daten.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt. Die Studie folgte dem Prinzip der 3R.

1. Intraartikuläre Injektionspräparate

1. Lassen Sie die Dunkin-Hartley-Meerschweinchen mindestens eine Woche lang vor Beginn des Versuchs an der Einrichtung akklimatisieren.
   HINWEIS: Es wurden 5- (n=2), 9- (n=1) und 12 (n=2) alte männliche Meerschweinchen verwendet. Männchen zeigen eine beschleunigte Entwicklung und einen schwereren Phänotyp der OA.
2. Rasieren Sie die Kniepartie mit einem Elektrorasierer.
   HINWEIS: Achten Sie auf die Brustwarzen in der Mitte.
3. Anästhesieren Sie Meerschweinchen in einer Isoflurankammer, die 3-5 % Isofluran in einem_O2-Gemisch liefert (Durchflussrate 2,5 l/min), und übertragen Sie dann das Meerschweinchen in einen Nasenkonus, der an einen nicht rückatmenden Anästhesiekreislauf angeschlossen ist. Passen Sie das Isofluran an, um die chirurgische Anästhesieebene während der Injektion aufrechtzuerhalten, typischerweise mit einer Sauerstoffflussrate von 0,5-1 l/min und 1-3% Isofluran.
   HINWEIS: Intraartikuläre Injektionen verursachen leichte, vorübergehende Schmerzen. Die Tiere werden während des Eingriffs betäubt, um die Wahrnehmung schmerzhafter Reize zu verhindern und die Injektionsgenauigkeit zu verbessern. In der vorliegenden Studie würde die Verabreichung von Analgetika, einschließlich nichtsteroidaler entzündungshemmender Medikamente, die Progression der Arthrose beeinträchtigen²¹. Aufgrund der vorübergehenden Schmerzen, der verabreichten Anästhesie und des Potenzials von Analgetika, das Modell zu verwirren, wurden Analgetika nicht verabreicht, es sei denn, die Tiere zeigten Nebenwirkungen, einschließlich Hinken und Anzeichen von Schmerzen beim Abtasten der Gelenke nach der Injektion. Prüfärzte sollten die Verwendung von Analgetika für routinemäßige Injektionen in Betracht ziehen. Analgetika werden empfohlen, wenn Nebenwirkungen auftreten. Analgetika sollten vor Beginn der Studien mit dem institutionellen Tierarzt besprochen und von der IACUC genehmigt werden.
4. Stellen Sie sicher, dass das Meerschweinchen eine angemessene Anästhesietiefe hat, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren.
5. Tragen Sie steriles Augengleitmittel auf beide Augen auf, um Austrocknung und Verletzungen zu verhindern.
6. Betadin mit sterilem Wasser auf 10% verdünnen.
7. 200er Ethanol mit sterilem Wasser auf 70% Ethanol verdünnen.
8. Bereiten Sie Injektionslösungen in einer Biosicherheitswerkbank vor, um die Sterilität zu erhalten. Im vorliegenden Protokoll wurde ein steriles Vehikel (1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung) verwendet, um beide Knie zu injizieren. Lösungen können je nach Forschungszielen geändert werden.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, frische Injektionslösungen unmittelbar vor der Injektionssitzung zu verdünnen, um die Sterilität zu gewährleisten. Nicht verwendete Lösungen sollten am Ende jeder Injektionssitzung verworfen werden.
9. Sterile Einmal-Insulinspritzen mit Injektionslösungen füllen. Achten Sie darauf, das geringstmögliche Volumen zu nutzen, um eine Überlastung des Gelenkraums mit Volumen zu vermeiden. In der vorliegenden Studie wurden 50 μL verwendet.
10. Legen Sie Meerschweinchen und Nasenkegel auf eine saubere Oberfläche mit einem Heizkissen zur thermischen Unterstützung und einer Polsterung unter dem Kopf, um ihn leicht anzuheben.
11. Ziehen Sie während des Injektionsvorgangs einen OP-Kittel, ein Haarnetz, sterile Handschuhe und eine Maske an.
12. Gießen Sie 10% Betadin auf einen Wattebausch und wischen Sie beide Kniebereiche ab.
13. Gießen Sie 70% Ethanol auf einen Wattebausch und wischen Sie beide Kniebereiche ab.
14. Wiederholen Sie 1.12 und 1.13 noch zweimal.
    HINWEIS: Zu Demonstrationszwecken zeigt das entsprechende Video die einmalige Reinigung des Knies und der Injektionsstelle mit 10 % Betadin und 70 % Ethanol. Die Injektionsstelle wurde anschließend zwei weitere Male mit kreisenden Bewegungen gereinigt, wobei diese Lösungen abwechselten. Drei serielle Peelings mit abwechselnden Peelinglösungen und Alkohol werden empfohlen, um eine aseptische Technik zu erreichen.

2. Intraartikuläre Injektion

1. Bringen Sie das Meerschweinchen während des gesamten Eingriffs in Rückenlage.
2. Ziehen Sie ein neues Paar sterile Handschuhe an und tasten Sie das Kniegelenk ab.
   HINWEIS: In dem vorgestellten Protokoll und Video wurden autoklavierte Nitrilhandschuhe verwendet. Für die aseptische Technik sollten sterile Handschuhe, einschließlich autoklavierter Nitrilhandschuhe oder chirurgischer Handschuhe, verwendet werden.
3. Beugen Sie das Knie manuell um 90°.
4. Bewegen Sie den Finger distal zur Patella, um die Rille des distalen Aspekts des Gelenkspalts zu lokalisieren, indem Sie die Hintergliedmaße beugen und strecken.
   HINWEIS: Die Patella kann in dieser Position als kleines, festes Gebilde, das sich direkt über dem Gelenkraum befindet, ertastet werden. Die Tibia ist als knöcherne Struktur distal der Kniescheibe zu spüren. Sobald die Lage der Tibia und der Patella bestimmt ist, befindet sich das Gelenk, das als Rille empfunden wird, zwischen ihnen, distal der Patella und proximal der Tibia.
5. Führen Sie die Insulinnadel vorsichtig auf der Mittellinie distal der Patella im Gelenkspalt ein. Die Nadel sollte 1-2 mm unterhalb der Haut eingeführt werden, um in den Gelenkspalt einzudringen.
   HINWEIS: Das größte Zugangsfenster für den Gelenkspalt bei gebeugtem Knie befindet sich auf der vorderen Seite der Extremität auf der Mittellinie, direkt distal der Patella. Die Injektion auf der Mittellinie in anterior-posterior-Richtung hilft bei der präzisen Injektion in den Gelenkraum, ohne knöcherne Strukturen zu durchdringen. Eine präzise Injektion in den Gelenkspalt kann mit einem lateralen bis medialen Zugang erreicht werden, obwohl das Zugangsfenster insbesondere bei gebeugtem Knie enger ist.
6. Injizieren Sie 50 μl der Lösung langsam in das Gelenk. Stellen Sie sicher, dass die Nadel leicht einsticht und der Inhalt ohne Widerstand injiziert wird.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu tief einzuführen, da dies Gelenk- oder Knochenschäden verursachen und zu unerwünschten Entzündungen und/oder Schmerzen führen kann. Wenn die Furche, die dem Gelenkspalt entspricht, nicht gefunden wird, könnte die Nadel den Oberschenkelknochen, die Patella oder das Schienbein durchdringen. Daher ist es von Vorteil, die dem Gelenkspalt entsprechende Rille sicher abzutasten, um periartikuläre Injektionen oder Verletzungen im Zusammenhang mit dem Eindringen in knöcherne Strukturen zu vermeiden. Wenn sich an der Injektionsstelle unter der Haut eine Blase bildet, war die Injektion zu flach und die Flüssigkeit ist in den Unterhautraum gelangt. Abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Mittels kann das Arzneimittel durch Diffusion in den Gelenkspalt gelangen, oder ein weiterer Injektionsversuch kann erforderlich sein.
7. Wenn du fertig bist, wirf die Nadel in den Behälter für scharfe Gegenstände.
   HINWEIS: Zu Übungs- und Schulungszwecken injizieren Sie Flüssigkeit, die einen Farbstoff enthält, in den Gelenkspalt eines Leichnachers oder Meerschweinchens ähnlicher Größe. Präparieren Sie dann das Gelenk, um die Position der Injektion zu bestätigen.
8. Massieren Sie das Knie, indem Sie das Gelenk einige Male beugen und strecken, um die Diffusion des Arzneimittels im Gelenkraum zu fördern.
9. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 einmal an der kontralateralen Extremität mit 1x PBS-Lösung.

3. Genesung von der intraartikulären Injektion

1. Schalten Sie Isofluran aus und halten Sie den Sauerstofffluss zu 100 % aufrecht, bis das Tier wieder zu Bewusstsein kommt.
2. Legen Sie das Tier bis zur Ambulanz auf ein Heizkissen zur thermischen Unterstützung.
3. Tragen Sie 30 s lang einen Eisbeutel auf das Knie auf, mit einem Papiertuch als Barriere, um die Schwellung durch die Injektion zu verringern.
4. Beurteilen Sie den Gang der Tiere im ambulanten Zustand, bevor Sie sie in den Stall zurückbringen.
   HINWEIS: Wenn Ganganomalien festgestellt werden, können Analgetika und unterstützende Behandlung gerechtfertigt sein. Es ist ratsam, ihren Gang einige Stunden nach der Genesung von der Narkose erneut zu beurteilen, um eine normale Beweglichkeit zu gewährleisten.

4. Mikro-Computertomographie (μCT) Scan

1. Für die Gewebeentnahme wird eine chirurgische Anästhesieebene mit einer Mischung aus 100 % Sauerstoff und 5 % Isofluran eingerichtet.
2. Bestätigen Sie eine chirurgische Anästhesieebene mit fehlender Reaktion auf einen Zehenkneifreiz. Euthanasieren Sie das Tier auf humane Weise durch intravenöse Verabreichung von ≥ 150 mg/kg Pentobarbital gemäß den institutionellen Richtlinien und dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll.
   HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll erhielt jedes der fünf Meerschweinchen eine Injektion in beide Knie. Die Tiere wurden eine Woche nach der Injektion betäubt und auf humane Weise eingeschläfert.
3. Entnehmen Sie beide Hintergliedmaßen, indem Sie die Haut von der umgebenden Muskulatur wegpräparieren.
4. Als nächstes disartikulieren Sie die Hintergliedmaße mit Rongeurs in der Mitte des Oberschenkelknochens und proximal zum Knöchel.
   HINWEIS: Das verwendete Scanbett und der Probenhalter waren nicht in der Lage, die gesamte Hintergliedmaße eines erwachsenen Meerschweinchens aufzunehmen. Für größere Probengrößen sind große Probenhalter im Handel erhältlich.
5. Legen Sie das Gewebe für 72 Stunden zur Fixierung in eine neutral gepufferte Formalinlösung, bevor Sie die μCT durchführen.
6. Öffnen Sie die μCT-Scansoftware und legen Sie die Probe mit Formalin in einen kompatiblen Behälter, der in die μCT-Probenmappe passt, während das Gewebe im Sichtfeld bleibt.
7. Kalibrieren Sie das μCT-Gerät für Dunkelfeld- und Lichtfeld-Aufnahmen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
8. Scannen Sie die Probe mit einem Al+Cu-Filter bei 18 μm. Verwenden Sie den Rotationsschritt 0,7° für 360° mit der Offset-Kamera.
   HINWEIS: Der Scan wird automatisch gespeichert.

5. Bildverarbeitung zur Bewertung von mikroarchitektonischen Parametern des Knochens

1. Laden Sie die μCT-Rekonstruktionssoftware für die Rekonstruktion von μCT-Bildern herunter und installieren Sie sie.
2. Wählen Sie den Softwareordner aus und doppelklicken Sie, um die Software zu öffnen.
3. Wählen Sie eine Schicht aus den μCT-Bildern aus, indem Sie auf eine Bildscheibe klicken.
4. Wählen Sie das Ziel der Rekonstruktionsdatei aus. Wählen Sie Durchsuchen aus, und erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen Recon. Das gewählte Dateiformat sollte BMP(8) sein.
5. Überprüfen Sie die Kompensation von Fehlausrichtungen.
   HINWEIS: Normalerweise ist die Schätzung nahezu korrekt, aber sie kann manuell angepasst werden, um die überlappenden Bilder so zu verschieben, dass der rechte und der linke Rand so genau wie möglich ausgerichtet sind.
6. Wenden Sie unter Einstellungen die Algorithmen Glättung, Strahlhärtung, CS-Rotation und Ringartefakte an.
   HINWEIS: Es kann hilfreich sein, das Vorschaubild auszuwählen, um die Klarheit vor der Rekonstruktion zu bestimmen. Die Feinabstimmung kann auch hilfreich sein, um zu bestimmen, welche Einstellungen am besten geeignet sind.
7. Wählen Sie Start aus, um mit der Verarbeitung der Rekonstruktion zu beginnen.

6. Sammlung mikroarchitektonischer Daten aus rekonstruierten Bildern

1. Laden Sie Dataviewer herunter und installieren Sie es.
2. Wählen Sie VOI und richten Sie die Probe so aus, dass sie vertikal ausgerichtet wird, um die Analyse zu einem späteren Zeitpunkt zu erleichtern.
3. Speichern Sie das bearbeitete VOI als neuen Ordner.
4. Laden Sie den CTAnalyser für die Analyse der Knocheneigenschaften von mikroarchitektonischen Parametern herunter und installieren Sie ihn.
   HINWEIS: Die kostenlose Version von CTAnalyser ist in ihrer Funktionalität eingeschränkt, daher wird empfohlen, eine Volllizenz zu erwerben.
5. Teilen Sie die Analyse in die subchondrale Platte und den trabekulären Knochen auf, indem Sie sie als separate Bildbereiche speichern.
   HINWEIS: Eine Aufteilung der Analyse ist nicht erforderlich, aber da die subchondrale Platte und der trabekuläre Knochen unterschiedliche Merkmale aufweisen, können separate Analysen zu robusten Messungen und Vergleichen beitragen.
6. Wählen Sie den Bereich der zu analysierenden Bilder aus, beginnend mit der subchondralen Platte, indem Sie auf die Bildscheibe klicken, mit der Sie beginnen möchten.
7. Wählen Sie den Interessenbereich für jedes Bild aus, um sicherzustellen, dass er den Knochen umfasst, indem Sie auf die Registerkarte "Interessenbereich" klicken.
8. Wählen Sie die Registerkarte Binärauswahl aus. Passen Sie das Histogramm so an, dass der Hintergrund und der Knochen vollständig getrennt sind.
9. Wählen Sie die Registerkarte Knochenmineraldichte (BMD) aus. Speichern Sie diese Daten in einem neuen Analysedatenordner.
10. Wählen Sie Benutzerdefinierte Verarbeitung und gehen Sie zur Registerkarte Intern .
11. Führen Sie zuerst die Schwellenwertbestimmung durch und wählen Sie Automatisches Otsu und dann Ausführen.
12. Wählen Sie dann Flecken entfernen und dann Remove black speckles (schwarze Flecken) und dann Run (Ausführen) aus.
13. Wiederholen Sie den Ton "Flecken entfernen " und wählen Sie " Weiße Flecken entfernen" und dann "Ausführen".
14. Wählen Sie 3D-Analyse und wählen Sie Grundwerte und Zusatzwerte.
15. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.2 bis 6.4.5, um das Bild für die Trabekelknochenanalyse zurückzusetzen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Ausgabedatei in einem neuen Ordner mit derselben Datei wie die BMD-Daten befindet.

Vor der Durchführung intraartikulärer Injektionen an lebenden Tieren wurde das obige Protokoll an drei Rattenkadavern praktiziert, um die korrekte Injektionsstelle zu gewährleisten. Während der Übungssitzungen wurden 50 μl 70 % neuer Methylenblau-Farbstoff nach der oben beschriebenen Methode in beide Kniegelenke injiziert. Dies entspricht sechs Übungsinjektionen. Nach der Injektion wurde das Kniegelenk präpariert, indem durch die kraniale Seite des Gelenkspalts, distal der Patella und durch das Patellaband geschnitten wurde, um den Gelenkspalt sichtbar zu machen und die Lokalisation der Farbstoffablagerung zu überprüfen. Da es sich bei dem neuen Methylenblau-Farbstoff um eine hellblaue Lösung handelt, kann der Ort der Farbstoffabscheidung grob sichtbar gemacht werden. Repräsentative Bilder von Leicheninjektionen sind in Abbildung 1 enthalten. Abbildung 1A zeigt das Vorhandensein von Farbstoff im Gelenkraum, was auf eine korrekte Lokalisation und Technik der Injektion hinweist. Während dieser Übungseinheiten wurde das Kniegelenk bei allen sechs Versuchen erfolgreich injiziert (100% Erfolgsquote). Zu Demonstrationszwecken sind Beispiele für falsche Injektionsstellen in Abbildung 1B-C enthalten. Wenn die Injektion in den subkutanen Raum verabreicht wird, sammelt sich Flüssigkeit an, die eine Blase unter der Haut verursacht, wie in Abbildung 1B zu sehen ist. Wenn der Gelenkspalt nicht injiziert wird, ist kein Farbstoff im Kniegelenk vorhanden, wie in Abbildung 1C zu sehen ist.

Jedes der 5 Meerschweinchen wurde im Rahmen eines Pilotversuchs einer einzigen bilateralen Knieinjektion mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung unterzogen, um die Durchführbarkeit der Injektion und anschließende μCT-Analysen der altersbedingten OA-Veränderungen sicherzustellen. Die Tiere wurden mindestens einmal täglich nach dem Verfahren visuell auf den allgemeinen Gesundheitszustand und unerwünschte Ereignisse untersucht. Bei keinem (0%) dieser Tiere traten unerwünschte Ereignisse im Zusammenhang mit der Injektion auf, einschließlich Schmerzen, Lahmheit oder Infektionen. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Tiere unter eine chirurgische Narkoseebene gesetzt und für die Knieentnahme und die anschließende μCT-Analyse human eingeschläfert.

Wie bereits veröffentlicht, kann die μCT-Analyse zur Beurteilung von Knieveränderungen bei Meerschweinchen verwendet werden, einschließlich der Möglichkeit, quantitative Veränderungen im Zusammenhang mit dem Schweregrad der Arthrose im Laufe der Zeit zu messen22,23. In der vorliegenden Studie wurde μCT verwendet, um OA-Veränderungen bei Meerschweinchen unterschiedlichen Alters zu verifizieren. Diese Ergebnisse können als Ausgangsdaten für zukünftige Studien verwendet werden, in denen neuartige Behandlungen untersucht werden, die das Fortschreiten der Arthrose verzögern sollen. Die oben beschriebene Methodik wird eine Standardisierung von μCT-Analysen in zukünftigen Studien ermöglichen. Die subchondrale Platte (Abbildung 2A) und der trabekuläre Knochen (Abbildung 2B) haben drastisch unterschiedliche Knocheneigenschaften. Daher werden diese Bereiche separat analysiert, um eine Woche nach der Injektion ein robusteres Ergebnis zu erhalten.

Die Knochenmineraldichte (BMD) ist bei 12 Monate alten Meerschweinchen höher als bei 5 und 9 Monate alten (Abbildung 3). Die mittlere BMD der subchondralen Platte betrug 0,898 g/cm3, 0,952 g/cm3 und 0,588 g/cm3 bei 12-, 9- bzw. 5 Monate alten Meerschweinchen. Dies zeigt einen 1,53-fachen Anstieg der subchondralen BMD bei den 12 Monate alten Meerschweinchen im Vergleich zu den 5 Monate alten Meerschweinchen. Die mittlere BMD des trabekulären Knochens betrug 0,825 g/cm3, 0,839 g/cm3, 0,427 g/cm3 bei 12-, 9- bzw. 5 Monate alten Meerschweinchen. Dies entspricht einem 1,93-fachen Anstieg der trabekulären BMD bei den 12 Monate alten Meerschweinchen im Vergleich zu den 5 Monate alten Meerschweinchen. Insgesamt nimmt die BMD bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen im Alter von 5 Monaten auf 12 Monate zu (Abbildung 3).

Es gab auch Unterschiede in der Trabekeldicke zwischen Meerschweinchen unterschiedlichen Alters (Abbildung 4). Für die mittlere Trabekeldicke gibt es eine 1,38-fache Zunahme bei den 12 Monate alten (0,558 mm) im Vergleich zu den 9 Monate alten (0,403 mm) sowie eine 2,48-fache Zunahme bei den 12 Monate alten (0,558 mm) im Vergleich zu den 5 Monate alten (0,225 mm) Meerschweinchen. Daher ist der Mittelwert der Trabekeldicke bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen im Alter von 5 bis 12 Monaten erhöht.

Histologische Veränderungen und modifizierte Makin-Scores, ein validierter und weit verbreiteter Ansatz zur Beurteilung von OA-Veränderungen in 2D, unterstützen die μCT-Befunde (Abbildung 5). Die modifizierten Mankin-Werte stiegen mit zunehmendem Alter der Meerschweinchen an (Abbildung 5A). Histologisch nehmen Anzeichen von Arthrose wie Proteoglykanverlust, Hypozellularität und Fissuren mit zunehmendem Alter von Meerschweinchen im Alter von 5 bis 12 Monaten zu (Abbildung 5B-D).

Abbildung 1: Repräsentative Bilder von korrekten und falschen Injektionsstellen. (A) Präpariertes Rattenknie mit dem Vorhandensein von neuem Methylenblau-Farbstoff im Gelenkspalt. Die Skala befindet sich links vom Knie als Referenz. (B) Knie mit einer flachen Injektion, die zur Bildung einer Blase im subkutanen Raum führt. (C) Das Knie von Panel B wurde präpariert, was einen Mangel an neuem Methylenblau-Farbstoff im Gelenkspalt bestätigt. Skala rechts vom Knie als Referenz enthalten. In allen Bildern befindet sich der Schädel am oberen Rand des Bildes und der Schwanz am unteren Rand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Segmentierung für subchondrale Platten im Vergleich zu trabekulären Knochenmessfeldern. Die subchondrale Platte hat andere Eigenschaften als der Trabekelknochen. Die getrennte Analyse dieser Regionen ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Regionen im Verlauf der OA-Progression. Region A (rot) zeigt die koronale Ansicht für den Bereich des subchondralen Plattensegments, der für die Analyse verwendet wird. Region B (grün) zeigt die koronale Ansicht des trabekulären Knochensegments, das für die Analyse verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Veränderungen der Knochenmineraldichte bei alternden Dunkin-Hartley-Meerschweinchen. Die Knochenmineraldichte (BMD) wurde bei Meerschweinchen im Alter von 5 (n=2), 9 (n=1) und 12 (n=2) Monaten bestimmt. Die Messungen wurden sowohl an der subchondralen Platte als auch am trabekulären Knochen für zwei verschiedene Messungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Veränderungen der Trabekeldicke bei alternden Dunkin-Hartley-Meerschweinchen. Trabekuläre Dickenmessungen wurden von 5 (n=2), 9 (n=1) und 12 (n=2) Monate alten Meerschweinchen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Histologische Analyse von OA-Veränderungen bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen. (A) Modifizierte Mankin-Scores für histologische Proben von 5 (n=2), 9 (n=1) und 12 (n=2) Monate alten Meerschweinchen. Der modifizierte Mankin-Score wurde berechnet, indem die einzelnen Werte der Knorpelstruktur, der Zellularität, des Tidemark und der Osteophytenbildung addiert wurden. (B) Repräsentatives histologisches Bild, gefärbt mit Toluidinblau von einem 5 Monate alten Meerschweinchen. (C) Repräsentatives histologisches Bild, gefärbt mit Toluidinblau von einem 9 Monate alten Meerschweinchen. schwarz *= Proteoglykan-Verlust. D. Repräsentatives histologisches Bild, gefärbt mit Toluidinblau von einem 12 Monate alten Meerschweinchen. schwarz *= Fissuren; weiß *= Hypozellularität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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