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Methodenartikel

Regulierung des Schwann-Zellwachstums durch ein gepulstes elektrisches Feld im Nanosekundenbereich für die periphere Nervenregeneration in vitro

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DOI:

10.3791/66097

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3. Mai 2024

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1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, 2College of Medicine, Zhejiang University, 3Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 4Department of Orthopedic Physical Therapy, Faculty of Physical Therapy, Nahda University in Beni Suef, 5Plastic & Cosmetic Center, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Anwendung eines elektrischen Nanosekunden-Pulsfeldes (nsPEF) zur Stimulation von Schwann-Zellen in vitro vor. Die Synthese- und Sekretionsfähigkeit relevanter Faktoren und Veränderungen des Zellverhaltens bestätigten die erfolgreiche Stimulation mit nsPEF. Die Studie gibt ein positives Bild von der Methode der peripheren Nervenregeneration.

Zusammenfassung

Schwann-Zellen (SCs) sind myelinisierende Zellen des peripheren Nervensystems und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regeneration peripherer Nerven. Das Nanosekunden-Puls-Elektrofeld (nsPEF) ist eine aufstrebende Methode, die bei der elektrischen Nervenstimulation anwendbar ist und sich bei der Stimulierung der Zellproliferation und anderer biologischer Prozesse als wirksam erwiesen hat. Mit dem Ziel, zu beurteilen, ob SCs unter nsPEF signifikante Veränderungen erfahren, und um das Potenzial für neue periphere Nervenregenerationsmethoden zu erforschen, wurden kultivierte RSC96-Zellen einer nsPEF-Stimulation bei 5 kV und 10 kV unterzogen, gefolgt von einer fortgesetzten Kultivierung für 3-4 Tage. Anschließend wurden einige relevante Faktoren, die von SCs exprimiert wurden, bewertet, um die erfolgreiche Stimulation zu demonstrieren, einschließlich des spezifischen Markerproteins, des neurotrophen Faktors, des Transkriptionsfaktors und des Myelinisierungsregulators. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten, dass nsPEF die Proliferation und Migration von SCs und die Fähigkeit zur Synthese relevanter Faktoren, die positiv zur Regeneration peripherer Nerven beitragen, signifikant verbessert. Gleichzeitig deutete eine geringere Expression von GFAP auf eine gutartige Prognose peripherer Nervenverletzungen hin. All diese Ergebnisse zeigen, dass nsPEF ein großes Potenzial als effiziente Behandlungsmethode für periphere Nervenverletzungen durch Stimulation von SCs hat.

Einleitung

Jedes Jahr sind Millionen von Menschen von Nervenverletzungen betroffen, die sowohl das periphere Nervensystem (PNS) als auch das zentrale Nervensystem (ZNS) betreffen1. Studien haben gezeigt, dass die axonale Reparaturkapazität des ZNS nach Nervenverletzungen recht begrenzt ist, während das PNS aufgrund der signifikanten Plastizität von SCs eine erhöhte Kapazität aufweist2. Dennoch ist die vollständige Regeneration nach Verletzungen peripherer Nerven nach wie vor schwierig und stellt nach wie vor eine erhebliche Herausforderung für die menschliche Gesundheitdar 3,4. Heutzutage sind Autotransplantate trotz der Nachteile der Morbidität an der Spenderstelle und der begrenzten Verfügbarkeit eine gängige Behandlung geblieben5. Diese Situation hat Forscher dazu veranlasst, alternative Therapien zu erforschen, darunter die Materialien6, die molekularen Faktoren7 und die elektrische Stimulation (ES). Als Faktor, der das axonale Wachstum und die Nervenregeneration fördert8, ist die Wahl einer geeigneten Methode der ES und die Erforschung der Beziehung zwischen ES und SC unerlässlich.

SCs sind die wichtigsten Gliazellen des PNS und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regeneration des PNS 9,10. Nach peripheren Nervenverletzungen durchlaufen SCs eine schnelle Aktivierung, eine umfangreiche Reprogrammierung2 und einen Übergang von einem myelinbildenden Zustand zu einer wachstumsfördernden Morphologie, um die Regeneration des Nervsdurchzuführen 2. Eine substantielle Proliferation von SCs tritt am distalen Ende des verletzten Nervs auf, während SCs des distalen Stumpfes eine Proliferation und Dehnung erfahren, um das Bungner-Band zu bilden, das notwendig ist, um Axone zum Wachstum in Richtung des Zielorgans zu leiten11. Darüber hinaus wandern SCs aus den proximalen und distalen Nervenstümpfen in die Nervenbrücke, um SC-Stränge zu bilden, die die Axonregeneration fördern12. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass sich die Synthese und Sekretion relevanter Faktoren, die mit SCs zusammenhängen, bei der peripheren Nervenregeneration ändern, einschließlich der transkriptionellen Faktoren13, der neurotrophen Faktoren14 und der Myelinisierungsregulatoren13. Dies liefert auch Indikatoren für die Beurteilung der Aktivität von SCs. Basierend auf diesen wurde die Förderung der SC-Proliferation, Migration, Synthese und Sekretion relevanter Faktoren zur Verbesserung der peripheren Nervenregeneration umfassend untersucht15.

Frühere Studien haben die Möglichkeit des Einsatzes von ES zur Nervenregeneration gezeigt1. Eine weithin akzeptierte Erklärung ist, dass ES die Depolarisation von Zellmembranen induzieren, das Membranpotenzial verändern und die Funktionen von Membranproteinen beeinflussen kann, indem es die Ladungsverteilungen auf diesen Biomolekülen verändert1. Weit verbreitetes intensives PEF kann jedoch starke Schmerzen, unwillkürliche Muskelkontraktionen und Herzflimmern verursachen8. Es erhöht auch die Aktivität der Kreatinkinase (CK), verringert die Muskelkraft und induziert die Entwicklung von verzögert einsetzendem Muskelkater (DOMS)16. nsPEF ist eine aufstrebende Technik, die Probanden innerhalb einer Nanosekunden-Pulsdauer mit elektrischen Hochspannungsfeldern stimuliert und nach und nach in der Forschung auf zellulärer Ebene eingesetzt wird17,18. Frühere Studien haben berichtet, dass die mögliche Begründung dafür, dass nsPEF die Zellproliferation und Organellenaktivität fördert, die Bildung von Membran-Nanoporen und die Aktivierung von Ionenkanälen ist, was zu einem Anstieg der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration führt19. nsPEF nutzt die Pulsleistungstechnologie, um die Zellmembran aufzuladen und Pulse zu erzeugen, die sich durch kurze Dauer, schnelle Anstiegszeit, hohe Leistung und niedrige Energiedichteauszeichnen 20. Diese Eigenschaften deuten darauf hin, dass nsPEF ein bevorzugter Modus mit minimalen Stimulationsnebenwirkungen sein könnte8. Darüber hinaus bietet nsPEF im Vergleich zu chirurgischen Eingriffen Vorteile wie minimalinvasive Eingriffe, Reversibilität, Anpassbarkeit und Zerstörungsfreiheit des Nervengewebes. Eine Hauptforschungsrichtung von nsPEF im biomedizinischen Bereich ist seine Anwendung für die Ablation von Tumorgewebe unter Verwendung der Stimulation hochenergetischer elektrischer Felder 21,22,23. Einige Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass 12-nsPEF periphere Nerven stimulieren kann, ohne Schäden zu verursachen24. Derzeit gibt es jedoch nur begrenzte Evidenz für die Anwendung von nsPEF im Bereich der Nervenregeneration. Darüber hinaus ist die Stimulation von SCs mit nsPEF ein Pionierversuch, der zu weiterer In-vivo- und klinischer Forschung beiträgt. In dieser Studie wird untersucht, ob die nsPEF-Stimulation von SCs die Nervenregeneration fördern und eine verlässliche Grundlage für nachfolgende vertiefte und systematische Forschungen bieten kann.

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Protokoll

1. Auftauen von kryokonservierten RSC96-Zellen

  1. Tauen Sie das Kryofläschchen mit 1 ml Zellsuspension auf, indem Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell schütteln, und geben Sie es dann in ein Zentrifugenröhrchen mit 4-6 ml vollständigem Kulturmedium und mischen Sie es gut.
  2. Zentrifugieren Sie 3-5 Minuten lang bei 1000 x g , verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 mL vollständigem Kulturmedium.
  3. Die Zellsuspension wird in einen Kulturkolben (oder eine Schale) gegeben, der 6-8 ml vollständiges Kulturmedium enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
  4. Beobachten Sie am nächsten Tag das Zellwachstum und die Zelldichte unter dem Mikroskop.

2. Zellpassage:

HINWEIS: Wenn die Zellendichte 80%-90% erreicht, ist es bereit für den Durchgang.

  1. Entsorgen Sie das Nährmedium und spülen Sie die Zellen 1-2 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium- und Magnesiumionen.
  2. 0,25 % (w/v) Trypsin-0,53 mM EDTA in den Kulturkolben geben (1-2 mL für einen T25-Kolben, 2-3 mL für einen T75-Kolben) und 1-2 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Beobachten Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Wenn die meisten Zellen rund werden und sich ablösen, stellen Sie den Kolben schnell wieder in den Arbeitsbereich, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben und fügen Sie 3-4 ml Kulturmedium mit 10 % FBS hinzu, um den Verdau zu stoppen.
  4. Mischen Sie den Inhalt, aspirieren Sie die Lösung und zentrifugieren Sie sie bei 1000 x g für 5 min. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 1-2 ml frisches Kulturmedium hinzufügen und vorsichtig pipettieren.
  5. Die Zellsuspension wird im Verhältnis 1:2 in einen neuen T25-Kolben überführt und 7 ml Kulturmedium hinzugefügt.

3. Betrieb des nsPEF-Geräts

  1. Resuspendieren Sie die RSC96-Zellen in 1 mL DMEM-Kulturmedium und überführen Sie sie in kolorimetrische Schalen mit Elektroden auf beiden Seiten.
  2. Schalten Sie den Netzschalter ein.
  3. Passen Sie die Parameter an, indem Sie den Knopf am Instrument drehen, um die Intensität des elektrischen Feldes zu ändern. Die in dieser Studie festgelegten Intensitäten betragen 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm und 40 kV/cm.
  4. Drehen Sie die Elektroden vorsichtig, bis Funken entstehen, so dass die Zellen 5 Impulse von nsPEF entsprechend den voreingestellten Feldstärkeintensitäten empfangen können, bevor Sie die beiden Elektroden sofort trennen. Nach dieser Behandlung werden die mit nsPEF behandelten Zellen der Versuchsgruppe und die unbehandelten Zellen der Kontrollgruppe nach einer bestimmten Zeit der Zellkultur (1 Tag in diesem Experiment) die Abschnitte 4 bis 6 durchgeführt.

4. Zellzählkit-8 (CCK-8) Assay

  1. Bereiten Sie eine Zellsuspension einer bestimmten Konzentration aus RSC96-Zellen vor, die durch elektrische Stimulation stimuliert wurden. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte. Unter Berücksichtigung der Anforderungen des CCK-8-Assays ist die Gesamtzahl der Zellen im Reagenzkit zwischen 1 x 103 und 1 x 106 zu kontrollieren.
  2. Nehmen Sie 10 μl CCK-8-Lösung aus dem Kit und geben Sie sie auf die 96-Well-Zellkulturplatte. In einem CO2 -Inkubator bei 37 °C für weitere 30 min bis 4 h inkubieren.
  3. Messen Sie die Absorption. Verwenden Sie die Dual-Wellenlängen-Messung mit einer Detektionswellenlänge von 430-490 nm und einer Referenzwellenlänge von 600-650 nm.
  4. Bestimmen Sie die Feldstärkeintensität für nachfolgende Experimente auf der Grundlage der experimentellen Ergebnisse der Zellproliferation. Wählen Sie Zellen mit guter Proliferation für nachfolgende Experimente aus.

5. Zell-Scratch-Assay

  1. In jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte werden 3 x 105 Zellen mit einem Gesamtvolumen von 2 ml pro Vertiefung ausgesät. Etwa 72 Stunden später werden die Zellen die Vertiefung abdecken. Führen Sie den Test an der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe getrennt durch.
  2. Zeichnen Sie mit einer Pipettenspitze eine horizontale Linie am Boden der Kulturvertiefung. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze senkrecht gehalten wird, und versuchen Sie, ein Verkanten zu vermeiden.
  3. Aspirieren Sie das Nährmedium und waschen Sie es 2-3 Mal mit PBS.
  4. Geben Sie 2 ml serumfreies Medium in jede Vertiefung.
  5. Stellen Sie die Platte in den 37 °C heißen Inkubator. Nehmen Sie Bilder unter einer vierfachen Vergrößerung des inversen Mikroskops bei 0 h und 24 h auf, um Veränderungen in der Zellmigration zu beobachten.

6. Immunfluoreszenz

  1. Permeabilisierung der Zellen:
    1. Nachdem Sie die Zellsuspensionen vorsichtig in Kulturschalen pipettiert haben, zeichnen Sie mit einem Histologiestift Kreise an den Stellen, an denen die Zellen gleichmäßig auf dem Deckglas verteilt sind. Behandeln Sie die Kontrollgruppe und die verschiedenen Versuchsgruppen getrennt.
    2. 50-100 μl Permeabilisierungs-Arbeitslösung (0,25-0,5 % Triton X-100) zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Dreimal mit PBS waschen für jeweils 5 Minuten.
  2. Serumblockierung: Fügen Sie 3% BSA innerhalb der Kreise hinzu, um das Gewebe gleichmäßig zu bedecken. 30 Minuten bei RT inkubieren.
  3. Inkubation des Primärantikörpers: Entfernen Sie vorsichtig die Blockierungslösung und geben Sie den entsprechend verdünnten Primärantikörper (aus der Maus, verdünnt bei 1:300) in die Zellvertiefungen. Stellen Sie die Zellkulturplatte in eine feuchte Box und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
  4. Inkubation von Sekundärantikörpern: Legen Sie die Zellplatte auf einen Schüttler und waschen Sie sie dreimal für jeweils 5 Minuten. Der entsprechende Sekundärantikörper (CY3-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG, verdünnt bei 1:300) wird zugegeben und 50 Minuten lang bei RT inkubiert.
  5. DAPI-Kernfärbung:
    1. Legen Sie den Deckglas in PBS (pH 7,4) auf einen Shaker und waschen Sie ihn dreimal für jeweils 5 Minuten.
    2. Nach dem schonenden Trocknen des Objektträgers wird DAPI-Färbelösung (2 μg/ml, 0,5 mL pro Kreis) in die Kreise gegeben und 10 Minuten lang bei RT in einem dunklen Raum inkubiert.
  6. Montage: Legen Sie das Deckglas in PBS (pH 7,4) auf einen Shaker und waschen Sie es dreimal für jeweils 5 Minuten. Nach dem schonenden Trocknen des Objektträgers versiegeln Sie das Deckglas mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium für die Fluoreszenz.
  7. Bildaufnahme: Anregung von DAPI bei einer Wellenlänge von 330-380 nm und Detektion von Emission bei 420 nm; Anregung bei 465-495 nm und Detektion der Emission bei 515-555 nm für AF488; Anregung bei 510-560 nm und Detektion von Emission bei 590 nm für CY3; Anregung bei 608-648 nm und Detektion von Emission bei 672-712 nm für CY5.

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Ergebnisse

Gepulste elektrische Felder mit geringer Intensität stimulieren die Zellproliferation
Dem CCK-8-Assay zufolge war die Proliferationsrate von RSC96 in der 5 kV/cm-Gruppe signifikant schneller als die der Zellen der Kontrollgruppe. Mit zunehmenden Parametern (20 kV/cm und 40 kV/cm) war die Proliferationsrate jedoch instabil und sogar niedriger als die der Kontrollgruppe. Die Zellproliferationsrate von RSC96-Zellen in der 40 kV/cm-Gruppe war signifikant niedriger als in der Kontroll- und der 5 kV/cm-Grup...

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Diskussion

In den letzten Jahren hat die Anwendung von nsPEF, wie berichtet, ein Schub für das Wachstum erfahren. nsPEF hat eine sehr gezielte Wirkung nur auf den gewünschten Bereich und liefert genügend Energie für die Behandlung, ohne zusätzliche thermische Schäden zu verursachen, was es für den menschlichen Körper sicherer macht28. Diese Eigenschaften geben ihm vielversprechende translationale Aussichten in der Tumorbehandlung und Nervenregeneration. Einige Studien haben jedoch einige Einschränkungen von ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (Nr. 82027803) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antifading-EindeckmediumWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1401
Anti-GFAP-Maus mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12100-100
Anti-Neurofilament schweres Polypeptid Maus mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12144-100
Anti-S100 Beta MausmAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB14146-100
BSAWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGC305010
DeckglasJiangsu Shitai experimentelle Ausrüstung Co., LTD10212432C
CY3-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgGWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB21302
Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1012
EntfärbungsschüttlerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDDS-2S100
Hochspannungsnetzteil für nsPEFMatsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L
Histochemischer StiftWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6100
Membranbrechende FlüssigkeitWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1204
ObjektträgerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6012
PalmenzentrifugeWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMS6000
PBS pulverisiertWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG0002
PipetteWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positives FluoreszenzmikroskopNikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
Kaninchen Anti-SOX10/AF488 Konjugierter AntikörperBeijing Bioss Biotechnology Co., LTDBS-20563R-AF488
RSC96 Schwann-ZellenWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdSTCC30007G-1
Scanister3DHISTECHPannoramic MIDI
Spezialkabel für nsPEFTimes Microwave SystemsM17/78-RG217
TurbinenmischerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMV-100
DAPI-Färbereagenz

Referenzen

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