Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.

Zusammenfassung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein transparenter, nicht-parasitärer Fadenwurm mit einer einfachen Biologie, was ihn durch die Färbung der Zellen oder ihres molekularen Inhalts zu einem großartigen Werkzeug für den Unterricht in den Biowissenschaften macht. Der Lugol-Farbstoff (Jod-Kaliumiodid-Lösung) wird in der Biochemie häufig zur Färbung von Glykogenspeichern verwendet. In diesem Zusammenhang ist es möglich, Unterschiede zwischen gefütterten und ausgehungerten Tieren zu beobachten, neben den Auswirkungen unterschiedlicher Bedingungen, wie z. B. unterschiedlicher Ernährung und Sauerstoffgehalt. Erioglaudin ist ein blauer Farbstoff, der auf den Verlust der Darmbarriere hinweist. Wenn die Darmbarriere intakt ist, färbt sich der blaue Farbstoff im Lumen ab; Wenn diese Integrität jedoch gestört ist, tritt der Farbstoff in die Körperhöhle ein. Mit einem Stereomikroskop oder einem Mikroskop können Lehrer physiologische und biochemische Veränderungen nachweisen oder sie können die Schüler dazu anregen, eine wissenschaftliche Frage zu stellen und ihre Hypothese mit diesen Assays zu stellen und zu testen. Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Färbetechniken bei C. elegans , die von den Studierenden leicht durchgeführt werden können.

Einleitung

Der Unterricht in Biowissenschaften in der Oberstufe ist eine ständige Herausforderung. Insbesondere der Zugang und die Nutzung von Technologie haben wichtige Fortschritte im Lehr-Lern-Prozess gebracht, aber Tools wie Chatbots mit künstlicher Intelligenz erschweren die Rationalisierung und Suche nach Beweisen aufgrund einfacher (und manchmal falscher)^{Antworten 1.} Aus diesem Grund ist die Verwendung einer wissenschaftlichen Methode mit praktischem Experimentieren in einem forschungsbasierten Ansatz im Unterricht eine wichtige Strategie, um kritisches Denken, Kreativität und technische Fähigkeiten bei den Schülern zu entwickeln oder zu stimulieren².

In diesem Zusammenhang wurde der freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans aufgrund seiner besonderen Vorteile erfolgreich in Versuchen zu Lehrzwecken³ eingesetzt: Er ist kein Parasit und die zur Fütterung verwendeten Escherichia coli entsprechen der Biosicherheitsstufe 1, wodurch die biologische Gefahr nahezu Null reduziert wird; Es hat eine elegante und quantifizierbare Fortbewegungsbewegung, die für die Schüler interessant zu beobachten ist; Und es ist transparent, was die Beobachtung von Organen, aber auch die Färbung mit Pigmenten ermöglicht, die auf das Vorhandensein von Biomolekülen oder das Auftreten physiologischer Veränderungen hinweisen^{können 4}. Daher ist es möglich, einfache Postulate in Bezug auf Biochemie und physiologische Veränderungen wie das Altern zu stellen und im Unterricht zu testen.

Glykogen ist ein Speicherkohlenhydrat, das aus einer langen und verzweigten Kette von Glukosemolekülen besteht, die aus Glucosylresten mit (1→4)-α glykosidischen linearen Bindungen und (1→6)-α glykosidischen Bindungen an Verzweigungspunkten gebildet werden und besonders wichtig für die Muskelkontraktion, die Zelldifferenzierung und die Aufrechterhaltung der Glykämie^{sind 5}. Glykogen wird nach der Fütterung aufgrund der Insulinaktivierung des Enzyms Glykogensynthase synthetisiert. Während des Trainings oder des Fastens aktivieren Adrenalin bzw. Glucagon die Glykogenphosphorylase und bauen daher das Polysaccharid ab, um die Muskelzellen mit Glucose-6-phosphat zu versorgen oder freie Glukose freizusetzen, um Hypoglykämie^{zu umgehen 6,7}. Veränderungen des Glykogenspiegels beeinflussen die Zelldifferenzierung, die Signalgebung, die Redoxregulation und die Stammzellen unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen, einschließlich Krebs⁸. Bei C. elegans kommt Glykogen hauptsächlich in der Speiseröhrenmuskulatur, der Unterhaut, im Darm, in den Neuronen und hauptsächlich in der Körperwandmuskulatur^{vor 9}. Der Glykogengehalt kann mit der Lugolschen Jodlösung gemessen werden, da Jod in die spiralförmigen Spiralen bindet und einen Jod-Glykogen-Komplex bildet, der eine sichtbare scharfe blau-schwarze oder braun-schwarze Farbe ergibt, die erfolgreich zum Nachweis des Glykogengehalts in C. elegans¹⁰ verwendet wurde. Es wurde gezeigt, dass die Glykogenakkumulation, die durch eine hohe Glukosefütterung verursacht wird, die Lebensdauer des Wurms verkürzen und somit den Alterungsprozess beschleunigen^{kann 11,12}. Darüber hinaus können Stoffwechselstörungen, andere Hormone und die Exposition gegenüber Xenobiotika den Glykogenstoffwechsel ebenfalls verändern^13,14. Daher sind Experimente zum Glykogengehalt in C. elegans sehr interessant, da verschiedene Faktoren den Stoffwechsel stören können und eine Diskussion im Unterricht über grundlegende Biochemie im Zusammenhang mit Querschnittsthemen wie Bewegung, Ernährung, Krankheiten und Altern anregen können.

Altern ist ein zeitabhängiger Funktionsverlust, der durch zelluläre Schäden verursacht wird. Diese Schädigung kann mit oxidativem Stress, Telomerabrieb, Verlust der Proteostase, Entzündungen und sogar mit der Anhäufung unlöslicher Polyglucosankörper¹⁵ verbunden sein, um nur einige zu nennen. Eines der Kennzeichen des Alterns ist die Verringerung der Darmintegrität, die mit mehreren chronischen Erkrankungen verbunden ist, die während des Lebens eines Organismus auftreten¹⁶. Die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase hängt von der Integrität des Darmepithels ab, das durch Verbindungsproteine unterstützt wird, die eine physikalische Barriere bilden und benachbarte Epithelzellen verbinden. Bei einer Schädigung dieses Epithels kommt es zu einem Austritt des Luminalgehalts in das Interstitium¹⁷. Basierend auf diesem Mechanismus wurde der Schlumpf-Test verwendet, um die Darmintegrität in mehreren Tiermodellen zu überprüfen, da dieser blaue Farbstoff Erioglaucin-Dinatriumsalz die Darmmembran nicht durchdringt und im Lumen^{verbleibt 18}. Wenn Würmer mit einem Krankheitserreger infiziert sind, mit einigen Giftstoffen kontaminiert sind oder altern, wodurch die interstitielle Integrität verändert wird, überwindet der Farbstoff die Barriere und breitet sich über den ganzen Wurm aus, der ganz blau wird. Dieser Assay ermöglicht es, die Physiologie des Alterns zu diskutieren und mit Faktoren zu experimentieren, die diesen Prozess beschleunigen oder verzögern können, indem sie Würmer verschiedenen Bedingungen aussetzen. Die Protokolle hier beschreiben im Detail diese beiden farbstoffbasierten Methoden, die leicht im Unterricht durchgeführt werden können, um die Schüler dazu anzuregen und zu stimulieren, Hypothesen in Bezug auf Biochemie und Physiologie zu formulieren und zu testen.

Der erste Teil des Protokolls zeigt seine Anwendbarkeit zur qualitativen und quantitativen Analyse des Glykogengehalts in C. elegans Modell¹⁰. Der zweite Teil des Protokolls dient der Beurteilung der Integrität des Darms von C. elegans . Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Alterung von C. elegans , indem die Integrität der Darmmembranen bewertet wird. Darüber hinaus ermöglicht es zu beurteilen, ob eine Substanz das Altern beschleunigt oder verzögert und ob Substanzen ein toxisches Potenzial für die Darmbarriere haben¹⁹.

Der für die vorliegende Studie verwendete C . elegans-Stamm war der Bristol N2-Wildtyp. Das Verfahren kann jedoch mit Stämmen repliziert werden, die vergleichbare Wachstumsraten aufweisen, oder die Methode muss je nach Bedarf an den Gerätewechsel angepasst werden, da sie die gleiche oder eine ähnliche Funktion haben, oder abhängig vom verwendeten Stamm, da bestimmte Stämme besondere Anforderungen an die Wartung und/oder Empfindlichkeit stellen; Diese Informationen können vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder der WormBase-Website bezogen werden. Diese Änderungen sollten die Reproduzierbarkeit der Methode nicht beeinträchtigen.

Protokoll

HINWEIS: Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) Bakterien und Bristol N2 Wildtyp-Stämme können von der CGC, University of Minnesota, USA, oder durch Spende von einem C. elegans-Labor bezogen werden. Für die Sicherheit der Forscher ist es unerlässlich, persönliche Schutzausrüstung zu verwenden. Obwohl die Konzentrationen von Reagenzien wie Hypochlorit und Natriumhydroxid niedrig sind, ist es wichtig, die empfohlene PSA zu tragen, wie im Manuskript hervorgehoben, um mögliche Risiken im Zusammenhang mit diesen Chemikalien zu minimieren.

1. Glykogengehalt

1. Vorbereitung von Testplatten
   1. Bereiten Sie sechs 60 mm x 15 mm große NGM-Agarplatten²⁰ (10 ml Nematoden-Wachstumsmedien-Agar, NGM, wie in der ergänzenden Tabelle 1 beschrieben) pro Wurmstamm vor und lassen Sie sie 1 Tag lang bei Raumtemperatur trocknen. Halten Sie die Platten geschlossen, um eine Kontamination zu vermeiden.
   2. Fügen Sie 200 μl E . coli OP50 Flüssigkultur (mit einer optischen Dichte = 0,600, ungefähr bei einer Wellenlänge von 600 nm) pro Platte hinzu, um insgesamt vier 60 mm x 15 mm große NGM-Platten pro Stamm in der Strömungshaube zu beimpfen. Lassen Sie die geschlossenen Platten 1 Tag lang bei 37 °C inkubieren, bevor Sie sie verwenden.
      HINWEIS: Bereiten Sie sechs Platten vor (Schritt 1.1), aber impfen Sie nur 4 mit E. coli OP50-Bakterien. Bewahren Sie die restlichen zwei Platten bei 4 °C für die spätere Verwendung auf, wenn Sie die Würmer unter Hungerbedingungen stellen. Diese Analyse kann doppelt durchgeführt werden.
   3. Am Testtag werden 200 μl 0,025 M D-Glucose auf zwei (6 mm x 15 mm) NGM-Agarplatten pro Stamm gegeben, die zuvor mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt wurden. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur in der Strömungshaube trocknen.
      HINWEIS: Die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelten NGM-Agarplatten können alternativ zur Verwendung einer Strömungshaube auch in der Nähe von Alkohollampen getrocknet werden.
2. Synchronisation
   1. Ca. 3 Tage vor der Synchronisation werden 3-4 Stücke (3 cm x 3 cm) von einem Erhaltungs-NGM-Agar mit C. elegans Bristol N2 (Wildtyp) in verschiedenen Stadien (ca. 500 Würmer pro Stück) auf eine neue Platte (150 mm x 90 mm) übertragen, die zuvor mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt wurde.
   2. Stellen Sie die neue Platte mit den Würmern in eine kontrollierte Umgebung bei 20 °C und halten Sie die Luftfeuchtigkeit 3 Tage lang >95 % (72 h lassen die meisten Würmer das trächtige Erwachsenenstadium erreichen).
      HINWEIS: Die Wachstumstemperatur muss je nach verwendetem/den verwendeten C. elegans-Stamm (en) möglicherweise angepasst werden.
   3. Sammeln Sie mit einer Pasteurpipette die Würmer aus der vorbereiteten Platte mit destilliertem H₂O und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
   4. Warten Sie, bis die Würmer durch die Schwerkraft sedimentiert sind (ca. 15 Minuten) und entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x, um die Bakterien zu eliminieren. Reduzieren Sie nach der letzten Wäsche das Volumen auf 5 ml.
   5. Fügen Sie 10 ml Bleichlösung hinzu (Ergänzende Tabelle 1) und schütteln Sie sie ca. 6 Minuten lang kräftig mit den Händen.
   6. Unmittelbar nach Beendigung des Schüttelns füllen Sie die Röhrchen mit M9-Puffer bis zu einem Fassungsvermögen von 50 ml.
   7. Zentrifugieren Sie 3 min lang bei 1400 x g , entfernen Sie den Überstand bis zu 5 mL und fügen Sie dann wieder 45 mL M9-Puffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x.
   8. Reduzieren Sie das Volumen nach dem letzten Waschen auf 15 ml und halten Sie es ca. 14 Stunden lang bei kontrollierter Temperatur (20 °C) und Luftfeuchtigkeit (>95 %).
      HINWEIS: Der Synchronisationsprozess kann durch die Gewinnung von Eiern durch Eiablage ersetzt werden: Übertragen Sie ca. 20 erwachsene trächtige Würmer auf eine NGM-Platte (6 mm x 15 mm), die zuvor mit 200 μl E. coli OP50 besät wurde. Lassen Sie die Würmer 1 Tag lang Eier legen. Entfernen Sie danach die trächtigen Würmer und warten Sie, bis die Eier geschlüpft sind.
3. Vorbereitung von Würmern
   1. Mit einer automatischen Pipette werden 10 μl der synchronisierten Würmer (Schritt 1.2.8) auf einen Objektträger gegeben und die Anzahl der Würmer gezählt. Berechnen Sie, wie viel Volumen pipettiert werden muss, um 500-1000 Würmer/μl zu erhalten.
   2. 500-1000 L1 synchronisierte Würmer (Schritt 1.2.8) werden auf NGM-Agarplatten (150 mm x 90 mm, Ergänzende Tabelle 1), die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind, als Nahrungsquelle übertragen, bis sie bei 20 °C das Larvenstadium 4 (L4) erreichen.
      HINWEIS: Würmer können mit einer automatischen Pipette übertragen werden. Wenn keine automatische Pipette verfügbar ist, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas, und das Volumen kann mit Mikroröhrchenetiketten oder Messpipetten aus Glas gesteuert werden.
   3. Nach 48 h Synchronisation²⁰: Sammeln Sie die L4-Larven von den Platten mit M9-Puffer (Ergänzende Tabelle 1), mit Hilfe einer Plastik-Pasteurpipette in ein sauberes konisches Röhrchen 50 mL und waschen Sie sie 3x mit frischem M9-Puffer oder wiederholen Sie die Wäschen, bis alle verbleibenden E. coli OP50-Bakterien vollständig entfernt sind (bei Raumtemperatur).
      HINWEIS: Der Waschschritt ist wichtig, da einige Würmer während des Eingriffs verhungern.
4. Ausführen des Assays
   1. Übertragen Sie 500-1000 L4-Würmer (Schritt 1.3.1) aus jeder der neuen NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm), die zuvor vorbereitet wurden (Schritte 1.1.2 und 1.1.3). Halten Sie sie bis zum Testtag 48 Stunden lang bei 20 °C. Dieser Zeitplan führt zu drei Versuchsgruppen wie folgt, in doppelter Ausführung (Abbildung 1):
      A- (Hunger): Würmer wachsen auf normalen NGM-Agarplatten ohne E. coli OP50-Bakterien;
      B- (regulär): Würmer wachsen auf normalen NGM-Agarplatten, die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind;
      C- (hoher Glukosespiegel): Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind und 0,025 M D-Glukose enthalten.
   2. Am Testtag (nach 48 h): Sammeln Sie die Würmer und waschen Sie sie dreimal kurz im M9-Puffer (Schritte 1.2.2 und 1.2.3)
      HINWEIS: Bereiten Sie hier NGM-Agarplatten unter Zugabe von D-Glukose vor (Schritt 1.3) und stellen Sie sie beiseite, bis es Zeit ist, die Würmer hinzuzufügen.
      1. Jodfärbung: Bereiten Sie eine 5%ige (v/v) Lugolsche Jodlösung (Jod/Kaliumiodid-Lösung) mit frischem M9-Puffer vor.
         HINWEIS: Lugols Jodlösung kann von lokalen Reagenzienlieferanten oder Apotheken bezogen werden, daher kann die Anfangskonzentration variieren. Falls erforderlich, berechnen Sie, um eine 5%ige (v/v) Lösung zu erhalten.
   3. Übertragen Sie ca. 100 μl gewaschene Würmer (Schritt 4.2) aus jeder Gruppe in das 1,5-ml-Mikroröhrchen mit verdünnter Lugol-Lösung (5 % v/v). Mit einer automatischen Pipette im Verhältnis 1:5 werden 100 μl Würmer auf 400 μl Lugol-Lösung übertragen, gefolgt von einem sanften Rühren in einem Mischer für 5 Minuten.
      HINWEIS: Wenn kein Mischer verfügbar ist, können die Mikroröhrchen vorsichtig mit den Händen geschüttelt werden.
   4. Gleich nach diesen 5 Minuten zentrifugieren Sie das 1,5 mL Mikroröhrchen (Würmer + Lugol-Lösung) bei 1400 x g für 3 min.
      HINWEIS: Wenn dieser Assay an Würmern aus dem L4-Stadium oder darüber hinaus durchgeführt wird, ist es möglich, eine Schwerkraftsedimentation anstelle einer Zentrifuge zu erreichen. Lassen Sie die Mikroröhrchen offen in Racks auf der Tischplatte für 10 Minuten, bis sich alle Würmer am Boden des Mikroröhrchens abgesetzt haben.
   5. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Würmer mit 1,0 ml frischem M9-Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche, bis das restliche Jod aus der Lösung entfernt ist (mindestens 3x).
   6. Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand bis auf einen Rückstand von ca. 100 μl entfernt. Verwenden Sie diesen, um die Würmer schonend zu resuspendieren und für mikroskopische Analysen.
   7. Übertragen Sie ca. 50 μl der resuspendierten Wurmlösung auf Mikroskopie-Objektträger und decken Sie diese mit Deckgläsern ab. Betrachten Sie die Hellfeldbilder mit einem Stereomikroskop (bei 1,5x).
      HINWEIS: Wenn kein Stereomikroskop verfügbar ist, kann ein normales Mikroskop verwendet werden, und Bilder können mit einer Handykamera (3,4x) unter Verwendung eines Adapters aufgenommen werden. Um Fehler durch Licht/Helligkeit/Belichtung zu vermeiden, ist es entscheidend, dass alle Einstellungen der Handykamera für alle Bilder gleich bleiben.
5. Daten-Inspektion
   1. Quantitative Daten: Berechnen Sie den Glykogengehalt anhand der Jodfärbung von Würmern.
      1. Speichern Sie Bilder aus dem Stereomikroskop, die mindestens 10 Würmer pro Gruppe enthalten, als .jpeg Datei zur weiteren Verarbeitung. Laden Sie dazu die kostenlose ImageJ-Software herunter. Einzelheiten finden Sie in der Ergänzungsdatei 1, der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Abbildung 2.
      2. Öffnen Sie das .jpeg Image mit der ImageJ-Software (die unter https://imagej.nih.gov/ij/download.html kostenlos heruntergeladen werden kann). Klicken Sie auf Segmentierte Linie und skizzieren Sie den Wurm (einen Wurm nach dem anderen). Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Messen , um die Fleckenquantifizierung zu erhalten. Die Daten werden als Mittelwert in der Tabelle angezeigt. Der Mittelwert gibt die Daten an, die aus der Färbedichte pro Wurmfläche berechnet werden.
   2. Qualitative Daten: Erhalten Sie Bilder vom Stereomikroskop jeder Gruppe und vergleichen Sie visuell die Färbung der Würmer. Erstellen Sie bei Bedarf ein Bewertungssystem, um die Färbung zu analysieren: 0 farblos; 1 leicht gebeizt; 2 fleckig und 3 stark fleckig. Zählen Sie mit dem Stereomikroskop manuell ca. 10 Würmer pro Gruppe (Minimum) mit einem Handzähler.

Abbildung 1: Schema des Assays für den Gesamtglykogengehalt in C. elegans. Ein Schema des hier durchgeführten Experiments zur Durchführung des Glykogengehalts-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Bewertung der Darmpermeabilität

1. Vorbereitung von Würmern
   1. Etwa 14 h nach der Synchronisation (Schritt 1.2.8) werden 500-1000 Würmer (Schritt 1.3.1 und ANMERKUNG) im ersten Larvenstadium (L1) auf jede neue NGM-Agarplatte (60 mm x 15 mm) umgefüllt, die zuvor vorbereitet wurde, und bis zum Tag des Tests bei 20 °C aufbewahrt. Dieser Zeitplan führt zu zwei Versuchsgruppen wie folgt (Abbildung 2):
      A- (jung): Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit dem Bakterium E. coli OP50 besiedelt sind, bis zum Larvenstadium 4 (L4);
      B- (alt): Die Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit dem Bakterium E. coli OP50 besiedelt sind, bis zum 7^. Tag des Erwachsenenalters.
      HINWEIS: Die Würmer, die bis zum 7^. Tag des Erwachsenenalters gehalten werden, müssen jeden Tag mit M9-Puffer gewaschen und auf neue NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) mit 200 μl E. coli OP50-Bakterien übertragen werden, die zuvor als Nahrungsersatz und zur Entfernung der Nachkommen ausgesät wurden. Jüngere Würmer schwimmen während des Dekantierens und können durch Entfernen des Überstands abgetrennt werden. Der Anteil der Schlumpfwürmer nimmt mit zunehmendem Alter zu. Die Bewertung der Darmpermeabilität kann jedoch in jedem Stadium und Alter durchgeführt werden, abhängig vom Zweck der Studie.
2. Ausführen des Assays
   1. Am Testtag L4-Würmer (2 Tage nach Schritt 2.1.1) und adulte Würmer am 7^. Tag (jetzt am 9^. Tag) mit M9-Puffer sammeln (Ergänzende Tabelle 1) und in markierte 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen.
   2. Bei 1400 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand entfernen, 1,0 mL M9 hinzufügen und vorsichtig mischen. Wiederhole diesen Vorgang 3x, um die Bakterien zu entfernen. Reduzieren Sie nach der letzten Wäsche das Volumen auf 500 μL.
   3. Geben Sie mit einer automatischen Pipette 10 μl des Wurmsediments auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Würmer. Berechnen Sie das zu pipettierende Volumen, um 100 Würmer/μl zu erhalten.
   4. Schlumpffärbung: Bereiten Sie eine 25%ige Lösung aus Erioglaucin-Dinatriumsalz (Ergänzende Tabelle 1) mit destilliertem Wasser vor. Verwenden Sie ggf. den Wirbel für eine bessere Solubilisierung.
   5. In neue, zuvor identifizierte Mikroröhrchen wird mit einer automatischen Pipette das Volumen mit 100 Würmern, 100 μl 25%iger Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung, 200 μl E. coli OP50 und komplett mit M9-Puffer für ein Endvolumen von 500 μl hinzugefügt.
      HINWEIS: Die Volumina von Erioglaucin, Dinatrium, E. coli und die Anzahl der Würmer sind festgelegt. Das Volumen des M9-Puffers ist variabel und kann verwendet werden, um das endgültige Volumen auf 500 μL zu bringen.
   6. 3 h unter Rühren in einem Mischer, vor Licht geschützt, bei Raumtemperatur inkubieren.
      HINWEIS: Wenn kein Mixer verfügbar ist, schütteln Sie die Mikroröhrchen alle 15 Minuten vorsichtig mit den Händen.
   7. Nach 3 h zentrifugieren Sie das 1,5 mL Mikroröhrchen bei 1400 x g für 3 min. Entfernen Sie 1,0 mL Überstand und waschen Sie die Würmer mit 1,0 mL M9 Puffer.
   8. Wiederholen Sie die Wäschen, bis die restliche Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung aus der Lösung entfernt wurde. Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand bis auf einen Rest von ca. 250 μl entfernt. Verwenden Sie diesen, um Würmer vorsichtig zu resuspendieren und für die mikroskopische Analyse zu verarbeiten.
   9. Übertragen Sie ca. 50 Würmer der resuspendierten Wurmlösung auf Objektträger und decken Sie diese mit Deckgläsern ab. Inkubieren Sie die Objektträger im Kühlschrank bei -20 °C für 10 min, um die Würmer zu lähmen.
      HINWEIS: Eine weitere Alternative, um die Würmer zu lähmen, besteht darin, 10 μl Levamisolhydrochloridlösung (10 mM ; Ergänzende Tabelle 1) und decken Sie sie mit Deckgläsern ab.
   10. Beobachten und zählen Sie die Gesamtzahl der Würmer und die vollständig gefärbten Würmer mit Hilfe des Hellfeldes in einem Stereomikroskop (bei 1,5x). Bilder können von einer Handykamera (mit 3,4x) in Verbindung mit einem Adapter aufgenommen werden. Um Fehler durch Licht/Helligkeit/Belichtung zu vermeiden, ist es entscheidend, dass alle Einstellungen der Handykamera für alle Bilder gleich bleiben.
3. Daten-Inspektion
   1. Qualitative Daten: Erhalten Sie Stereomikroskopische Bilder von jeder Gruppe (L4 und 7^. Tag des Erwachsenenalters) und vergleichen Sie visuell die Färbung der Würmer.
   2. Zählen Sie die Gesamtzahl der Würmer und die Anzahl der Schlumpfwürmer (Blauwürmer) mit einem Stereomikroskop.
   3. Geben Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Schlumpfwürmer aus, indem Sie die jungen Würmer (L4, als Kontrollgruppe) und die alten Würmer (7^. Tag des Erwachsenenalters) vergleichen:
      A x X = 100 (%) x B
      X = 100 x B / A
      Dabei ist A = Gesamtzahl der Würmer
      B= Anzahl der Schlumpfwürmer

Abbildung 2: Schema des Gesamtpermeabilitätstests für den Darm bei C. elegans. (A) Zubereitung von C. elegans . (B) Färbung mit Erioglaucin-Dinatriumsalz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Der Glykogengehalt-Assay bietet eine robuste und schnelle Methode für das Screening verschiedener Testbedingungen, wie z. B. vergleichende Studien verschiedener Stämme, die die Glykogensynthese oder den Glykogenabbau beeinflussen können. In dieser Studie wurden L4-Würmer drei verschiedenen Testbedingungen unterzogen: Nüchtern-, Fütterungs- und Glukose-angereicherte Gruppen. Der Assay wurde dreimal durchgeführt, wobei jeder Zustand in jedem Assay zweimal repliziert wurde; In Abbildung 3 ist ein repräsentatives Bild dargestellt. Nach jedem Assay wurden die mit Lugoler Jodlösung gefärbten Würmer mit einem Stereomikroskop beobachtet, und es wurde ein qualitativer Vergleich zwischen den Gruppen bezüglich der Färbung der Würmer durchgeführt. In Bezug auf die visuelle Beobachtung zeigten Würmer in der Fastengruppe (Hunger) eine weniger intensive Färbung im Vergleich zu den Würmern, die mit E. coli OP50 (normal) gefüttert wurden, sowie denen, die mit E. coli OP50 und D-Glukose (hoher Glukosespiegel) gefüttert wurden. Zusätzlich zeigten die Würmer, die mit E. coli OP50 und D-Glucose (hoher Glukosespiegel) gefüttert wurden, die intensivste Färbung.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder aus dem Glykogengehalt-Assay. Die Glykogenspiegel in C. elegans wurden durch Jodfärbung bestimmt. Mikroskopische Bilder zeigen repräsentative C. elegans-Würmer , die 48 Stunden lang (A) Hunger, (B) regelmäßigem oder (C) hohem Glukosespiegel ausgesetzt waren. Die Würmer wurden gefärbt, indem sie 5 Minuten lang in eine Lösung von Lugols Jod/M9-Puffer (1%) getaucht wurden, wobei das in Schritt 1.4 beschriebene Verfahren befolgt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ergebnisse der Darmpermeabilität zeigen den Unterschied in der Färbung von jungen Würmern (L4) mit intaktem Darm und alten Würmern (7^. Tag des Erwachsenenalters) mit altersbedingt geschädigten Darmmembranen (Abbildung 4). Der Darm von C. elegans ist ein Gewebe von zentraler Bedeutung für die Gesundheit, da er eine entscheidende Rolle bei der Verdauung und dem Stoffwechsel spielt und als Signalzentrum für die Stressreaktion und die Alterungsregulation dient²¹. Bei jungen Würmern besteht der Darm von C. elegans aus einer starken Barriere, die das Austreten von Darminhalt verhindert. Mit zunehmendem Alter dieser Würmer nimmt jedoch die Darmbarrierefunktion ab und wird empfindlicher gegenüber Störungen aufgrund des fortschreitenden Abbaus von Zellen und Mikrovilli und der Ansammlung von Bakterien im alternden Darm^21,22. Wenn junge C. elegans den Farbstoff Erioglaucin-Dinatriumsalz aufnehmen, wird der Darm des Fadenwurms gefärbt (Abbildung 4A). Auf der anderen Seite ist es möglich zu beobachten, dass gealterte Würmer eine Extravasation des Farbstoffs aufwiesen, die den gesamten Körper des Wurms durchdrang, was auf eine Schädigung der Darmmembran hinweist (Abbildung 4B).

Abbildung 4: Repräsentatives Bild von C. elegans bei der Färbung mit Erioglaucin-Dinatriumsalz. Das mikroskopische Bild zeigt C. elegans mit intaktem Darm (Stadium L4) und Würmer mit geplatztem Darm (7^. Tag des Erwachsenenalters). Die Würmer wurden durch Eintauchen in eine 25%ige Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung für 3 h nach Schritt 2.2.4 gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: ImageJ-Screenshot zur Auswahl der C . elegans-Kontur . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: ImageJ-Screenshot zur Berechnung des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Medien-, Puffer- und Kulturrezepturen. Zusammensetzung verschiedener Medien, Puffer und Kulturen, die im aktuellen Protokoll verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Detaillierte Beschreibung der ImageJ Software zur Quantifizierung des Glykogengehalts in Würmern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine qualitative Bewertung des Glykogengehalts in einzelnen C. elegans-Würmern mittels Lugol-Färbung ermöglicht: ein unkomplizierter, robuster und schneller Assay. Die Lugol-Färbung ist ein markierungsfreier und nicht-invasiver Ansatz, der die Erfassung molekularer Daten mit subzellulärer Auflösung erleichtert und die Überwachung von Schwankungen des Glykogengehalts innerhalb einzelner Würmer ermöglicht¹⁰. Darüber hinaus bietet der Assay aufgrund seines minimalen Gerätebedarfs den Vorteil der Wirtschaftlichkeit. Für die Aufnahme der Bilder ist lediglich ein Mikroskop oder Stereomikroskop erforderlich, die problemlos mit einer Handykamera aufgenommen werden können, solange für alle Bilder die gleichen Licht-/Helligkeits-/Belichtungseinstellungen gelten. Darüber hinaus können bestimmte Verfahrensanpassungen die Wirksamkeit dieses Protokolls verbessern. Komplexere Laborgeräte, wie z. B. eine Strömungshaube und eine Zentrifuge, können durch Alkohollampen und Schwerkraftsedimentation ersetzt werden. Diese Alternativen machen die Methode noch budgetfreundlicher und für ein breites Spektrum von Forschern zugänglich. Neben Forschern können auch Pädagogen diesen Assay zu Bildungszwecken in Schulen einsetzen, um Veränderungen im Zusammenhang mit der Glykogenspeicherung und ihrer Biosynthese zu veranschaulichen.

Obwohl herkömmliche enzymatische Assays den Glykogenspiegel quantifizieren können, erweist sich die Lugol-Färbung als vielversprechende Methode zur Bestimmung der Glykogenspeicher in C. elegans. In unserer Studie zeigten die Daten deutliche Unterschiede in der Färbung zwischen den drei Bedingungen, was auf eine mögliche Korrelation zwischen den Fressbedingungen und der Intensität der Färbung hindeutet. Mit anderen Worten, es zeigt Schwankungen des Glykogengehalts zwischen den verschiedenen Fütterungsgruppen an, da die Färbeintensität direkt proportional zum Glykogengehalt ist. Mit diesen ersten Beobachtungen und Nachweisen können die Schülerinnen und Schüler untersuchen und untersuchen, ob verschiedene Faktoren, wie z.B. unterschiedliche Lebensmittel, Getränke oder chemische Reagenzien, auch den Glykogengehalt in den Nematoden beeinflussen können.

Ein Nachteil dieses Ansatzes ergibt sich aus seiner Abhängigkeit von manuellen Verfahren und subjektiver Interpretation. Die subjektive Natur der Färbebeurteilung, bei der die Noten auf der Grundlage der visuellen Beobachtung vergeben werden, kann zu Variabilität zwischen verschiedenen Analytikern führen, was möglicherweise zu Schwankungen bei der Interpretation der Ergebnisse führt.

Dieser Bericht zeigt auch die Bewertung der intestinalen Integrität von C. elegans mit dem Farbstoff Erioglaucin-Dinatriumsalz. Es ist möglich, den Verlust der Darmbarrierefunktion bei C. elegans zu beurteilen, indem die Würmer mit einem blauen Farbstoff gefüttert werden, der nicht über die Kutikula resorbierbar ist. Dieser Test ermöglicht es, das Austreten von Farbstoff aus dem Darm zu überprüfen, ein Test, der als Schlumpftest bekannt ist, da die Tiere blau werden wie die Zeichentrickfilme^{Schlümpfe 23}. Diese Methode wurde zuvor auf Drosophila melanogaster und Danio rerio angewendet, wobei eine ähnliche Methode zur intestinalen Bewertung verwendet wurde^24,25. Bei C. elegans haben wir das gleiche Prinzip der Technik mit dem Erioglaucin-Dinatriumsalz verwendet, das als einfache und reproduzierbare Technik zur Überprüfung der Darmintegrität von C. elegans angesehen wird ^19,26.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Induktion oder Verzögerung des Alterns von Nematoden zu bewerten und auch das toxische Potenzial von Substanzen im Darm von C. elegans auf einfache und schnelle Weise zu überprüfen, ohne dass komplexe Geräte verwendet werden müssen, was die Methode wirtschaftlich rentabel macht^19,27. Zusätzlich zu seiner Verwendung in der wissenschaftlichen Forschung können Lehrer diesen Assay auch zu Bildungszwecken in Bildungseinrichtungen einsetzen, um Veränderungen der Darmpermeabilität von C. elegans zu untersuchen. Mit einem einfachen Test ist es möglich, Hypothesen über das Altern und die Wirkung chemischer Reagenzien auf die Darmbarriere von Nematoden zu untersuchen.

Der Assay kann entsprechend dem Zweck der Studie angepasst werden, um andere C. elegans-Stämme und Larvenstadien zu verwenden, solange die Ersatzstoffe die gleiche oder eine ähnliche Funktion erfüllen, um die Reproduzierbarkeit der Methode aufrechtzuerhalten. Für eine erfolgreiche Analyse ist es wichtig, dass die gealterten Würmer 3 h lang gefärbt werden, wie im Protokoll erwähnt. Anschließend sind die Waschungen zur Entfernung von überschüssigem Farbstoff ein kritischer Schritt in der Methode und müssen sorgfältig durchgeführt werden, damit die Würmer nicht zusammen mit dem Überstand entfernt werden. Bei der Bewertung von Substanzen besteht eine der Einschränkungen des Protokolls darin, dass es schwierig ist, eine leicht zugängliche Positivkontrolle zu finden, die die Darmmembran von Nematoden lysiert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikroröhrchen	Lokale
	KS 4000i	97014-816
50 mL konisches Röhrchen	Lokale	Lieferanten-6
cm Petriplatten	Lokale	Lieferanten-Agar
bakteriologisch	Dinâ Glimmer Quí Glimmer Contemporâ nea Ltda.	9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (Wildtyp)	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
CaCL2	Dinâ Glimmer Quí Glimmer Contemporâ nea Ltda.	10035-04-8
Cholesterin	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	57-88-5
D-(+)-Glukose wasserfrei	Neon	50-99-7
Destilliertes H2O	Lokale
Dinatriumsalz	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	3844-45-9
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
Durchflusshaube	Mylabor
Inkubator	Panasonic Healthcare Company of North America, MIR-254-PA.	-
KH2PO4	Dinâ Glimmer Quí Glimmer Contemporâ nea Ltda.	7778-77-0
Levamisolhydrochlorid	RIPERCOL L 150F-Lugol
Lösung	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	L6146
MgSO4	Synth	S1063-01-AH
Mikrozentrifuge	Zentrifuge 5425R Eppendorf SE, Deutschland
Na2HPO4	Dinâ Glimmer Quí Glimmer Contemporâ nea Ltda.	7558-79-4
NaCl	Dinâ Glimmer Quí Glimmer Contemporâ nea Ltda.	7647-14-5
Nystatin	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	N6261
Pepton bakteriologisch	ê xodo cientí fica	91079-38-8
Stereomikroskop	Leica S8 Apo Stereomikroskop (Sã o Paulo, Brasilien)
Streptomycin Sulfat	Estreptomax	-