Methodenartikel

Mikro-Computertomographie-Analyse des Knies bei gealterten Dunkin-Hartley-Meerschweinchen nach intraartikulärer Injektion

DOI:

10.3791/66053

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2. August 2024

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1Drug Discovery and Biomedical Sciences, Medical University of South Carolina, 2Department of Biomedical Science, The University of Alabama at Birmingham, 3Department of Comparative Medicine, Medical University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dunkin-Hartley-Meerschweinchen sind ein etabliertes Tiermodell für die Arthroseforschung. Solche Studien können aus verschiedenen Gründen von intraartikulären Injektionen profitieren, z. B. bei der Untersuchung neuartiger Wirkstoffe oder der Behandlung von Krankheiten. Wir beschreiben eine Methodik für intraartikuläre Knieinjektionen bei Meerschweinchen und die anschließende Mikro-Computertomographie-Analyse zur Beurteilung von Arthritis-assoziierten Knieveränderungen.

Zusammenfassung

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Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, Forscher bei der Durchführung einer palpationsgesteuerten Technik der intraartikulären Knieinjektion bei Meerschweinchen und der Beurteilung mittels Mikrocomputertomographie zu unterstützen. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen sind robuste Modelle für die Arthroseforschung, da sie spontan Arthrose in ihren Knien entwickeln. Die intraartikuläre Verabreichung von Medikamenten ist eine gängige Methode, um die Auswirkungen eines Prüfpräparats in vivo zu untersuchen. Beim Menschen können Therapeutika, die über intraartikuläre Injektion verabreicht werden, Schmerzlinderung bieten und das weitere Fortschreiten der Arthrose verzögern. Wie bei jeder Spezies kann das Einführen einer Nadel in einen Gelenkspalt zu Verletzungen führen, die zu Schmerzen, Lahmheit oder Infektionen führen können. Solche unerwünschten Ereignisse können den Tierschutz beeinträchtigen, die Studienergebnisse verfälschen und zusätzliche Tiere erforderlich machen, um die Studienziele zu erreichen. Daher ist es unerlässlich, geeignete Injektionstechniken zu entwickeln, um Komplikationen zu vermeiden, insbesondere bei Längsschnittstudien, die mehrere, wiederholte intraartikuläre Injektionen erfordern. Unter Verwendung der vorgestellten Methodik erhielten fünf Meerschweinchen unter Vollnarkose bilaterale Knieinjektionen. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Tiere auf humane Weise eingeschläfert, um den Schweregrad der Arthrose zu analysieren. Nach Anästhesie oder Knieinjektionen traten keine unerwünschten Ereignisse auf, einschließlich Hinken, Schmerzen oder Infektionen. Mit der Röntgen-Mikro-Computertomographie des Knies können pathologische Veränderungen im Zusammenhang mit Arthrose festgestellt werden. Mikrocomputertomographie-Daten deuten darauf hin, dass die Arthrose bei älteren Tieren schwerwiegender verläuft, was sich in einer erhöhten Knochenmineraldichte und Trabekeldicke mit zunehmendem Alter zeigt. Diese Ergebnisse stimmen mit histologischen Veränderungen und modifizierten Mankin-Scores überein, einem etablierten und weit verbreiteten Bewertungssystem zur Beurteilung des Schweregrads der Arthritis bei denselben Tieren. Dieses Protokoll kann zur Verfeinerung intraartikulärer Injektionen bei Meerschweinchen verwendet werden.

Einleitung

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32,5 Millionen Erwachsene in den USA sind von Osteoarthritis (OA) betroffen. Sie wird durch einen fortschreitenden Verlust des Gelenkknorpels, eine leichte Entzündung des Gewebes in und um die Gelenke und die Bildung von Osteophyten und Knochenzysten verursacht 1,2. Die Symptome manifestieren sich typischerweise in den späteren Stadien der Krankheit, wobei die derzeitigen Behandlungen nur palliative Linderung bieten und systemische Nebenwirkungen haben. Der Mangel an krankheitsmodifizierenden Medikamenten ist auf ein mangelndes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Krankheit zurückzuführen3. Infolgedessen besteht ein kritischer und anhaltender medizinischer Bedarf an verbesserten Wirkstoffen zur Behandlung von OA.

Es stehen mehrere Tiermodelle von OA zur Verfügung, die verschiedene Komponenten der Krankheitsprozesse untersuchen4. Es gibt zwar mehrere chirurgische Modelle, darunter die Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes und die Destabilisierung des Innenmeniskus, diese sind jedoch invasiv und erfordern ein hohes Maß an technischer Kompetenz5. Chemisch induzierte Modelle sind vergleichsweise weniger invasive Verfahren, die typischerweise zur Untersuchung von OA-Schmerzmechanismen eingesetzt werden6. Eines dieser weit verbreiteten Mausmodelle beinhaltet die OA-Induktion durch eine intraartikuläre Knieinjektion von Mononatriumiodacetat (MIA). Dieses Modell erzeugt einen reproduzierbaren, robusten und schnellen schmerzähnlichen Phänotyp, der durch Änderung der MIA-Dosierung7 abgestuft werden kann. Die technischen Einzelheiten der Induktion dieses Modells wurden bereits beschrieben7. Die Übertragung dieser Technik auf größere Nagetiere, wie z. B. Meerschweinchen, ist aufgrund ihrer anatomischen Unterschiede schwierig. Zu den Unterschieden gehören eine erhöhte Muskulatur um die angrenzenden Knochen und den Gelenkraum beim Meerschweinchen sowie eine artikulierende Fibula und Tibia im Vergleich zur distalen Fusion, die bei Mäusen beobachtet wurde8. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen, ein weit verbreiteter Meerschweinchenstamm, sind ein etabliertes OA-Tiermodell, da sie diese Krankheit auf natürliche Weise entwickeln, und bieten damit ein robustes Modell für die Untersuchung der Auswirkungen neuartiger Therapeutika, die durch intraartikuläre Injektion verabreicht werden, auf das Fortschreiten der Krankheit9. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen beginnen mit der Entwicklung von OA im Alter von drei Monaten, wobei die Männchen eine beschleunigte Entwicklung und einen schwereren Phänotyp10 aufweisen. Bei Meerschweinchen schreitet die Arthrose mit dem Alter fort, und nach 12 Monaten ist die damit verbundene Pathologie in der Bildgebung erkennbar11. Spontane OA-Modelle, wie das Dunkin-Hartley-Modell, erfordern keine Intervention, um OA zu induzieren und somit die Entwicklung und das Fortschreiten des Krankheitsphänotyps beim Menschen zu rekapitulieren, wodurch ein leistungsfähiges translationales Modell bereitgestelltwird 10. Darüber hinaus ermöglicht die spontane Entwicklung von OA die interne Kontrolle, wenn neuartige Therapeutika einseitig in einem einzelnen Knie eines bestimmten Tieres verabreicht werden. Diese interne Kontrolle minimiert die Auswirkungen von Variabilitäten zwischen den Tieren bei der Datenanalyse und kann dazu beitragen, die Gesamtzahl der Tiere zu reduzieren.

Die Röntgen-Mikro-Computertomographie (μCT) ist ein leistungsstarkes Instrument, das eine quantitative Beurteilung des OA-Schweregrads12 ermöglicht. Bei der μCT werden mehrere hochauflösende Röntgenbilder abgetastet, die von einer rotierenden Probe oder einer rotierenden Röntgenquelle und einem rotierenden Röntgendetektor13 gewonnen wurden. Dann werden dreidimensionale (3D) volumetrische Daten in Form von gestapelten Bildscheiben14 rekonstruiert. Da mineralisierter Knochen im μCT einen hervorragenden Kontrast aufweist, kann diese Modalität zur Beurteilung von 3D-Merkmalen und zur Durchführung quantitativer Analysen von Veränderungen im Zusammenhang mit OA verwendet werden 15,16,17. μCT bietet mehrere Vorteile gegenüber weiter verbreiteten Werkzeugen, einschließlich der Histopathologie und der Ganganalyse. Im Gegensatz zur histologischen Beurteilung eines oder weniger Gewebeabschnitte wird bei der μCT das gesamte Gelenk gescannt und eine ganzheitlichere Beurteilung von OA-Läsionenermöglicht 18. Während die Ganganalyse symptomatische Veränderungen der Gelenkfunktion im Laufe der Zeit erkennen kann, entwickeln sich Gelenkveränderungen lange vor den funktionellen Veränderungen, die mit OA verbunden sind. Die μCT kann ein sensitiveres Maß für die OA-Entwicklung vor dem Auftreten von Lahmheiten liefern. Zwei besonders relevante quantitative Messungen sind die Knochenmineraldichte und die Trabekeldicke, da beide im Laufe der Progression von OA zunehmen19,20. Es kann hilfreich sein, die Analyse in subchondrale Platte und trabekulären Knochen aufzuteilen, da sie unterschiedliche Merkmale aufweisen, um robustere Messungen und Vergleiche zu erhalten.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Forschern dabei zu helfen, intraartikuläre Injektionen bei Meerschweinchen erfolgreich durchzuführen. Das vorgestellte Protokoll verwendete fünf (n=2), neun (n=1) und 12 (n=2) alte, männliche Dunkin-Hartley-Meerschweinchen; Die Verfahren können auf andere Meerschweinchenstämme und Altersgruppen extrapoliert werden, die intraartikuläre Knieinjektionen erfordern. In spontanen Modellen der Arthrose, wie dem Dunkin-Hartley-Modell, werden das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf die serielle Behandlung oft über lange Zeiträume von Wochen bis Monaten überwacht9. Dieses erweiterte Protokoll führt zu mehreren intraartikulären Injektionen, und daher ist es wichtig, über die richtige Injektionstechnik zu verfügen, um unerwünschte Ereignisse wie Schmerzen, Lahmheiten oder Infektionen zu verhindern, die sich alle auf das Wohlergehen der Tiere auswirken und die Studienergebnisse verfälschen können, während zusätzliche Tiere in der Studie erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Methodik der intraartikulären Injektionen bei Meerschweinchen und die anschließende Analyse der μCT-Daten.

Protokoll

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt. Die Studie folgte dem Prinzip der 3R.

1. Intraartikuläre Injektionspräparate

  1. Lassen Sie die Dunkin-Hartley-Meerschweinchen mindestens eine Woche lang vor Beginn des Versuchs an der Einrichtung akklimatisieren.
    HINWEIS: Es wurden 5- (n=2), 9- (n=1) und 12 (n=2) alte männliche Meerschweinchen verwendet. Männchen zeigen eine beschleunigte Entwicklung und einen schwereren Phänotyp der OA.
  2. Rasieren Sie die Kniepartie mit einem Elektrorasierer.
    HINWEIS: Achten Sie auf die Brustwarzen in der Mitte.
  3. Anästhesieren Sie Meerschweinchen in einer Isoflurankammer, die 3-5 % Isofluran in einemO2-Gemisch liefert (Durchflussrate 2,5 l/min), und übertragen Sie dann das Meerschweinchen in einen Nasenkonus, der an einen nicht rückatmenden Anästhesiekreislauf angeschlossen ist. Passen Sie das Isofluran an, um die chirurgische Anästhesieebene während der Injektion aufrechtzuerhalten, typischerweise mit einer Sauerstoffflussrate von 0,5-1 l/min und 1-3% Isofluran.
    HINWEIS: Intraartikuläre Injektionen verursachen leichte, vorübergehende Schmerzen. Die Tiere werden während des Eingriffs betäubt, um die Wahrnehmung schmerzhafter Reize zu verhindern und die Injektionsgenauigkeit zu verbessern. In der vorliegenden Studie würde die Verabreichung von Analgetika, einschließlich nichtsteroidaler entzündungshemmender Medikamente, die Progression der Arthrose beeinträchtigen21. Aufgrund der vorübergehenden Schmerzen, der verabreichten Anästhesie und des Potenzials von Analgetika, das Modell zu verwirren, wurden Analgetika nicht verabreicht, es sei denn, die Tiere zeigten Nebenwirkungen, einschließlich Hinken und Anzeichen von Schmerzen beim Abtasten der Gelenke nach der Injektion. Prüfärzte sollten die Verwendung von Analgetika für routinemäßige Injektionen in Betracht ziehen. Analgetika werden empfohlen, wenn Nebenwirkungen auftreten. Analgetika sollten vor Beginn der Studien mit dem institutionellen Tierarzt besprochen und von der IACUC genehmigt werden.
  4. Stellen Sie sicher, dass das Meerschweinchen eine angemessene Anästhesietiefe hat, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren.
  5. Tragen Sie steriles Augengleitmittel auf beide Augen auf, um Austrocknung und Verletzungen zu verhindern.
  6. Betadin mit sterilem Wasser auf 10% verdünnen.
  7. 200er Ethanol mit sterilem Wasser auf 70% Ethanol verdünnen.
  8. Bereiten Sie Injektionslösungen in einer Biosicherheitswerkbank vor, um die Sterilität zu erhalten. Im vorliegenden Protokoll wurde ein steriles Vehikel (1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung) verwendet, um beide Knie zu injizieren. Lösungen können je nach Forschungszielen geändert werden.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, frische Injektionslösungen unmittelbar vor der Injektionssitzung zu verdünnen, um die Sterilität zu gewährleisten. Nicht verwendete Lösungen sollten am Ende jeder Injektionssitzung verworfen werden.
  9. Sterile Einmal-Insulinspritzen mit Injektionslösungen füllen. Achten Sie darauf, das geringstmögliche Volumen zu nutzen, um eine Überlastung des Gelenkraums mit Volumen zu vermeiden. In der vorliegenden Studie wurden 50 μL verwendet.
  10. Legen Sie Meerschweinchen und Nasenkegel auf eine saubere Oberfläche mit einem Heizkissen zur thermischen Unterstützung und einer Polsterung unter dem Kopf, um ihn leicht anzuheben.
  11. Ziehen Sie während des Injektionsvorgangs einen OP-Kittel, ein Haarnetz, sterile Handschuhe und eine Maske an.
  12. Gießen Sie 10% Betadin auf einen Wattebausch und wischen Sie beide Kniebereiche ab.
  13. Gießen Sie 70% Ethanol auf einen Wattebausch und wischen Sie beide Kniebereiche ab.
  14. Wiederholen Sie 1.12 und 1.13 noch zweimal.
    HINWEIS: Zu Demonstrationszwecken zeigt das entsprechende Video die einmalige Reinigung des Knies und der Injektionsstelle mit 10 % Betadin und 70 % Ethanol. Die Injektionsstelle wurde anschließend zwei weitere Male mit kreisenden Bewegungen gereinigt, wobei diese Lösungen abwechselten. Drei serielle Peelings mit abwechselnden Peelinglösungen und Alkohol werden empfohlen, um eine aseptische Technik zu erreichen.

2. Intraartikuläre Injektion

  1. Bringen Sie das Meerschweinchen während des gesamten Eingriffs in Rückenlage.
  2. Ziehen Sie ein neues Paar sterile Handschuhe an und tasten Sie das Kniegelenk ab.
    HINWEIS: In dem vorgestellten Protokoll und Video wurden autoklavierte Nitrilhandschuhe verwendet. Für die aseptische Technik sollten sterile Handschuhe, einschließlich autoklavierter Nitrilhandschuhe oder chirurgischer Handschuhe, verwendet werden.
  3. Beugen Sie das Knie manuell um 90°.
  4. Bewegen Sie den Finger distal zur Patella, um die Rille des distalen Aspekts des Gelenkspalts zu lokalisieren, indem Sie die Hintergliedmaße beugen und strecken.
    HINWEIS: Die Patella kann in dieser Position als kleines, festes Gebilde, das sich direkt über dem Gelenkraum befindet, ertastet werden. Die Tibia ist als knöcherne Struktur distal der Kniescheibe zu spüren. Sobald die Lage der Tibia und der Patella bestimmt ist, befindet sich das Gelenk, das als Rille empfunden wird, zwischen ihnen, distal der Patella und proximal der Tibia.
  5. Führen Sie die Insulinnadel vorsichtig auf der Mittellinie distal der Patella im Gelenkspalt ein. Die Nadel sollte 1-2 mm unterhalb der Haut eingeführt werden, um in den Gelenkspalt einzudringen.
    HINWEIS: Das größte Zugangsfenster für den Gelenkspalt bei gebeugtem Knie befindet sich auf der vorderen Seite der Extremität auf der Mittellinie, direkt distal der Patella. Die Injektion auf der Mittellinie in anterior-posterior-Richtung hilft bei der präzisen Injektion in den Gelenkraum, ohne knöcherne Strukturen zu durchdringen. Eine präzise Injektion in den Gelenkspalt kann mit einem lateralen bis medialen Zugang erreicht werden, obwohl das Zugangsfenster insbesondere bei gebeugtem Knie enger ist.
  6. Injizieren Sie 50 μl der Lösung langsam in das Gelenk. Stellen Sie sicher, dass die Nadel leicht einsticht und der Inhalt ohne Widerstand injiziert wird.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu tief einzuführen, da dies Gelenk- oder Knochenschäden verursachen und zu unerwünschten Entzündungen und/oder Schmerzen führen kann. Wenn die Furche, die dem Gelenkspalt entspricht, nicht gefunden wird, könnte die Nadel den Oberschenkelknochen, die Patella oder das Schienbein durchdringen. Daher ist es von Vorteil, die dem Gelenkspalt entsprechende Rille sicher abzutasten, um periartikuläre Injektionen oder Verletzungen im Zusammenhang mit dem Eindringen in knöcherne Strukturen zu vermeiden. Wenn sich an der Injektionsstelle unter der Haut eine Blase bildet, war die Injektion zu flach und die Flüssigkeit ist in den Unterhautraum gelangt. Abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Mittels kann das Arzneimittel durch Diffusion in den Gelenkspalt gelangen, oder ein weiterer Injektionsversuch kann erforderlich sein.
  7. Wenn du fertig bist, wirf die Nadel in den Behälter für scharfe Gegenstände.
    HINWEIS: Zu Übungs- und Schulungszwecken injizieren Sie Flüssigkeit, die einen Farbstoff enthält, in den Gelenkspalt eines Leichnachers oder Meerschweinchens ähnlicher Größe. Präparieren Sie dann das Gelenk, um die Position der Injektion zu bestätigen.
  8. Massieren Sie das Knie, indem Sie das Gelenk einige Male beugen und strecken, um die Diffusion des Arzneimittels im Gelenkraum zu fördern.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 einmal an der kontralateralen Extremität mit 1x PBS-Lösung.

3. Genesung von der intraartikulären Injektion

  1. Schalten Sie Isofluran aus und halten Sie den Sauerstofffluss zu 100 % aufrecht, bis das Tier wieder zu Bewusstsein kommt.
  2. Legen Sie das Tier bis zur Ambulanz auf ein Heizkissen zur thermischen Unterstützung.
  3. Tragen Sie 30 s lang einen Eisbeutel auf das Knie auf, mit einem Papiertuch als Barriere, um die Schwellung durch die Injektion zu verringern.
  4. Beurteilen Sie den Gang der Tiere im ambulanten Zustand, bevor Sie sie in den Stall zurückbringen.
    HINWEIS: Wenn Ganganomalien festgestellt werden, können Analgetika und unterstützende Behandlung gerechtfertigt sein. Es ist ratsam, ihren Gang einige Stunden nach der Genesung von der Narkose erneut zu beurteilen, um eine normale Beweglichkeit zu gewährleisten.

4. Mikro-Computertomographie (μCT) Scan

  1. Für die Gewebeentnahme wird eine chirurgische Anästhesieebene mit einer Mischung aus 100 % Sauerstoff und 5 % Isofluran eingerichtet.
  2. Bestätigen Sie eine chirurgische Anästhesieebene mit fehlender Reaktion auf einen Zehenkneifreiz. Euthanasieren Sie das Tier auf humane Weise durch intravenöse Verabreichung von ≥ 150 mg/kg Pentobarbital gemäß den institutionellen Richtlinien und dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll.
    HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll erhielt jedes der fünf Meerschweinchen eine Injektion in beide Knie. Die Tiere wurden eine Woche nach der Injektion betäubt und auf humane Weise eingeschläfert.
  3. Entnehmen Sie beide Hintergliedmaßen, indem Sie die Haut von der umgebenden Muskulatur wegpräparieren.
  4. Als nächstes disartikulieren Sie die Hintergliedmaße mit Rongeurs in der Mitte des Oberschenkelknochens und proximal zum Knöchel.
    HINWEIS: Das verwendete Scanbett und der Probenhalter waren nicht in der Lage, die gesamte Hintergliedmaße eines erwachsenen Meerschweinchens aufzunehmen. Für größere Probengrößen sind große Probenhalter im Handel erhältlich.
  5. Legen Sie das Gewebe für 72 Stunden zur Fixierung in eine neutral gepufferte Formalinlösung, bevor Sie die μCT durchführen.
  6. Öffnen Sie die μCT-Scansoftware und legen Sie die Probe mit Formalin in einen kompatiblen Behälter, der in die μCT-Probenmappe passt, während das Gewebe im Sichtfeld bleibt.
  7. Kalibrieren Sie das μCT-Gerät für Dunkelfeld- und Lichtfeld-Aufnahmen gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  8. Scannen Sie die Probe mit einem Al+Cu-Filter bei 18 μm. Verwenden Sie den Rotationsschritt 0,7° für 360° mit der Offset-Kamera.
    HINWEIS: Der Scan wird automatisch gespeichert.

5. Bildverarbeitung zur Bewertung von mikroarchitektonischen Parametern des Knochens

  1. Laden Sie die μCT-Rekonstruktionssoftware für die Rekonstruktion von μCT-Bildern herunter und installieren Sie sie.
  2. Wählen Sie den Softwareordner aus und doppelklicken Sie, um die Software zu öffnen.
  3. Wählen Sie eine Schicht aus den μCT-Bildern aus, indem Sie auf eine Bildscheibe klicken.
  4. Wählen Sie das Ziel der Rekonstruktionsdatei aus. Wählen Sie Durchsuchen aus, und erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen Recon. Das gewählte Dateiformat sollte BMP(8) sein.
  5. Überprüfen Sie die Kompensation von Fehlausrichtungen.
    HINWEIS: Normalerweise ist die Schätzung nahezu korrekt, aber sie kann manuell angepasst werden, um die überlappenden Bilder so zu verschieben, dass der rechte und der linke Rand so genau wie möglich ausgerichtet sind.
  6. Wenden Sie unter Einstellungen die Algorithmen Glättung, Strahlhärtung, CS-Rotation und Ringartefakte an.
    HINWEIS: Es kann hilfreich sein, das Vorschaubild auszuwählen, um die Klarheit vor der Rekonstruktion zu bestimmen. Die Feinabstimmung kann auch hilfreich sein, um zu bestimmen, welche Einstellungen am besten geeignet sind.
  7. Wählen Sie Start aus, um mit der Verarbeitung der Rekonstruktion zu beginnen.

6. Sammlung mikroarchitektonischer Daten aus rekonstruierten Bildern

  1. Laden Sie Dataviewer herunter und installieren Sie es.
  2. Wählen Sie VOI und richten Sie die Probe so aus, dass sie vertikal ausgerichtet wird, um die Analyse zu einem späteren Zeitpunkt zu erleichtern.
  3. Speichern Sie das bearbeitete VOI als neuen Ordner.
  4. Laden Sie den CTAnalyser für die Analyse der Knocheneigenschaften von mikroarchitektonischen Parametern herunter und installieren Sie ihn.
    HINWEIS: Die kostenlose Version von CTAnalyser ist in ihrer Funktionalität eingeschränkt, daher wird empfohlen, eine Volllizenz zu erwerben.
  5. Teilen Sie die Analyse in die subchondrale Platte und den trabekulären Knochen auf, indem Sie sie als separate Bildbereiche speichern.
    HINWEIS: Eine Aufteilung der Analyse ist nicht erforderlich, aber da die subchondrale Platte und der trabekuläre Knochen unterschiedliche Merkmale aufweisen, können separate Analysen zu robusten Messungen und Vergleichen beitragen.
  6. Wählen Sie den Bereich der zu analysierenden Bilder aus, beginnend mit der subchondralen Platte, indem Sie auf die Bildscheibe klicken, mit der Sie beginnen möchten.
  7. Wählen Sie den Interessenbereich für jedes Bild aus, um sicherzustellen, dass er den Knochen umfasst, indem Sie auf die Registerkarte "Interessenbereich" klicken.
  8. Wählen Sie die Registerkarte Binärauswahl aus. Passen Sie das Histogramm so an, dass der Hintergrund und der Knochen vollständig getrennt sind.
  9. Wählen Sie die Registerkarte Knochenmineraldichte (BMD) aus. Speichern Sie diese Daten in einem neuen Analysedatenordner.
  10. Wählen Sie Benutzerdefinierte Verarbeitung und gehen Sie zur Registerkarte Intern .
  11. Führen Sie zuerst die Schwellenwertbestimmung durch und wählen Sie Automatisches Otsu und dann Ausführen.
  12. Wählen Sie dann Flecken entfernen und dann Remove black speckles (schwarze Flecken) und dann Run (Ausführen) aus.
  13. Wiederholen Sie den Ton "Flecken entfernen " und wählen Sie " Weiße Flecken entfernen" und dann "Ausführen".
  14. Wählen Sie 3D-Analyse und wählen Sie Grundwerte und Zusatzwerte.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.2 bis 6.4.5, um das Bild für die Trabekelknochenanalyse zurückzusetzen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Ausgabedatei in einem neuen Ordner mit derselben Datei wie die BMD-Daten befindet.

Ergebnisse

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Vor der Durchführung intraartikulärer Injektionen an lebenden Tieren wurde das obige Protokoll an drei Rattenkadavern praktiziert, um die korrekte Injektionsstelle zu gewährleisten. Während der Übungssitzungen wurden 50 μl 70 % neuer Methylenblau-Farbstoff nach der oben beschriebenen Methode in beide Kniegelenke injiziert. Dies entspricht sechs Übungsinjektionen. Nach der Injektion wurde das Kniegelenk präpariert, indem durch die kraniale Seite des Gelenkspalts, distal der Patella und durch das Patellaband geschnitten wurde, um den Gelenkspalt sichtbar zu machen und die Lokalisation der Farbstoffablagerung zu überprüfen. Da es sich bei dem neuen Methylenblau-Farbstoff um eine hellblaue Lösung handelt, kann der Ort der Farbstoffabscheidung grob sichtbar gemacht werden. Repräsentative Bilder von Leicheninjektionen sind in Abbildung 1 enthalten. Abbildung 1A zeigt das Vorhandensein von Farbstoff im Gelenkraum, was auf eine korrekte Lokalisation und Technik der Injektion hinweist. Während dieser Übungseinheiten wurde das Kniegelenk bei allen sechs Versuchen erfolgreich injiziert (100% Erfolgsquote). Zu Demonstrationszwecken sind Beispiele für falsche Injektionsstellen in Abbildung 1B-C enthalten. Wenn die Injektion in den subkutanen Raum verabreicht wird, sammelt sich Flüssigkeit an, die eine Blase unter der Haut verursacht, wie in Abbildung 1B zu sehen ist. Wenn der Gelenkspalt nicht injiziert wird, ist kein Farbstoff im Kniegelenk vorhanden, wie in Abbildung 1C zu sehen ist.

Jedes der 5 Meerschweinchen wurde im Rahmen eines Pilotversuchs einer einzigen bilateralen Knieinjektion mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung unterzogen, um die Durchführbarkeit der Injektion und anschließende μCT-Analysen der altersbedingten OA-Veränderungen sicherzustellen. Die Tiere wurden mindestens einmal täglich nach dem Verfahren visuell auf den allgemeinen Gesundheitszustand und unerwünschte Ereignisse untersucht. Bei keinem (0%) dieser Tiere traten unerwünschte Ereignisse im Zusammenhang mit der Injektion auf, einschließlich Schmerzen, Lahmheit oder Infektionen. Sieben Tage nach der Injektion wurden die Tiere unter eine chirurgische Narkoseebene gesetzt und für die Knieentnahme und die anschließende μCT-Analyse human eingeschläfert.

Wie bereits veröffentlicht, kann die μCT-Analyse zur Beurteilung von Knieveränderungen bei Meerschweinchen verwendet werden, einschließlich der Möglichkeit, quantitative Veränderungen im Zusammenhang mit dem Schweregrad der Arthrose im Laufe der Zeit zu messen22,23. In der vorliegenden Studie wurde μCT verwendet, um OA-Veränderungen bei Meerschweinchen unterschiedlichen Alters zu verifizieren. Diese Ergebnisse können als Ausgangsdaten für zukünftige Studien verwendet werden, in denen neuartige Behandlungen untersucht werden, die das Fortschreiten der Arthrose verzögern sollen. Die oben beschriebene Methodik wird eine Standardisierung von μCT-Analysen in zukünftigen Studien ermöglichen. Die subchondrale Platte (Abbildung 2A) und der trabekuläre Knochen (Abbildung 2B) haben drastisch unterschiedliche Knocheneigenschaften. Daher werden diese Bereiche separat analysiert, um eine Woche nach der Injektion ein robusteres Ergebnis zu erhalten.

Die Knochenmineraldichte (BMD) ist bei 12 Monate alten Meerschweinchen höher als bei 5 und 9 Monate alten (Abbildung 3). Die mittlere BMD der subchondralen Platte betrug 0,898 g/cm3, 0,952 g/cm3 und 0,588 g/cm3 bei 12-, 9- bzw. 5 Monate alten Meerschweinchen. Dies zeigt einen 1,53-fachen Anstieg der subchondralen BMD bei den 12 Monate alten Meerschweinchen im Vergleich zu den 5 Monate alten Meerschweinchen. Die mittlere BMD des trabekulären Knochens betrug 0,825 g/cm3, 0,839 g/cm3, 0,427 g/cm3 bei 12-, 9- bzw. 5 Monate alten Meerschweinchen. Dies entspricht einem 1,93-fachen Anstieg der trabekulären BMD bei den 12 Monate alten Meerschweinchen im Vergleich zu den 5 Monate alten Meerschweinchen. Insgesamt nimmt die BMD bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen im Alter von 5 Monaten auf 12 Monate zu (Abbildung 3).

Es gab auch Unterschiede in der Trabekeldicke zwischen Meerschweinchen unterschiedlichen Alters (Abbildung 4). Für die mittlere Trabekeldicke gibt es eine 1,38-fache Zunahme bei den 12 Monate alten (0,558 mm) im Vergleich zu den 9 Monate alten (0,403 mm) sowie eine 2,48-fache Zunahme bei den 12 Monate alten (0,558 mm) im Vergleich zu den 5 Monate alten (0,225 mm) Meerschweinchen. Daher ist der Mittelwert der Trabekeldicke bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen im Alter von 5 bis 12 Monaten erhöht.

Histologische Veränderungen und modifizierte Makin-Scores, ein validierter und weit verbreiteter Ansatz zur Beurteilung von OA-Veränderungen in 2D, unterstützen die μCT-Befunde (Abbildung 5). Die modifizierten Mankin-Werte stiegen mit zunehmendem Alter der Meerschweinchen an (Abbildung 5A). Histologisch nehmen Anzeichen von Arthrose wie Proteoglykanverlust, Hypozellularität und Fissuren mit zunehmendem Alter von Meerschweinchen im Alter von 5 bis 12 Monaten zu (Abbildung 5B-D).

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Abbildung 1: Repräsentative Bilder von korrekten und falschen Injektionsstellen. (A) Präpariertes Rattenknie mit dem Vorhandensein von neuem Methylenblau-Farbstoff im Gelenkspalt. Die Skala befindet sich links vom Knie als Referenz. (B) Knie mit einer flachen Injektion, die zur Bildung einer Blase im subkutanen Raum führt. (C) Das Knie von Panel B wurde präpariert, was einen Mangel an neuem Methylenblau-Farbstoff im Gelenkspalt bestätigt. Skala rechts vom Knie als Referenz enthalten. In allen Bildern befindet sich der Schädel am oberen Rand des Bildes und der Schwanz am unteren Rand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Segmentierung für subchondrale Platten im Vergleich zu trabekulären Knochenmessfeldern. Die subchondrale Platte hat andere Eigenschaften als der Trabekelknochen. Die getrennte Analyse dieser Regionen ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Regionen im Verlauf der OA-Progression. Region A (rot) zeigt die koronale Ansicht für den Bereich des subchondralen Plattensegments, der für die Analyse verwendet wird. Region B (grün) zeigt die koronale Ansicht des trabekulären Knochensegments, das für die Analyse verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Veränderungen der Knochenmineraldichte bei alternden Dunkin-Hartley-Meerschweinchen. Die Knochenmineraldichte (BMD) wurde bei Meerschweinchen im Alter von 5 (n=2), 9 (n=1) und 12 (n=2) Monaten bestimmt. Die Messungen wurden sowohl an der subchondralen Platte als auch am trabekulären Knochen für zwei verschiedene Messungen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Veränderungen der Trabekeldicke bei alternden Dunkin-Hartley-Meerschweinchen. Trabekuläre Dickenmessungen wurden von 5 (n=2), 9 (n=1) und 12 (n=2) Monate alten Meerschweinchen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Histologische Analyse von OA-Veränderungen bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen. (A) Modifizierte Mankin-Scores für histologische Proben von 5 (n=2), 9 (n=1) und 12 (n=2) Monate alten Meerschweinchen. Der modifizierte Mankin-Score wurde berechnet, indem die einzelnen Werte der Knorpelstruktur, der Zellularität, des Tidemark und der Osteophytenbildung addiert wurden. (B) Repräsentatives histologisches Bild, gefärbt mit Toluidinblau von einem 5 Monate alten Meerschweinchen. (C) Repräsentatives histologisches Bild, gefärbt mit Toluidinblau von einem 9 Monate alten Meerschweinchen. schwarz *= Proteoglykan-Verlust. D. Repräsentatives histologisches Bild, gefärbt mit Toluidinblau von einem 12 Monate alten Meerschweinchen. schwarz *= Fissuren; weiß *= Hypozellularität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Trotz der jüngsten Fortschritte in der symptomatischen Behandlung von OA gibt es einen völligen Mangel an Therapeutika, die den Beginn oder die Verzögerung des Fortschreitens von OAverhindern 24. Derzeit ist die einzige Heilung für schwere Arthrose der Gelenkersatz, der kostspielig und invasiv ist und zu Morbidität und Mortalität der Patienten führen kann25. Infolgedessen besteht ein dringender Bedarf an kontinuierlicher Forschung mit Tiermodellen für Open Access und der nachhaltigen Entwicklung neuartiger Therapeutika. Es stehen mehrere Tiermodelle zur Verfügung, um verschiedene Komponenten von OA zu untersuchen, darunter spontane und chemisch oder chirurgisch induzierte Modelle. Die Injektion von Chemikalien, wie im MIA-Mausmodell, ist für die Untersuchung von Schmerzen von entscheidender Bedeutung, ermöglicht es den Forschern jedoch nicht, das Fortschreiten der OA-Entwicklung zu verfolgen und zu den gewünschten Zeitpunkten während des Krankheitsverlaufs einzugreifen26. Chirurgische Methoden erfordern invasive Verfahren und spiegeln die Initiierung von Arthrose beim Menschen nicht getreu wider27. Dunkin-Hartley-Meerschweinchen entwickeln auf natürliche Weise OA, was sie zu einem weit verbreiteten spontanen Modell von OAmacht 28. Dieses spontane Modell ist ideal für die translationale Forschung, die die mechanistische OA-Entwicklung untersucht, da es keine Eingriffe erfordert und pathologische Veränderungen aufweist, die denen beim Menschen entsprechen6. Zuvor veröffentlichte Arbeiten haben intraartikuläre Injektionen verwendet, um die Auswirkungen neuartiger Therapeutika auf das Fortschreiten der spontanen Arthrose bei Dunkin-Hartley-Meerschweinchen zu testen 29,30,31.

Während intraartikuläre Injektionen bei Mäusen bereits beschrieben wurden, stellen anatomische Unterschiede bei Meerschweinchen zusätzliche Herausforderungen für dieses Verfahren dar7. Obwohl intraartikuläre Injektionen ein wesentlicher Bestandteil von OA-Studien an Meerschweinchen sind, muss dieses Verfahren noch systematisch detailliert beschrieben werden. Mit der beschriebenen Methodik heben wir wichtige Überlegungen zur Verfeinerung intraartikulärer Injektionen bei Meerschweinchen hervor, um das Potenzial für verfahrensbedingte Komplikationen zu reduzieren. Häufige Nebenwirkungen nach intraartikulären Injektionen beim Menschen sind Schmerzen, Schwellungen, septische Arthritis und Neuropathie, die als mögliche Komplikationen bei der Durchführung von Injektionen bei Meerschweinchen in Betracht gezogen werdensollten 32. Nach unserer Erfahrung können Nebenwirkungen, wie z.B. Hinken und Schmerzen beim Abtasten der Gelenke, auftreten, wenn die Nadel zu tief in den Gelenkspalt eingeführt wird und/oder während der Injektion mit einer knöchernen Struktur in Berührung kommt. Dadurch, dass wir Leichen hatten, an denen wir unsere Injektionen üben konnten, bevor wir sie an lebenden Tieren durchführten, trug dazu bei, genauere Injektionen zu gewährleisten. Bei der Verfeinerung unserer Technik, um eine geringe Injektionstiefe zu gewährleisten, haben wir keine Nebenwirkungen nach intraartikulären Knieinjektionen beobachtet. Daher ist die richtige Injektionstechnik für die Gewährleistung des Tierschutzes von größter Bedeutung, insbesondere bei Studien, die mehrere Injektionen über viele Monate erfordern. Zu den wichtigsten Schritten des Verfahrens gehören die Anwendung der aseptischen Technik; ausreichende Schulung vor der Durchführung von Überlebensverfahren; Erreichen einer chirurgischen Anästhesieebene, um die Schmerzwahrnehmung und -bewegung nach der Injektion zu verhindern; und Sicherstellung einer angemessenen Injektionstiefe, um den Kontakt mit distalen und periartikulären Knocheninjektionen zu vermeiden, die möglicherweise eine erneute Verabreichung der Verbindung erforderlich machen.

Um OA-bedingte Veränderungen systematisch zu bewerten, beschreiben wir μCT-Analysen, einschließlich 3D-Bildwiedergaben, die eine Visualisierung, Segmentierung, Markierung und objektive Messungen des betroffenen Gewebes ermöglichen. Die beschriebenen Methoden haben sich als effektiv und effizient bei der systematischen Beurteilung von Gelenk- und Knochenveränderungen in Arthrose im Laufe der Zeit erwiesen. Unsere μCT-Ergebnisse zeigen, dass 12 Monate alte Dunkin-Hartley-Meerschweinchen eine schwerere OA aufweisen als 5 Monate alte Meerschweinchen, was sich in einer erhöhten Knochenmineraldichte und einer erhöhten Trabekeldicke zeigt. Dies zeigte, dass die Verschlechterung der Arthrose im Laufe der Zeit mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen dieses OA-Modells übereinstimmt, einschließlich μCT-Analysen, die die Knochenmineraldichte und die Trabekeldicke bewerteten13. Frühere Studien und die vorgestellten repräsentativen Ergebnisse zeigen eine Zunahme der BMD und der trabekulären Dicke im Laufe der Zeit, gemessen mit μCT22,23. Darüber hinaus unterstützt unsere histologische Beurteilung der Knie in zwei Dimensionen die Validität der μCT-Daten. Histologisch sind die Anzeichen von OA bei den 9 und 12 Monate alten Meerschweinchen im Vergleich zu den 5 Monate alten Tieren ausgeprägter. Zu den histologischen Veränderungen, die mit OA assoziiert sind, gehören Proteoglykanverlust, Fissuren und Hypozellularität. 10 Jedes dieser Merkmale ist bei den älteren Meerschweinchen zu sehen. Darüber hinaus haben ältere Meerschweinchen höhere modifizierte Mankin-Werte, eine weit verbreitete und validierte Methode zur Beurteilung des OA-Schweregrads10. Während unsere histologischen Analysen erwartete OA-Veränderungen zeigen, bietet die μCT eine tiefergehende Beurteilung der OA-Veränderungen als die histologische Überprüfung, da eine gesamte Probe anstelle eines oder weniger Gewebeschnitte gescannt wird18. Darüber hinaus ermöglicht es objektivere Messungen des Ausmaßes knöcherner Läsionen sowohl in 2- als auch in 3-dimensionalen18. Forscher sollten bestehende Richtlinien konsultieren, wenn sie histologische OA-Veränderungen bewerten, wie z. B. die Richtlinien der Osteoarthritis Research Society International zur histologischen Beurteilung10. Forscher sollten zusätzliche Zusatztests, einschließlich Ganganalysen, in Betracht ziehen, um die OA-Entwicklung eingehend zu charakterisieren34. Während Ganganalysen funktionelle Veränderungen im Laufe der Zeit aufdecken können, entwickeln sich OA-Läsionen lange vor dem Auftreten von Lahmheiten, was μCT zu einem sensitiveren Maß für OA-bedingte Veränderungen in frühen Stadien der Erkrankung macht.

Während Dunkin-Hartley-Meerschweinchen ein robustes Modell für die Untersuchung der OA-Progression und der Auswirkungen neuartiger Therapeutika darstellen, gibt es Einschränkungen bei diesem Modell. Spontane Modelle benötigen in der Regel einen längeren Untersuchungszeitraum im Vergleich zur raschen Entwicklung von Veränderungen nach chirurgischer oder chemisch induzierter OA35. Dies kann zu erhöhten Kosten und Studiendauer führen. Wie bereits beschrieben, variiert der Beginn von OA bei Tieren gleichen Alters, was eine serielle Beurteilung von OA-bedingten Veränderungen erforderlich machenkann 36. Trotz dieser Variation können die Forscher davon ausgehen, dass alle Dunkin-Hartley-Meerschweinchen ab 3 Monaten OA entwickeln und Veränderungen im subchondralen und trabekulären Knochen zeigen, gefolgt von progressiven OA-Veränderungen im Alter des Tieres im Alter von10,19 Jahren. Forscher können den Effekt der Variabilität zwischen den Tieren reduzieren, indem sie Behandlungen auf eine Gliedmaße in jedem Tier anwenden, so dass die kontralaterale Gliedmaße als interne Kontrolle dienen kann. Obwohl dies über den Rahmen der vorgestellten Methodik hinausgeht, können ultraschallgesteuerte Injektionen dazu beitragen, die Injektionsgenauigkeit weiter zu verbessern, und wurden bei Meerschweincheneingesetzt 37. Die hierin vorgeschlagene Studie beschreibt die Durchführbarkeit einer palpationsgesteuerten Injektion ohne Verwendung dieser bildgebenden Modalität, einer Technik, die auf dem Gebiet weit verbreitet ist37. Während μCT ein leistungsstarkes Werkzeug für die Analyse von Pathologie und Knochenstruktur ist, kann die Verfügbarkeit von Software, die umfangreiche Analysefunktionen unterstützt, zu einer Variabilität zwischen den Benutzern bei den Analysen führen38. In der vorliegenden Studie betrug der Durchmesser des μCT-Scanbettes 6,35 cm, wodurch eine Bildgebung des gesamten Meerschweinchens oder Gelenks in situ verhindert wurde. Größere Bettaufsätze sind im Handel erhältlich, die die Bildgebung ganzer Tiere erleichtern könnten. Obwohl die Software im Allgemeinen benutzerfreundlich ist und mehrere vorgeschlagene Einstellungen bietet, kann es von Vorteil sein, die Einstellungen manuell zu bearbeiten, um eine höhere Auflösung und Genauigkeit zu erzielen. Im Zuge der Weiterentwicklung automatisierter Techniken, einschließlich des maschinellen Lernens, können diese manuellen Anpassungen durch neue, automatische Softwaretechniken ersetzt werden, um die Standardisierung zu verbessern39. Während das vorliegende Manuskript eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das verwendete μCT und die entsprechende Software beschreibt, können dieselben Analysen auch mit anderen Marken und Software durchgeführt werden; Forscher sollten die entsprechenden Benutzerhandbücher konsultieren, um Bildanalysen beim Einsatz unterschiedlicher Maschinen und/oder Software zu optimieren und zu standardisieren. Um die Variabilität zu reduzieren, ist es wichtig, für alle Stichproben die gleichen Einstellungen beizubehalten. Die Subjektivität von Bildanalysen kann weiter reduziert werden, indem Analysen von mehreren, verblindeten Experimentatoren repliziert werden.

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte Anleitung zur Durchführung eines technisch anspruchsvollen Verfahrens bei Meerschweinchen und anschließenden μCT-Analysen der damit verbundenen OA-Veränderungen zu geben. Die Standardisierung von Technik und Datenanalysen wird dazu beitragen, Kosten zu minimieren und die Effizienz zu steigern.

Danksagungen

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Die in diesem Manuskript skizzierte Forschung wurde vom South Carolina SmartState® Stiftungslehrstuhl für Drug Discovery Endowment Funds (PMW), der MUSC Division of Laboratory Animal Resources und dem MUSC Drug Discovery Core unterstützt. Diese Veröffentlichung wurde auch vom National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter den Fördernummern TL1 TR001451 und UL1 TR001450 sowie vom National Institute of Dental & Craniofacial Research der National Institutes of Health unter der Fördernummer R01DE029637 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
200 Proof EthanolDecon Laboratories2701Sterilisationsmittel
3D. SUITE-SoftwareBrukerμ-CT Analysesoftware
Betadine Chirurgisches PeelingAvrio Health67618-151-16Sterilisationsmittel
Insulinspritze mit NadelUlticare91008zur Durchführung von
Injektionen IsofluranPiramal803249Anästhesiegröße Tier
Neutral gepuffertes FormalinFisher Scientific23-427098Fixieren Sie Gewebe
Nrecon SoftwareBrukerμ-CT Rekonstruktionssoftware
Phosphatgepufferte KochsalzlösungCytivaSH30258.01Kontroll- und Verdünnungsmittel
SkyScan 1176Brukerzum Scannen von Proben 

Referenzen

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