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Summary

Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.

Abstract

Die Genom-Editing-Technologie wird häufig eingesetzt, um genetisch veränderte Tiere, einschließlich Ratten, zu züchten. Die zytoplasmatische oder pronukleäre Injektion von DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Cas-Reagenzien ist die häufigste Verabreichungsmethode in Embryonen. Diese Art der Mikromanipulation erfordert jedoch den Zugang zu spezialisierten Geräten, ist mühsam und erfordert ein gewisses Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus führen Mikroinjektionstechniken aufgrund der mechanischen Belastung des Embryos oft zu einer geringeren Überlebensrate des Embryos. In diesem Protokoll haben wir eine optimierte Methode entwickelt, um große DNA-Reparaturschablonen zu liefern, die in Verbindung mit der CRISPR-Cas9-Genom-Editierung arbeiten, ohne dass eine Mikroinjektion erforderlich ist. Dieses Protokoll kombiniert die AAV-vermittelte DNA-Verabreichung von einzelsträngigen DNA-Spendervorlagen mit der Verabreichung von CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein (RNP) durch Elektroporation, um 2-Zell-Embryonen zu modifizieren. Mit dieser neuartigen Strategie haben wir erfolgreich gezielte Knock-in-Rattenmodelle hergestellt, die DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb mit Wirkungsgraden zwischen 42 % und 90 % einfügen.

Introduction

Die Entwicklung von CRISPR-basierten Genom-Editierungswerkzeugen hat unsere Fähigkeit beschleunigt, neue und anspruchsvollere gentechnisch veränderte Rattenmodelle effizient zu erstellen. Single-guide-RNA wird zusammen mit Cas9-Nuklease kombiniert, um Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) zu bilden, die auf DNA-Sequenzen von Interesse innerhalb des Genoms abzielen und zu doppelsträngigen DNA-Brüchen führen. Da zelluläre DNA-Reparaturmechanismen fehleranfällig sind, werden während des Reparaturprozesses Insertionen und Deletionen (INDELs) eingeführt, die die Funktion eines Zielgens stören können. Wenn eine gewünschte modifizierte DNA-Sequenz (Reparatur-Matrize) zusammen mit Genom-Editing-Reagenzien verabreicht wird, erfolgt das Einfügen der Reparatur-Matrize in die Region, die den doppelsträngigen DNA-Bruch enthält, durch einen Prozess, der als homologiegesteuerte Reparatur (HDR) bezeichnet wird. Dies ist eine effektive Strategie zur Generierung von Tiermodellen mit gezielten DNA-Insertionen/-Substitutionen (Knock-Ins). Eine Einschränkung besteht darin, dass Knock-in-Sequenzen oft sehr groß sind, was nachweislich die Effizienz der Geneditierung verringert und somit die Generierung des gewünschten Modells erschwert¹. Zu den Strategien zur Steigerung der Knock-in-Effizienz gehörten die Linearisierung von Reparaturschablonen für doppelsträngige DNA (dsDNA) und einzelsträngige DNA (ssDNA) sowie die chemische Modifikation von DNA-Reparaturschablonen ^2,3,4. Darüber hinaus wurde die pronukleäre Mikroinjektion zusammen mit HDR-stimulierenden Verbindungen, die Anwendung von elektrischen Impulsen in Verbindung mit der Mikroinjektion und die zeitgesteuerte Mikroinjektion in 2-Zell-Embryonen versucht ^5,6,7. Trotz des Erfolgs einiger dieser Ansätze bleibt der Einbau von DNA-Sequenzen, die größer als 1,0 kb sind, technisch anspruchsvoll.

Die Elektroporation, eine gängige Methode zum Einbringen von Reagenzien in kultivierte Zelllinien, bietet eine Alternative zur Mikroinjektion zur Verabreichung von CRISPR-Cas9-Komponenten in Embryonen. Die Elektroporation von Embryonen, die erstmals in Rattenembryonen⁸ nachgewiesen wurde, wurde seitdem erfolgreich als Verabreichungsmethode bei Mäusen 9,10,11,12,13, Schweinen ^14,15 und anderen Tiermodellorganismen eingesetzt 16,17,18. Die Embryonen, die in dem Medium mit den CRISPR-Cas9-Reagenzien suspendiert sind, werden in eine Küvette oder auf einen Objektträger zwischen zwei Elektroden gegeben und direkten elektrischen Stromimpulsen ausgesetzt. Dadurch entstehen vorübergehende Öffnungen in der Zona pellucida und der Plasmamembran des Embryos, durch die die CRISPR-Cas9-Komponenten in die Embryonen gelangen. Typischerweise werden elektrische “Poring”-Impulse auf mittlerer Ebene verwendet, um die temporären Öffnungen zu erzeugen, gefolgt von elektrischen “Transferimpulsen” auf niedrigerer Ebene, die die Bewegung der negativ geladenen Genom-Editing-Komponenten erleichtern. Die Elektroporation von Embryonen ist effizient, hat einen hohen Durchsatz und ist einfach durchzuführen. Während sich die Elektroporation von Embryonen bei der Einführung kleiner (^<200 bp) ssDNA-Reparaturschablonen als sehr erfolgreich erwiesen hat, gibt es nur wenige Berichte über eine erfolgreiche Elektroporation größerer (^>1,0 kb) Reparaturschablonen^13,19. Diese Größenbeschränkung stellt eine wesentliche Einschränkung der Embryo-Elektroporation für die Erzeugung von Knock-in-Tiermodellen dar, die große Insertionen erfordern.

Im Rahmen der Gentherapie werden Adeno-assoziierte Viren (AAVs) aufgrund ihrer effizienten In-vivo-Infektiosität sowohl von sich teilenden als auch von sich nicht teilenden Zellen, ihrer fehlenden Pathogenität und ihrer seltenen genomischen Integration seit langem als Vehikel für die Verabreichung von genetischem Material verwendet^20,21. In jüngster Zeit wurden in weiteren Studien AAVs mit der CRISPR-Cas9-Technologie kombiniert, um DNA-Reparaturschablonen und CRISPR-Reagenzien einzuführen 22,23,24. Dieser Ansatz ermöglicht die Verabreichung größerer DNA-Reparaturschablonen, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind.

Der HDR-Signalweg ist in den späten S- und G2-Phasen des Zellzyklus aktiver^25,26. In in vitro durchgeführten Studien wurden signifikante Steigerungen der Knock-in-Effizienz durch die Verabreichung von CRISPR-Cas9-RNPs und DNA-Reparatur-Templates in G2-synchronisierte Zellen oder durch die Beschränkung des Vorhandenseins des Cas9-Proteins auf späte S- und G2-Phasen unter Verwendung eines Cas9-Geminin-Fusionsproteins² erreicht. Darüber hinaus gibt es ein wichtiges zygotisches Genomaktivierungsereignis (ZGA), das während der verlängerten G2-Phase des Embryos im 2-Zell-Stadium auftritt und mit einem offenen Chromatinzustand verbunden ist. Es wird spekuliert, dass dies den CRISPR-Cas9-RNPs und Reparaturvorlagen einen besseren Zugang zur genomischen DNA verschafft.

Unser Ziel war es, auf all diesen Beobachtungen aufzubauen, indem wir den AAV-Ansatz mit der Elektroporation von Embryonen kombinierten, um CRISPR-Cas9-RNPs im 2-Zell-Stadium der Embryonalentwicklung einzuführen. Diese Strategie nutzt die größere DNA-Reparatur-Template-Lieferkapazität von AAV, die technische Leichtigkeit der Elektroporation und den optimaleren 2-Zell-Zeitpunkt für die genomische Zugänglichkeit während der Embryonalentwicklung, um eine effiziente Methode für die gezielte Genmanipulation von DNA-Insertionen zu schaffen. Wie in diesem Protokoll hervorgehoben, ermöglicht unsere optimierte Methode die Herstellung von gezielten Knock-in-Rattenmodellen mit Insertionen von DNA-Sequenzen mit einer Größe von 1,2 bis 3,0 kb, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind.

Protocol

Alle Versuchsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Missouri (ACUC-Protokoll #25580) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Leitfadens für die Verwendung und Pflege von Labortieren durchgeführt.

1. AAV-vermittelte Lieferung von DNA-Reparaturschablonen

1. Entwerfen Sie das DNA-Konstrukt so, dass es die gewünschte Knock-in-Sequenz zwischen zwei Homologiearmen enthält. Typische Homologie-Armlängen sind 300-500 bp lang. Stellen Sie sicher, dass das gesamte DNA-Reparatur-Template (Homologiearme + gewünschte Knock-in-Sequenz) von invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) flankiert wird, indem Sie in ein geeignetes Plasmid-Rückgrat klonieren und in rekombinantes ssAAV1 oder ssAAV6 (Serotypen 1 oder 6) verpacken.
   HINWEIS: Wenn die sgRNA-Zielsequenz in der DNA-Reparaturvorlage vorhanden ist, ist es wichtig, stille Mutationen zu entwickeln, um diese Sequenz zu stören und so eine CRISPR-Cas9-vermittelte Editierung des korrekt anvisierten Allels zu verhindern.
   VORSICHT: Rekombinante virale AAV-Vektoren sind nicht integrierend und als BSL-1 klassifiziert. Für das Pipettieren und die Handhabung von Embryonen, die dem Virus ausgesetzt waren, werden aseptische Standardtechniken verwendet.
2. Künstlich hergestelltes ssAAV1 oder ssAAV6 (verpackt mit DNA-Reparatur-Template) zu 30 μl KSOM-R-Medium^27,28 bis zu einer Endkonzentration von 3 × 10⁷ Genomkopien (GC)/μl unter Mineralöl in 35 mm Petrischale geben.
3. Platzieren Sie Zygoten mit sichtbaren Vorkernen in das KSOM-R-Medium, das technisch hergestelltes ssAAV enthält.
   HINWEIS: Bei Verwendung dieses Protokolls ist es nicht erforderlich, die Zona pellucida zu verdünnen, da die AAV-Serotypen 1 und 6 in der Lage sind, die DNA-Reparaturschablonen für eine effiziente Verabreichung von DNA-Reparaturschablonen leicht zu passieren.
4. Bei 37 °C mit 5 % CO₂ und maximaler Luftfeuchtigkeit für 18-20 h inkubieren, um eine ausreichende Virustransduktion zu ermöglichen.

2. Vorbereitung der Elektroporation

1. Am nächsten Tag wird eine Elektroporationsmischung mit 100 ng/μl sgRNA und 100 ng/μl Cas9-Protein, verdünnt in Opti-MEM-Medien in einem sterilen RNase-freien Röhrchen hergestellt. Vorsichtig mischen.
2. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die RNP-Bildung zu ermöglichen.
3. Schalten Sie während der Inkubationszeit den Elektroporator ein und schließen Sie die Kabel an eine Glasschieberelektrode mit einem Abstand von 1,5 mm an.
4. Stellen Sie die Elektroporationsparameter wie in Tabelle 1 beschrieben ein.

3. Elektroporation von 2-Zell-Embryonen

1. Pipettieren Sie vorsichtig 5 μl der CRISPR-Elektroporationsmischung zwischen die beiden Elektroden auf dem Objektträger, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Luftblasen in die Lösung gelangen.
2. Entfernen Sie den Embryo im 2-Zell-Stadium aus der AAV-Lösung. Bringen Sie Embryonen im 2-Zell-Stadium in die Mischung, ohne dass sie die Seiten der Elektroden berühren. Dies geschieht, um eine Lyse zu vermeiden.
3. Drücken Sie die Ohm-Taste , um die Impedanz zu messen. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz zwischen 0,100 und 0,300 kΩ liegt. Das Reaktionsvolumen ändert die Impedanz (Volumen hinzufügen, um die Impedanz zu verringern, und Volumen subtrahieren, um die Impedanz zu erhöhen).
4. Drücken Sie auf Start. Der Vorgang dauert nur wenige Sekunden.
5. Die Embryonen werden unmittelbar nach der Elektroporation entnommen und 3 Mal in frischen 30-μl-Tropfen KSOM-R-Medien gewaschen.
6. Die Embryonen werden wieder in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 %_CO2 und maximaler Luftfeuchtigkeit für die In-vitro-Kultur in 500 μl Tropfen KSOM-R-Medien unter Mineralöl gelegt. Alternativ können Embryonen chirurgisch auf eine 1,5 Tage postkoitum (dpc) pseudoschwangere weibliche Ratte übertragen werden, um lebende Nachkommen zu zeugen.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der AAV-vermittelten DNA-Verabreichung und der 2-Zell-Embryo-Elektroporations-Pipeline für die CRISPR-Cas9-Genom-Editierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Representative Results

Discussion

Das Genom-Editing-System CRISPR-Cas hat die Gentechnik revolutioniert, indem es die effiziente Herstellung sowohl einfacher als auch komplexer, maßgeschneiderter genetischer Veränderungen in einer Vielzahl von Tierarten ermöglicht. Häufige Verfeinerungen und Verbesserungen der Techniken im Zusammenhang mit der Genom-Editierung erhöhen seine Vielseitigkeit. Hier haben wir einen neuen Ansatz beschrieben, der die ssAAV-vermittelte DNA-Verabreichung zusammen mit der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen von CRISPR-Cas9-Reagenzien in 2-Zell-Nagetierembryonen verwendet. Wir haben gezeigt, dass dies ein effektiver Weg ist, um gezielte Knock-in-Tiermodelle herzustellen.

Ein großer Vorteil der Verwendung von AAV besteht darin, dass sie die Verabreichung größerer DNA-Reparaturschablonen in Embryonen ermöglicht, ohne dass Mikroinjektionstechniken erforderlich sind. Die AAV-vermittelte Verabreichung hilft auch, die Größenbeschränkungen der DNA-Matrizen bei der alleinigen Elektroporation zu umgehen. Bei der Verwendung von AAV gibt es jedoch einige wichtige Überlegungen. Die Zona pellucida, die gehärtete Glykoproteinmatrix, die die befruchtete Eizelle umgibt, dient als physikalische Barriere, die die Abgabe von Nukleinsäuren oft erschwert. Die Ausdünnung der Zona pellucida ist eine gängige Technik, die für einen besseren Zugang zum Embryo verwendet wird. Einige Studien haben jedoch berichtet, dass die Embryonalentwicklung durch eine Infektion mit höheren Dosen (1 ×^{10 7} GC/μL bis 1 × 10⁹ GC/μL) AAV bei Embryonen, bei denen die Zona pellucida vor der AAV-Infektion ausgedünnt war, behindert wird²². Es gibt jedoch einige Serotypen von AAV, die über die Zona pellucida²⁹ diffundieren können. Unser Protokoll beinhaltet keine Ausdünnung der Zona pellucida und verwendet AAV mit den Serotypen 1 und 6 in einer Konzentration von 3 ×^{10 7} GC/μl, um höhere Knock-in-Raten als zuvor veröffentlichte Berichte zu erzielen. Eine verminderte Embryonalentwicklung konnten wir unter diesen Bedingungen nicht feststellen.

Die hohe Knock-in-Effizienz, die durch die Elektroporation von 2-Zell-Embryonen erreicht wird, ist höchstwahrscheinlich auf die verlängerte G2-Phase in Embryonen in diesem Entwicklungsstadium zurückzuführen, was dies zu einem optimalen Entwicklungsstadium für die Durchführung der Elektroporation macht. Eine mögliche Komplikation ist jedoch die beobachtete Zellfusion, die bei einigen 2-Zell-Embryonen während des Elektroporationsprozesses beobachtet wurde. Diese Beobachtung ist nicht überraschend, wenn man bedenkt, dass Elektrofusionsverfahren üblicherweise zur Verschmelzung von Säugetierzellen verwendet werden und die Fusion möglicherweise durch sorgfältige horizontale statt vertikale Ausrichtung zwischen den Elektroden^30,31 vermieden werden kann. Wenn die Genom-Editierung in einem späteren Entwicklungsstadium erfolgt, z. B. 2-Zell statt 1-Zelle, besteht außerdem ein größeres Potenzial für einen erhöhten Mosaizismus. Mit unserem 2-Zell-Elektroporationsansatz beobachteten wir einen leichten Anstieg des Mosaizismus im Vergleich zur pronukleären Injektion (86 % für den AAV-Ansatz und 67 % für den PNI-Ansatz) im 1-Zell-Stadium, konnten aber dennoch eine Keimbahnübertragung des modifizierten Allels bei allen getesteten Gründertieren erreichen. Ein weiteres potenzielles Problem ist die Möglichkeit der Tandem-Verkettungsintegration von AAV-abgeleiteten DNA-Templates. Während wir für die in diesem Protokoll beschriebenen Modelle keine Long-Read-Sequenzierung durchführten, bestätigten wir die Einzelintegration der DNA-Templates für alle Modelle unter Verwendung der Droplet-Digital-PCR (ddPCR)-Kopienzahlvariation.

Während unsere Methode die AAV-Verabreichung von DNA-Sequenzen von Interesse beinhaltete, sollte es möglich sein, andere virale und nicht-virale vermittelte DNA-Verabreichungsansätze in Verbindung mit der Elektroporation von Embryonen zu verwenden, um Embryonen erfolgreich genetisch zu manipulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von ssAAV-vermittelter DNA-Verabreichung und Elektroporation von CRISPR-Cas9-RNPs in Embryonen im 2-Zell-Stadium eine effiziente und leicht anpassbare Methode zur effizienten Generierung von Knock-in-Rattenmodellen ist.

Materials

Leads with alligator clips for electrodes	NepaGene	C117
Mineral oil	MilliporeSigma	M5310
NepaGene21 Super Electroporator 	NepaGene	NEPA21
Platinum plate electrodes on slide glass	NepaGene	CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein	MilliporeSigma	PECAS9
sgRNA (chemically-modified)	Synthego	N/A
ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template	Vectorbuilder	N/A