Etablierung und Charakterisierung von patienteneigenen Magenorganoiden aus Biopsien des gutartigen Magenkörpers und des Antralepithels

Zusammenfassung

Aus Magenpatienten stammende Organoide finden zunehmend Verwendung in der Forschung, jedoch fehlen formale Protokolle zur Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellverdauen mit standardisierter Aussaatdichte. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Herstellung von Magenorganoiden aus Biopsiegewebe dar, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde.

Zusammenfassung

Magenpatienten-abgeleitete Organoide (PDOs) bieten ein einzigartiges Werkzeug für die Untersuchung der Magenbiologie und -pathologie. Folglich finden diese g.U. zunehmend Verwendung in einer Vielzahl von Forschungsanwendungen. Es gibt jedoch einen Mangel an veröffentlichten Ansätzen zur Herstellung von Magen-PDOs aus Einzelzellverdauen unter Beibehaltung einer standardisierten anfänglichen Zellaussaatdichte. In diesem Protokoll liegt der Schwerpunkt auf der Initiierung von Magenorganoiden aus isolierten Einzelzellen und der Bereitstellung einer Methode zur Passage von Organoiden durch Fragmentierung. Wichtig ist, dass das Protokoll zeigt, dass ein standardisierter Ansatz für die anfängliche Zellaussaatdichte konsistent Magenorganoide aus gutartigem Biopsiegewebe liefert und eine standardisierte Quantifizierung des Organoidwachstums ermöglicht. Schließlich gibt es Hinweise auf die neue Beobachtung, dass Magen-PDOs unterschiedliche Bildungs- und Wachstumsraten aufweisen, je nachdem, ob die Organoide aus Biopsien des Körpers oder aus Antralregionen des Magens stammen. Insbesondere wird gezeigt, dass die Verwendung von Antralbiopsiegewebe für die Organoidinitiierung zu einer größeren Anzahl von Organoiden und einem schnelleren Wachstum von Organoiden über einen Zeitraum von 20 Tagen im Vergleich zu Organoiden führt, die aus Biopsien des Magenkörpers erzeugt werden. Das hierin beschriebene Protokoll bietet Forschern eine zeitnahe und reproduzierbare Methode zur erfolgreichen Erzeugung und Arbeit mit Magen-PDOs.

Einleitung

Organoide sind dreidimensionale (3D) zelluläre Miniaturstrukturen, die der Architektur und Funktionalität der Organe ähneln, von denen sie abgeleitet wurden ^1,2. Diese im Labor gezüchteten Modelle werden durch die Kultivierung von Stammzellen oder gewebespezifischen Zellen in einer kontrollierten Umgebung hergestellt, die es diesen Zellen ermöglicht, sich selbst zu organisieren und in verschiedene Zelltypen zu differenzieren ^1,2,3. Einer der Hauptvorteile von Organoiden ist ihre Fähigkeit, die menschliche Biologie genauer zu rekapitulieren als herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkulturen ^1,2,3. Insbesondere hat sich gezeigt, dass menschliche Organoide die genetische Vielfalt ihres Ursprungsgewebes erhalten ^3,4,5. Organoide bieten eine einzigartige Möglichkeit, die Entwicklung menschlicher Organe zu untersuchen, Krankheiten zu modellieren und potenzielle Therapeutika in einer kontrollierten Laborumgebung zu testen. Darüber hinaus können Organoide aus individuellen Patientenproben abgeleitet werden, was Ansätze der personalisierten Medizin und die potenzielle Entwicklung individualisierter Behandlungen ermöglicht ^3,6,7.

Forscher haben menschliche Magenorganoide verwendet, um verschiedene Aspekte der Magenbiologie und -pathologie zu untersuchen. Prominente Beispiele sind die Verwendung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs) zur Vorhersage des Ansprechens auf eine Chemotherapie bei Magenkrebs ^8,9,10 und zur Modellierung der epithelialen Reaktion auf eine Helicobacter-pylori-Infektion ^11,12,13. Menschliche Magenorganoide bestehen aus verschiedenen Zelltypen, die im Magen vorkommen, darunter Halszellen, Grubenzellen und andere Stützzellen^11,14. Magenorganoide können entweder aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) oder direkt aus Magengewebe isoliert werden, das durch Biopsien gewonnen wurde, oder aus Magenresektionsproben^11,14. Die Isolierung von Magenstammzellen aus Magengewebe erfolgt üblicherweise durch Isolierung und Kultivierung von Magendrüsen oder enzymatisch verdauliche Gewebeproben zur Freisetzung einzelner Zellen ^9,13,15. Wichtig ist, dass sich die Differenzierung von Zellen innerhalb von Magenorganoiden, die mit einer dieser Techniken erzeugt wurden, als ähnlich erwiesen hat¹³. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf einen Einzelzellverdau.

Organoide stellen eine wissenschaftliche Innovation dar, die die Lücke zwischen traditioneller Zellkultur und ganzen Organen schließt. Da die Forschung auf diesem Gebiet weiter voranschreitet, sind Organoide bereit, zur Entwicklung wirksamerer Behandlungen und Therapien für eine Vielzahl von Anwendungen beizutragen. Angesichts der zunehmenden Nutzung von Magen-PDOs besteht ein zeitgemäßer Bedarf an einem standardisierten Ansatz für ihre Erzeugung. Hier wird das Protokoll zur Generierung menschlicher Magen-PDOs aus Einzelzellen beschrieben, die aus gutartigem Magenbiopsiegewebe isoliert wurden, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde. Wichtig und einzigartig ist, dass eine standardisierte Anzahl von Einzelzellen für die Aussaat bestimmt wird, um zuverlässig Magen-PDOs zu erzeugen und eine anschließende Charakterisierung zu ermöglichen. Mit dieser Technik werden zuverlässige Unterschiede in der Bildung und dem Wachstum von Organoiden nachgewiesen, die aus Biopsien des Magenkörpers oder des Magenantrums generiert wurden.

Protokoll

Sämtliches menschliches Gewebe, das in diesem Protokoll verwendet wurde, wurde von Personen gesammelt, die im Rahmen einer vom University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB #842961) genehmigten Magengewebeentnahmestudie eine informierte Einwilligung zur Gewebeentnahme erteilt hatten. Die Teilnehmer dieser Studie mussten sich im Rahmen ihrer Routineversorgung einer oberen Endoskopie unterziehen, mindestens 18 Jahre alt sein und in der Lage sein, eine informierte Einwilligung zu geben. Alle durchgeführten Untersuchungen hielten sich an die Richtlinien der University of Pennsylvania.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Bereiten Sie konditionierte L-WRN-Medien wie zuvor beschrieben^{vor 16}. Obwohl nicht zwingend erforderlich, können die Konzentrationen von Wnt-3A, R-Spondin und Noggin, die in den konditionierten Medien enthalten sind, mit einem handelsüblichen ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers überprüft werden (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie RPMI-Antibiotika (RPMI-ABX), PBS-Antibiotika (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), Verdauungspuffer und magenorganoide Medien vor (siehe Ergänzende Tabelle 1 für die detaillierte Zusammensetzung). Magenorganoide Medien sind bei 4 °C 1 Woche lang stabil.
3. Autoklavenpinzette, feine Präparierschere und 1,5-ml-Röhrchen.
4. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Basalmembranmatrix (Matrigel) auf Eis.
5. Beginnen Sie mit dem Auftauen des Aufschlusspuffers und des Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
6. Stellen Sie einen Inkubator-Orbitalschüttler auf 37 °C und 200 U/min ein.

2. Isolierung einzelner Zellen aus dem Biopsiegewebe

1. Entnahme von Magenbiopsien während einer oberen Endoskopie¹⁷ gemäß dem institutionellen klinischen Protokoll, wahrscheinlich unter Verwendung einer Jumbo-Pinzette. Verwenden Sie eine Nadel mit stumpfer Spitze, um Gewebeproben aus der Pinzette zu entnehmen und sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit RPMI-ABX-Medien zu geben. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, um es schnell ins Labor zu bringen.
   HINWEIS: Es sollten mindestens 2-4 Biopsien entnommen werden.
2. Lassen Sie das Biopsiegewebe am Boden des konischen Röhrchens absetzen. Verwenden Sie eine Pipette, um das Medium abzusaugen, und waschen Sie die Biopsien zweimal mit 1 ml PBS-ABX-Puffer. Eine Zentrifugation ist nicht erforderlich, da sich die Gewebestücke auf natürliche Weise im konischen Röhrchen absetzen.
3. Mindestens 20 mg Biopsiegewebe werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml PBS-DTT überführt.
4. Schneiden Sie das Gewebe mit einer feinen Präparierschere in Stücke, die 1-2 mm oder kleiner sind.
5. Verwenden Sie eine Tisch-Minizentrifuge für 15 Sekunden, um Gewebestücke am Boden des Röhrchens zu aggregieren und so viel Überstand wie möglich abzusaugen. Ein geringes Restvolumen von PBS-DTT ist akzeptabel.
6. Geben Sie 5 ml frisch erwärmten Aufschlusspuffer in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Um die kleinen Gewebestücke zu übertragen, ohne Gewebe zu verlieren, nehmen Sie 500 μl des Aufschlusspuffers und geben Sie ihn in das 1,5-ml-Röhrchen, das das Gewebe enthält. Als Nächstes modifizieren Sie die Spitze einer 1000-μl-Pipettenspitze mit einer Schere, um den Durchmesser der Spitze zu vergrößern und so eine einfache Aspiration und Übertragung von Gewebestücken in das konische 50-ml-Röhrchen mit dem Aufschlusspuffer zu ermöglichen.
7. Der Aufschlusspuffer und die Gewebemischung werden bei 37 °C für 30 min mit orbitalem Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
8. 5 ml erwärmtes Trypsin mit 0,25 % EDTA in den Aufschlusspuffer geben und weitere 10 Minuten bei 37 °C mit orbitalem Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
9. Neutralisieren Sie den Aufschlusspuffer und das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen des Advanced (Adv.) DMEM/F12-Mediums hinzufügen und die Lösung durch ein 70-μm-Zellsieb leiten.
10. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 1400 x g für 4 min bei 4 °C pelletiert. Abhängig von der anfänglichen Größe des Biopsiegewebes kann ein kleinzelliges Pellet sichtbar sein oder auch nicht.
11. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Adv. DMEM/F12-Medien und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer.
12. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation bei 1400 x g für 4 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entfernt.
    ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Isolierung einzelner Zellen aus dem Biopsiegewebe.

3. Einbettung einzelner Zellen in eine Basalmembran-Matrix-"Kuppel"

1. Berechnen Sie auf der Grundlage der gezählten Anzahl lebensfähiger Zellen das Volumen der Basalmembranmatrix, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 10⁵ lebensfähigen Zellen pro 50 μl Basalmembranmatrix zu erreichen.
2. Führen Sie die folgenden Schritte zügig durch, um zu verhindern, dass die Basalmembranmatrix vor dem Auftragen polymerisiert. Entfernen Sie die aufgetaute Basalmembranmatrix aus dem Eis, geben Sie das zuvor berechnete Volumen der Basalmembranmatrix zu den Zellen und mischen Sie vorsichtig, indem Sie ca. 10 s lang auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass während dieses Schritts keine Blasen entstehen. Verdünnen Sie die Basalmembranmatrix nicht.
3. Schnelle Pipettierung von 50 μl Aliquoten der Basalmembranmatrix/Zellmischung in die Mitte einzelner Vertiefungen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte.
4. Decken Sie die 24-Well-Platte sofort ab und drehen Sie die Platte mit einer einzigen sanften Bewegung auf den Kopf. Legen Sie die invertierte Platte für 35 Minuten in einen 37 °C warmen Gewebekultur-Inkubator, damit die Basalmembranmatrix polymerisieren kann.
   HINWEIS: Das Invertieren der Platte ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die Zellen auf den Boden der Platte sinken, und um die Membranmatrix des Grundmaterials in eine 3D-"Kuppel"-Form polymerisieren zu können.
5. Geben Sie 500 μl vorgewärmtes Magenorganoid-Medium in jede Vertiefung und stellen Sie sicher, dass die Oberseite jeder "Kuppel" vollständig in das Medium eingetaucht ist. Verteilen Sie das Medium an der Seite jedes Wells, um eine Störung der "Kuppel" zu vermeiden.
6. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.

4. Routinemäßige Passage von Organoiden durch Fragmentierung

1. Sobald die Organoide für die Passage bereit sind, entfernen Sie das Medium aus jeder dafür vorgesehenen Vertiefung.
   HINWEIS: Informationen zur Bestimmung des geeigneten Zeitpunkts für den Durchgang finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse".
2. Geben Sie 1 ml eiskaltes Adv. DMEM/F12-Medium direkt auf eine "Kuppel" der Basalmembranmatrix. Dies sollte leicht das Aufbrechen der "Kuppel" einleiten. Saugen und dosieren Sie weiter, bis sich alle Fragmente der "Kuppel" von der Platte lösen.
3. Transportieren Sie sowohl das Medium als auch die fragmentierte Basalmembranmatrix zur nächsten Bohrung und wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bohrungen, die für die Durchfahrt vorgesehen sind. Nach der Demontage der endgültigen Basalmembranmatrix "Dome" geben Sie das Medium und die Mischung aus Organoiden und Basalmembranmatrix in ein 1,5-ml-Röhrchen.
4. Befestigen Sie eine 1000-μl-Spitze an einer P1000-Pipette und führen Sie diese Spitze dann in eine 200-μl-Spitze ein. Dadurch entsteht eine Pipettenspitze, deren Durchmesser klein genug ist, um die Organoide zu fragmentieren und gleichzeitig die Aspiration eines größeren Volumens zu ermöglichen.
5. Pipettieren Sie die Mischung aus Organoiden und Basalmembranmatrix etwa 25 Mal kräftig auf und ab, um die Organoide in kleine Stücke zu zerkleinern.
6. Das fragmentierte Organoidgemisch wird mit einer Tischzentrifuge bei 4 °C für 30 s bei 2000 x g zentrifugiert. Dies führt zu einem Pellet aus fragmentierten Organoiden, das von der Basalmembranmatrix und dem Medium getrennt wird. Verwenden Sie eine Pipette, um das Medium und den Überstand der Basalmembranmatrix abzusaugen. Verwenden Sie kein Vakuum, um den Überstand anzusaugen, da das Pellet lose ist.
7. Berechnen Sie das Volumen der frisch aufgetauten Basalmembranmatrix, so dass die Anzahl der Wells/Domes im Verhältnis 1:2 (50 μl/Dome) aufgeteilt wird. Fügen Sie die frische Basalmembranmatrix hinzu und pipettieren Sie sie vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen, wobei Sie darauf achten müssen, dass keine Blasen entstehen.
8. 50 μl der Mischung aus Organoidfragmenten und Basalmembranmatrix werden schnell in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte aliquotiert.
9. Decken Sie die Platte ab, drehen Sie sie um und legen Sie sie für 35 Minuten in einen 37 °C heißen Gewebekultur-Inkubator, damit die Basalmembranmatrix polymerisieren kann.
10. Geben Sie 500 μl vorgewärmtes Magenorganoid-Medium in jede Vertiefung.
    HINWEIS: Abbildung 2 zeigt eine schematische Übersicht über die Passage von Organoiden aus dem Magen durch Fragmentierung.

Ergebnisse

Die anschließenden repräsentativen Ergebnisse stammen aus Biopsien, die aus dem gutartigen Epithel des Magenkörpers und der Magenantrumregionen von fünf verschiedenen Patienten entnommen wurden, die sich einer oberen Endoskopie unterzogen. Pro Patient wurden zwei bis vier "Kuppeln"/Wells plattiert und sowohl für Magenkörper- als auch für Antrumbiopsien analysiert. Organoide wurden erfolgreich aus dem Magenkörper und dem Magenantrumbiopsiegewebe von allen fünf Patienten generiert. Im Durchschnitt wurden 41 Organoide pro "...

Diskussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellen beschrieben, die aus Biopsien von gutartigem Epithel aus dem Magenkörper und dem Antrum isoliert wurden. Kritische Schritte im Protokoll drehen sich um das Timing sowie den Umgang mit der Basalmembranmatrix. Um die Lebensfähigkeit zu erhalten, ist es wichtig, das Protokoll so schnell wie möglich nach der Entnahme des Biopsiegewebes einzuleiten. Ziel ist es, innerhalb von 30 Minuten nach der Biopsie mit der Verda...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R& D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Zelllinie	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazol	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R& D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA-Kit	R& D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503