Summary
Denne protokol beskriver en rekonfigurerbar membranbaseret cellekulturplatform, der integrerer open well-formatet med væskestrømningsfunktioner. Denne platform er kompatibel med standardprotokoller og giver mulighed for reversible overgange mellem åbne brønde og mikrofluidiske kulturtilstande, der imødekommer behovene hos både ingeniør- og biovidenskabslaboratorier.
Abstract
Mikrofysiologiske systemer er miniaturiserede cellekulturplatforme, der bruges til at efterligne strukturen og funktionen af humane væv i en laboratorieindstilling. Disse platforme har imidlertid ikke vundet udbredt anvendelse i biovidenskabelige laboratorier, hvor åbne membranbaserede tilgange tjener som guldstandarden til efterligning af vævsbarrierer, på trods af manglende væskestrømningsfunktioner. Dette problem kan primært tilskrives inkompatibiliteten af eksisterende mikrofysiologiske systemer med standardprotokoller og værktøjer udviklet til åbne brøndsystemer.
Her præsenterer vi en protokol til oprettelse af en rekonfigurerbar membranbaseret platform med en åben brøndstruktur, flowforbedringskapacitet og kompatibilitet med konventionelle protokoller. Dette system anvender en magnetisk samlingsmetode, der muliggør reversibel skift mellem åben brønd og mikrofluidisk tilstand. Med denne fremgangsmåde har brugerne fleksibiliteten til at starte et eksperiment i åbent brønd-format ved hjælp af standardprotokoller og tilføje eller fjerne flowfunktioner efter behov. For at demonstrere den praktiske anvendelse af dette system og dets kompatibilitet med standardteknikker blev der etableret et endotelcellemonolag i et åbent brøndformat. Systemet blev omkonfigureret til at indføre væskestrøm og skiftede derefter til åbent brøndformat for at udføre immunfarvning og RNA-ekstraktion. På grund af dets kompatibilitet med konventionelle åbne brøndprotokoller og flowforbedringskapacitet forventes dette rekonfigurerbare design at blive vedtaget af både ingeniør- og biovidenskabslaboratorier.
Introduction
Vaskulære barrierer tjener som en kritisk grænseflade, der adskiller blodrummet fra det omgivende væv. De spiller en afgørende rolle i bevarelsen af homeostase ved at tiltrække immunceller, kontrollere molekylær permeabilitet og beskytte mod indtrængen af patogener i vævet 1,2. In vitro-kulturmodeller er blevet udviklet til at efterligne in vivo-mikromiljøet, hvilket muliggør systematiske undersøgelser af de faktorer og tilstande, der påvirker barriereegenskaber i både raske og syge tilstande 3,4.
Den mest anvendte tilgang til sådanne kulturmodeller er den Transwell-lignende "open-well" konfiguration5, hvor en porøs, sporætset kulturmembran adskiller mediefyldte rum (figur 1A). I dette format kan celler podes på begge sider af membranen, og der er udviklet en bred vifte af eksperimentelle protokoller. Imidlertid er disse systemer begrænsede i deres evne til at tilvejebringe de væskestrømme, der er afgørende for at understøtte barrieremodning og efterligne immuncellecirkulation set in vivo 5,6. Derfor kan de ikke bruges til undersøgelser, der kræver dynamiske strømme, der introducerer lægemiddeldoser, mekanisk stimulering eller væskeinducerede forskydningsspændinger 6,7,8.
For at overvinde begrænsningerne ved åbne brøndsystemer er der udviklet mikrofluidiske platforme, der kombinerer porøse kulturmembraner med individuelt adresserbare fluidiske kanaler9. Disse platforme tilbyder præcis kontrol over væskerouting, perfusion og introduktion af kemiske forbindelser, kontrolleret forskydningsstimulering og dynamiske celletilsætningsfunktioner 7,10,11,12,13. På trods af de avancerede muligheder, der leveres af mikrofluidiske platforme, har de ikke set udbredt vedtagelse i biovidenskabelige laboratorier på grund af komplekse mikrofluidiske protokoller og deres inkompatibilitet med etablerede eksperimentelle arbejdsgange 4,10,14.
For at bygge bro mellem disse teknologier præsenterer vi en protokol, der anvender et magnetisk rekonfigurerbart, modulbaseret system. Dette system kan let skiftes mellem åben brønd og mikrofluidisk tilstand baseret på eksperimentets specifikke behov. Platformen har en åben brøndenhed, kendt som m-μSiM (modulært mikrofysiologisk system aktiveret af en siliciummembran), med en 100 nm tyk kulturmembran (nanomembran). Denne nanomembran har høj porøsitet (15%) og glaslignende gennemsigtighed, som illustreret i figur 1B. Det adskiller fysisk det øverste rum fra en bundkanal, hvilket muliggør molekylær transport over fysiologiske længdeskalaer15. I modsætning til konventionelle sporætsede membraner, som har kendte udfordringer ved billeddannelse af levende celler med lysfeltbilleddannelse, muliggør nanomembranens gunstige optiske og fysiske egenskaber klar visualisering af celler på begge sider af membranoverfladen 15,16,17.
Denne protokol skitserer fremstillingen af specialiserede sånings- og flowmoduler og forklarer platformens magnetiske omkonfiguration. Det demonstrerer, hvordan platformen kan anvendes til at etablere endotelbarrierer under både statiske og dynamiske forhold. Denne demonstration afslører, at endotelceller justeres langs strømningsretningen med en opregulering af forskydningsfølsomme genmål under forskydningsstimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette design kan bruges i forskellige tilstande baseret på eksperimentelle krav og slutbrugerens præferencer. Før hvert eksperiment konsulteres beslutningsflowdiagrammet, der præsenteres i figur 2 , for at bestemme de nødvendige trin og moduler til protokollen. Hvis brugeren f.eks. har til hensigt at bevare open well-formatet under et eksperiment for direkte at sammenligne det med Transwell-systemet, er mønsterstencilen ikke nødvendig til cellesåning. Kernemodulet er kommercielt tilgængeligt (se materialetabel), og den ultratynde nanomembran kan vælges fra et bibliotek af materialer med forskellig porøsitet og porestørrelser, der passer til eksperimentelle behov.
1. Fremstilling af mønsterstencilen
BEMÆRK: Mønsterstencilen tjener til udelukkende at placere celler på det porøse område af membranchippen, hvilket forhindrer celler i at sætte sig på det omgivende siliciumlag, hvor de potentielt kan opleve skader, efter at flowmodulet er tilføjet16 (se figur 3). Skader på monolaget kan påvirke barriereintegriteten negativt og kompromittere eksperimentelle resultater. Stencilen er unødvendig i en åben, statisk kultur, da der ikke er nogen risiko for skade.
- Køb, maskine eller 3D-print en form ved hjælp af designet i supplerende kodningsfil 1 (figur 4A).
BEMÆRK: Stencilvæggene er koniske for at øge mediekapaciteten og minimere boblediffusering sammenlignet med lige vægfunktioner med højt billedformat. - Fastgør en 130 μm trykfølsom klæbende film (PSA) til en 3,2 mm akrylplade ved hjælp af en koldrulle (se materialetabellen).
- Laserskær akrylpladen i overensstemmelse med designet i supplerende kodningsfil 2 for at skabe en række hulrum (figur 4B).
- Fjern det beskyttende lag fra PSA-filmen, og fastgør akrylpladen til formen.
BEMÆRK: Sørg for, at det laserskårne ark er justeret med formen, så formfunktionerne er centreret i hulrummet (figur 4C). Nøjagtigheden af cellepositionering på membranen afhænger af dette trin. - Bland PDMS-præpolymeren grundigt (ved hjælp af et 10: 1 base til katalysatorforhold) (se materialetabel) og afgas det i et vakuumkammer, indtil der ikke er synlige bobler tilbage (5-15 min).
- Hæld langsomt PDMS i formhulrummene, udjævn det med en flad kant.
BEMÆRK: For at forhindre bobleindfangning hældes PDMS langsomt i hvert hulrum. Hvis der er bobler til stede efter hældning, skal du placere formen i vakuumkammeret og afgasse den igen. - Hærd PDMS på en kogeplade ved 70 °C i 1 time, og lad det derefter afkøle til stuetemperatur.
- Uddrag stencilerne fra formhulrummene ved hjælp af en pincet med flad spids.
2. Fremstilling af flowmodulet
BEMÆRK: Flowmodulet deler et lignende fodaftryk med kernemodulets kløverformede brønd og inkluderer en støbt mikrokanal (bredde = 1,5 mm, højde = 0,2 mm, længde = 5 mm). Kløverformen hjælper med at justere kanalen over det porøse kulturområde (figur 5).
- Brug standard bløde litografiteknikker18 til at skabe en siliciumform med funktioner defineret af designet i supplerende kodningsfil 3 (figur 4D).
- Fastgør en 130 μm PSA-film til en 3,2 mm tyk akrylplade.
- Laserskær akrylpladen baseret på designet i supplerende kodningsfil 4 for at skabe en række kløverformede hulrum (figur 4E).
BEMÆRK: Hulrummets højde bestemmer flowmodulets højde, som skal være lidt højere (med 0-0,1 mm) end højden på kernemodulbrønden for at sikre korrekt tætning. - Fjern det beskyttende lag fra PSA-filmen, og fastgør derefter det laserskårne ark til siliciumformen ved at justere de trekantede justeringsmærker på siliciumformen med dem på det laserskårne ark.
BEMÆRK: I lighed med trin 1.4 skal du sikre dig, at den laserskårne akrylplade er justeret med siliciumformen, så formfunktionerne er centreret i hvert hulrum (figur 4F). Dette trin bestemmer mikrokanalens position i forhold til fodaftrykket. - Hæld langsomt det afgassede PDMS på formhulrummene og jævn det med en flad kant.
BEMÆRK: Hvis der er bobler til stede efter hældning, afgases formen, indtil boblerne er fjernet. - Læg formen på en kogeplade og bag PDMS ved 70 °C i 1 time, og lad derefter formen afkøle til stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt flowmodulerne fra formhulrummene ved hjælp af en pincet med flad spids.
- Orienter flowmodulet med mikrokanalfunktionerne opad, og placer kerneindløbs- og udløbsportene for enden af kanalen ved hjælp af en biopsistans (se materialetabel).
3. Fremstilling af nedre og øvre akrylhuse
BEMÆRK: Kernemodulet passer ind i det nederste hus. Tiltrækningen mellem indlejrede magneter i husene komprimerer og forsegler flowmodulet til kernemodulet (figur 6).
- Laserskær en 2 mm akrylplade ved hjælp af designet i supplerende kodningsfil 5 for at skabe det øverste hus med huller til magnetindsættelse.
- Fastgør en 130 μm PSA-film til en 3,5 mm akrylplade.
- Laserskær akrylpladen baseret på designet i supplerende kodningsfil 6 for at skabe det nederste hus med huller til magnetindsættelse.
BEMÆRK: Tykkelsen af det nederste hus er en kritisk parameter og skal matche kernemodulets samlede tykkelse for at forhindre lækage under flow. - Fjern PSA-beskyttelseslaget, og fastgør det nederste hus til et glasdæksel.
- Press-fit 4,75 mm forniklede neodymmagneter (se materialetabel) ind i de laserskårne huller i husene.
BEMÆRK: Sørg for, at magneter i de nederste og øverste huse er placeret med modsat polaritet for at sikre magnetisk tiltrækning (figur 6).
4. Fremstilling af strømningskredsløbet
BEMÆRK: Det lukkede kredsløb indeholder to prøveopsamlingshætteglas som reservoirer (figur 7). Indløbsbeholderen har et polyvinylidendifluorid (PVDF) filter, der tillader cellemediet at ekvilibrere med CO2 -koncentrationen i inkubatoren.
- Brug en 1 mm biopsistans til at skabe to huller i hætten på et prøveopsamlingshætteglas.
- Brug biopsistansere til at skabe to huller (1 mm og 4 mm) i hætten på et separat hætteglas, og skab et hul på 1 mm i den nederste del af hætteglasset.
- Indsæt 20 G doseringsspidser i hvert af hullerne på 1 mm, og forsegl dem med varm lim.
- Anbring et 0,22 μm PVDF-filter (se materialetabellen) i 4 mm hullet og forsegl det med varm lim.
- Laserskær en 1,5 mm akrylplade ved hjælp af designet i supplerende kodningsfil 7 for at skabe en prøveholdefase.
- Placer reservoirerne på akryltrinnet.
- Tilslut doseringsspidserne ved hjælp af mikroflowrør (se materialetabel).
- Forbind rørene til flowmodulets indløb og udløb ved hjælp af 21 G doseringsspidser.
- Brug en peristaltisk pumpe (se materialetabellen) til flowcirkulation.
BEMÆRK: Sprøjte- eller pneumatiske pumper kan også bruges til at indføre flow, hvis det ønskes. Strømningshastigheden skal bestemmes ud fra eksperimentelle behov. En omfattende tabel, der er afledt af en eksperimentelt valideret COMSOL-model, findes i supplerende tabel 1 for at hjælpe brugerne med at vælge den nødvendige strømningshastighed for at opnå den ønskede forskydningsspænding ved cellemonolag16.
5. Cellesåning
BEMÆRK: I lighed med konventionelle membranindsatser kan forskellige celletyper dyrkes på nanomembranen. En sekundær celletype kan også samdyrkes på den anden side af membranen i bundkanal15.
- Overtræk membranen med 5 μg / cm2 fibronectin (se materialetabel) ved stuetemperatur i 1 time for at forbedre cellefastgørelsen.
BEMÆRK: Den valgte celletype kan påvirke den krævede belægning og celletæthed. Den her beskrevne procedure er for humane navlestrengendototelceller (HUVEC'er, se materialetabel). - Opsug belægningsopløsningen ved hjælp af en P200-pipette, og anbring en mønsterstencil i kernemodulbrønden.
- Føj cellemedier til enhedens brønd og bundkanal.
- Frø HUVEC'er med en densitet på 40.000 celler /cm2 i brønden.
BEMÆRK: HUVEC'er ved denne densitet danner typisk et sammenflydende monolag efter 24 timers inkubation16,19. - Anbring enheden i en petriskål. Tilsæt en 15 ml konisk rørhætte med DI-vand til petriskålen for at opretholde lokal fugtighed.
- Overfør petriskålen til inkubatoren.
BEMÆRK: Cellemedier i enhedens øverste brønd og nederste kanal skal udskiftes hver 24. time. Hvis du vil ændre mediet i den nederste kanal, skal du forsigtigt indsætte friske medier i en af portene for at fortrænge det gamle medie fra den anden port.
6. Omkonfiguration til mikrofluidisk tilstand
- Steriliser det øverste hus, nedre hus, flowmodul, reservoirer, rør og dispenseringsspidser ved at placere dem i et UV-steriliseringskammer i 30 minutter før montering. Cirkulere 70% ethanol og derefter steril PBS i flowkredsløbet.
- Fyld reservoirerne og rørene med endotelcellevækstmedier (se materialetabel).
- Placer det nederste hus på prøvetrinnet. Indsæt kernemodulet med åben brønd i det nederste hus.
- Opsug cellemedier fra modulets brønd. Placer flowmodulet i brønden.
- Placer det øverste hus for at forsegle flowmodulet i kernemodulbrønden. Tilslut indløbs- og udløbsspidserne til flowmodulets porte.
- Start den peristaltiske pumpe for at indføre væskestrøm i systemet.
7. Gennemførelse af downstream-analyse i åbent brøndformat efter flowintroduktion
BEMÆRK: Kulturtiden her afhænger af de eksperimentelle mål. Brugere kan udføre downstream-analyse (f.eks. Immunocytokemi, RNA-ekstraktion) enten i åbne brønd- eller mikrofluidiske formater baseret på deres præference. For eksempel, hvis et åbent brøndformat foretrækkes, skal systemet omkonfigureres til at udføre assays baseret på standardprotokoller16,19.
- Stop pumpen, når den ønskede tid for eksponering for forskydningsflow er nået. Fjern indløbs- og udløbsspidserne.
- Fjern det øverste hus. Fjern forsigtigt flowmodulet fra brønden ved hjælp af pincet.
- Tilsæt 100 μL cellemedier til brønden. Udfør ønskede analyser baseret på standardprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kernemodulet med åben brønd er oprindeligt placeret i et specifikt hulrum skabt af et lavere hus og en dæksel, som illustreret i figur 6A. Derefter indsættes flowmodulet, som indeholder en mikrokanal og adgangsporte, i brønden i kernemodulet. Flowmodulet er sikkert forseglet mod membranens siliciumstøttelag på grund af den magnetiske tiltrækningskraft mellem magneter, der er indlejret i de nedre og øvre huse, som vist i figur 6B. For at evaluere effektiviteten af denne magnetiske låsemekanisme blev der udført en sprængtryktest, der viste, at systemet kan modstå blindgydetryk på op til 38,8 ± 2,4 kPa. Denne tryktolerance overstiger væsentligt de typiske driftstryk, der opstår i cellekulturapplikationer. Desuden forbliver systemet fri for lækager, når det udsættes for strømningshastigheder på op til 4000 μL/min, hvilket svarer til en forskydningsspænding på 74 dyn/cm2 ved dyrkningsområdet16.
Når der udvikles en platform, der kan skifte mellem åben brønd og mikrofluidisk tilstand, skal der tages nøje hensyn til cellesåningsmetoden, hvilket typisk ikke er et problem for konventionelle statiske åbne brøndplatforme16. Skader på monolaget omkring kanalgrænsen kan medføre komplikationer i eksperimentelle resultater20. For at løse dette problem blev der designet en aftagelig stencil, der passer ind i kernemodulets åbne brønd og giver et specifikt vindue for celler til fortrinsvis at sætte sig på membranoverfladen (figur 3). Når cellemonolaget er mønstret og når sammenløb, har brugeren fleksibiliteten til at fortsætte eksperimentet i åbent brøndformat eller omkonfigurere platformen til mikrofluidisk tilstand for at udsætte cellemonolaget for fysiologisk forskydningsstress (figur 3). Den magnetiske låsemekanisme giver mulighed for nemt at skifte mellem åbne brønd- og mikrofluidiske formater efter behov. For eksempel kan enheden vendes tilbage til åbent brøndformat efter en flowstimulering, hvilket giver brugerne fleksibilitet til at udføre en række forskellige assays (såsom immunfarvning, RNA-ekstraktion og molekylære permeabilitetsmålinger) ved hjælp af standard eksperimentelle protokoller15,16.
I den fysiologiske indstilling af menneskekroppen udsættes den vaskulære barriere for strømningsinduceret forskydningsstress, som tjener som et vigtigt biofysisk signal, der påvirker strukturen og funktionen af barrieren 5,21,22. Således er tilsætningen af væskestrøm i mikrofysiologiske systemer et centralt krav. For at demonstrere platformens alsidighed blev der etableret et HUVEC-monolag i et åbent brøndformat ved hjælp af standardprotokoller. Efter 24 timers statisk kultur blev platformen omkonfigureret til mikrofluidisk tilstand for at udsætte cellemonolaget for 10,7 dyn / cm2 forskydningsspænding i 24 timer. Resultaterne viste, at celler dyrket under flow justeret langs strømningsretningen, mens celler dyrket uden flow forblev tilfældigt orienteret (figur 8A, B). Efter forskydningsstimulering blev platformen omkonfigureret til open-well-formatet for at ekstrahere RNA ved hjælp af standardprotokoller. Resultaterne viste, at cellernes eksponering for forskydningsstress resulterede i opregulering af Kruppel-lignende faktor 2 (KLF2) og endotelnitrogenoxidsyntase (eNOS), som tjener kritiske roller såsom antitrombotiske og aterosbeskyttende funktioner i sunde blodkar23,24 (figur 8C).
Figur 1: Sammenligning af in vitro vaskulære barrieremodeller. Skematisk illustration af (A) konventionelle Transwell-lignende skær og (B) den åbne brønd m-μSiM. Bright-field billeder af et sammenflydende HUVEC monolag fremhæver forskellen i bright-field billedkvalitet mellem en sporætset membran og en ultratynd nanomembran. Skalastænger = 100 μm. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Rutediagram over beslutningstagning. Et rutediagram baseret på eksperimentelle behov og downstream-analysepræferencer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Platformens eksperimentelle arbejdsgang. (A) For direkte at placere celler på den porøse membran indsættes en aftagelig mønsterstencil i brønden i kernemodulet (indsatsen viser mønstrede celler, gule linjer udviser mikrokanalgrænser). (B) Stencilen kan opbevares eller fjernes i anordningen til statisk cellekultur. (C) For at omkonfigurere platformen til mikrofluidisk tilstand erstattes stencilen med flowmodulet. På grund af den magnetiske tætningsmekanisme er konfigurationen reversibel; Huse og flowmodulet kan fjernes for at skifte til åben brøndtilstand. Skalabjælke = 200 μm. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk illustration af formene. (A) Stencilformen. (B) Laserskåret akrylplade. (C) samlet billede af stencilformen. (D) Flow modul form. (E) Laserskåret akrylplade. (F) Samlet visning af flowmodulets form. Trekantformede træk er justeringsmærker for at lette fastgørelse af akrylplader til formene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skematisk oversigt over flowmodulet med kløverform. (A) Kontaktgrænsefladen mellem flowmodulet og membranchippen. Indløbs- og udløbsportene til væskestrøm er vist med lyserødt. B) 3D-billede af PDMS-flowmodulet. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Magnetisk enhed til rekonfiguration af enheden. (A) Skematisk demonstration af komponenter til rekonfiguration af enheden til mikrofluidisk tilstand. Indlejrede magneter med modsatte poler fremkalder tiltrækning til tætningen. B) Tværsnitsbillede af det omkonfigurerede udstyr, der viser vaskulærkanalen i lyserødt og vævsrummet i grønt. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Samlet visning af flowkredsløbet. Kredsløbet består af en peristaltisk pumpe, to reservoirer til tilførsel af cellemedier og dæmpning af udsving, slanger og et akryltrin til at holde komponenterne på plads. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sammenligning af HUVEC'er dyrket i åben brønd og mikrofluidisk tilstand. Celler blev podet og dyrket i åben brønd i 24 timer for at etablere et sammenflydende monolag. I løbet af den efterfølgende 24 timers periode blev et sæt enheder omkonfigureret til mikrofluidisk tilstand. (A) Celler dyrket under flow (10,7 dynes.cm-2 forskydningsspænding) justeret langs strømningsretningen (indsatsen viser actin og kerner af celler i henholdsvis grøn og blå). (B) Celler dyrket uden flow i åbent brøndformat viste ingen justering. Længden af stænger i radarplots viser antallet af celler i den tilsvarende retning. (C) Celler dyrket under flow viste højere opregulering af KLF2- og eNOS-gener sammenlignet med no-flow-tilstanden (**p < 0,01, n = 3, gennemsnit ± SD). Skalastænger = 100 μm. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Forskydningsspænding på nanomembranoverfladen ved forskellige strømningshastigheder. Denne tabel indeholder oplysninger om forskydningsspændingsværdier på nanomembranoverfladen ved forskellige strømningshastigheder. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: CAD-model af stencilformen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 2: CAD-model af laserskårne hulrum til stencilformen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 3: CAD-model af flowmodulet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 4: CAD-model af laserskårne hulrum til flowmodulformen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 5: CAD-model af det øverste hus. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 6: CAD-model af det nederste hus. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 7: CAD-model af akrylstadiet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne protokol er at udvikle en praktisk metode til at inkorporere flowfunktioner i en åben brøndplatform med en ultratynd nanomembran. I dette design anvendes en magnetisk låsemetode, der gør det muligt at skifte mellem åben brønd og fluidisk tilstand under eksperimenter og kombinere fordelene ved begge tilgange. I modsætning til konventionelle permanent bundne platforme gør magnetisk låsning det muligt at adskille platformen på bekvemme punkter under den eksperimentelle arbejdsgang 16,25,26,27. I denne platform podes celler, og barrieren etableres i det velkendte åbne brøndformat, og derefter omkonfigureres systemet til en fluidisk tilstand ved blot at tilføje et flowmodul og magnetisk forsegle det. Denne rekonfiguration giver to vigtige fordele: For det første muliggør den simulering af fysiologiske tilstande ved at udsætte cellemonolaget for væskeinduceret forskydningsstress; For det andet letter det indførelsen af sekundære komponenter som immunceller under strømningsbetingelser16. Den magnetiske låsefunktion tilbyder en værktøjsfri monteringsmetode, der muliggør on-demand-skift mellem åbne brønd- og mikrofluidiske formater. Derfor kan downstream-analyser, såsom immuncytokemi og RNA-ekstraktion, udføres i det velkendte åbne brøndformat ved hjælp af standardteknikker eller ved hjælp af mikrofluidiske teknikker som ønsket16.
Magnetisk forsegling er en kritisk parameter for designet, der muliggør rekonfigurerbarhed af platformen, og der kræves derfor flere overvejelser for dens nøjagtige funktion: (1) Højden på det nederste hus skal svare til højden på kernemodulet (tolerance: ±0,1 mm) for at omslutte modulet korrekt. (2) Flowmodulets højde skal være lidt højere end brønden i kernemodulet (0-0,1 mm). (3) Dette design kan tilpasses en lang række materialer og kræver ikke, at flowmodulet er konstrueret af elastomere materialer. Det afgørende element er at inkorporere et blødt, pakningslignende materiale ved grænsefladen mellem flowmodulet og membranchippen for at etablere en pålidelig tætning. (4) Diameteren af de laserskårne hulrum i husene til trykmonterede magneter skal optimeres på grundlag af det anvendte instrument28. Magneter kan løsne sig og føre til flowlækage, hvis hulrumsdiameteren er for stor, eller huse kan revne under magnetindsættelse, hvis hulrum er for små. Ved at følge ovennævnte overvejelser kan den magnetiske samlingsmetode, der introduceres her, anvendes til at omkonfigurere andre åbne brøndsystemer til mikrofluidisk tilstand.
For at have omkonfigurationsevnen er det nødvendigt at bruge en mønsterstencil, der muliggør præcis positionering af celler på membranoverfladen. Stencilen sikrer, at ingen celler er uden for det porøse kulturområde (dvs. på siliciumstøtteområdet), som kan blive beskadiget ved indsættelse af flowmodulet. Dette aspekt bliver særligt afgørende i samkulturmodeller, fordi celler, der utilsigtet er podet på utilsigtede steder, ikke aktivt kan deltage i udviklingen af barrierevævet. Ikke desto mindre hentes disse fejlplacerede celler normalt under lysisprocessen og kan potentielt introducere bias i genekspressionsundersøgelser, der undersøger interaktioner mellem celler på tværs af membranen20. Cellesåning med åben brønd ved hjælp af stencilen forbedrer såeffektiviteten ved at afbøde celletab langs strømningsvejen, som er iboende i konventionelle mikrofluidiske platforme 4,16. Denne platform er også i stand til at inkorporere flere celletyper og ECM-materialer 15,16,17. For eksempel kan en cellebelastet hydrogel injiceres i enhedens nedre kanal for at efterligne vævsrummet, mens et endotel etableres oven på membranen.
Selvom de magnetiske moduler og komponenter kan genbruges, kan opretholdelse af effektiv tætning over flere anvendelser være et problem på grund af magneterne, der løsner sig i huset og reducerer tætningskraften. Dette problem kan afhjælpes ved at lave nye laminerede moduler til hvert eksperiment eller masseproducerende komponenter ved hjælp af sprøjtestøbning eller 3D-printteknikker, når design er etableret. I metoden beskrevet i denne protokol placeres flowmodulet manuelt i kernemodulet, og systemets multiplexerings- og automatiseringskapacitet er begrænset. For at forbedre eksperimentelt gennemløb kan flowmodulet og det øverste hus integreres i et funktionelt modul, der indeholder interne routingkanaler og standardiserede slangeforbindelser, der samtidig perfuserer flere moduler parallelt.
Komponenterne i kernemodulet med åben brønd er masseproducerede og kommercielt tilgængelige. Andre komponenter i systemet, såsom flowmodulet, huse og mønsterstencil, kan også fremstilles i stor skala. Desuden tillader platformens rekonfigurerbarhed tilføjelse af sensorer og aktuatorer (f.eks. Transendotel-elektrisk modstandsmodul, elektroporationsmodul) til stimulering og målinger i realtid. Samlet set kombinerer denne platform konventionelle og mikrofluidiske tilgange for at hjælpe med at understøtte udbredt brug uden for tekniske laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. er medstifter af SiMPore, Inc. og har en aktieandel i virksomheden. SiMPore kommercialiserer de ultratynde siliciumbaserede teknologier, herunder membranerne, der anvendes i denne undersøgelse.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist finansieret af National Institute of Health under tildelingsnumre R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 og NSF-tilskud CBET 2150798. Forfatterne takker RIT Machine Shop for fremstilling af aluminiumsform. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
