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Tragbarer papierbasierter Immunoassay kombiniert mit Smartphone-Anwendung für den kolorimetrischen und quantitativen Nachweis des Dengue-NS1-Antigens

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DOI:

10.3791/66130

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26. Januar 2024

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1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um dringende diagnostische Anforderungen an Dengue zu erfüllen, stellen wir hier ein in die Smartphone-App integriertes Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) zur Quantifizierung der Dengue NS1-Antigenkonzentration in klinischen Serum-/Blutproben vor. Diese Innovation verbessert das Dengue-Management, indem sie die klinische Entscheidungsfindung in verschiedenen Gesundheitseinrichtungen unterstützt, auch in ressourcenbegrenzten.

Zusammenfassung

Die Infektion mit dem Dengue-Virus (DENV), die von Aedes-Mücken übertragen wird, ist ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit in tropischen und subtropischen Ländern. Bei einer jährlichen Inzidenz von etwa 10 Millionen Fällen und 20.000 bis 25.000 Todesfällen, insbesondere bei Kindern, besteht ein dringender Bedarf an praktischen Diagnoseinstrumenten. Das Vorhandensein von Dengue-Nichtstrukturprotein 1 (NS1) während einer frühen Infektion wurde mit der Freisetzung von Zytokinen, vaskulärer Leckage und endothelialer Dysfunktion in Verbindung gebracht, was es zu einem potenziellen Marker für schweres Dengue-Fieber macht.

Papierbasierte Immunoassays wie Lateral-Flow-Assays (LFAs) und mikrofluidische papierbasierte Analysegeräte (PADs) haben aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit, Kosten, Spezifität und Leichtigkeit der Interpretation als diagnostische Tests an Popularität gewonnen. Herkömmliche papierbasierte Immunoassays für den Dengue-NS1-Nachweis beruhen jedoch in der Regel auf einer visuellen Inspektion und liefern nur qualitative Ergebnisse. Um diese Einschränkung zu beheben und die Empfindlichkeit zu erhöhen, schlugen wir einen hochgradig tragbaren NS1-Dengue-Nachweis-Assay auf einem papierbasierten Analysegerät (PAD) vor, nämlich DEN-NS1-PAD, das eine Smartphone-Anwendung als kolorimetrisches und quantitatives Lesegerät integriert. Das Entwicklungssystem ermöglicht die direkte Quantifizierung von NS1-Konzentrationen in klinischen Proben.

Serum- und Blutproben von Patienten wurden verwendet, um die Leistung des Systemprototyps zu demonstrieren. Die Ergebnisse wurden sofort erhalten und können für die klinische Bewertung verwendet werden, sowohl in gut ausgestatteten Gesundheitseinrichtungen als auch in ressourcenbegrenzten Umgebungen. Diese innovative Kombination aus einem papierbasierten Immunoassay mit einer Smartphone-Anwendung bietet einen vielversprechenden Ansatz für den verbesserten Nachweis und die Quantifizierung des Dengue-NS1-Antigens. Durch die Erhöhung der Empfindlichkeit über die Möglichkeiten des bloßen Auges hinaus birgt dieses System ein großes Potenzial für die Verbesserung der klinischen Entscheidungsfindung bei der Dengue-Behandlung, insbesondere in abgelegenen oder unterversorgten Gebieten.

Einleitung

Die Infektion mit dem Dengue-Virus (DENV) ist die sich am schnellsten ausbreitende durch Mücken übertragene Krankheit1, und mehr als 390 Millionen Menschen sind mit 96 Millionen symptomatischen Infektionen infiziert, 2 Millionen Fälle schwerer Erkrankungen und mehr als 25.000 Todesfälle pro Jahr treten weltweit auf 1,2. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind schätzungsweise 3,9 Milliarden Menschen von Dengue bedroht; ~70% leben in den Ländern des asiatisch-pazifischen Raums und hauptsächlich in Südostasien3. Im Jahr 2019 betrug die Zahl der der WHO gemeldeten Dengue-Fälle 4,2 Millionen, und Thailand trug mindestens 136.000 Dengue-Fälle und 144 Todesfälle durch Dengue-Infektionbei 4. Der Dengue-Ausbruch in Thailand tritt während der Regenzeit von April bis Dezember sowohl in städtischen als auch in ländlichen Gebieten auf, insbesondere im Nordosten.

DENV-Infektionen haben unterschiedliche klinische Manifestationen, die von subklinischen Symptomen, leichtem Dengue-Fieber (DF) bis hin zu schwerem hämorrhagischem Dengue-Fieber (DHF) reichen. Das Hauptmerkmal einer schweren DHF-Erkrankung ist eine erhöhte Gefäßpermeabilität, gefolgt von Schock und Organfunktionsstörungen1. Das Verständnis des molekularen Signalwegs, der das Gefäßleck verursachen kann, ist sehr wichtig für die Entwicklung wirksamer Dengue-Behandlungen. Dengue-Nichtstrukturprotein 1 (NS1) ist ein sezerniertes Glykoprotein während einer frühen Virusinfektion 5,6 und fungiert als Cofaktor für die virale RNA-Replikation7. NS1 kann die Freisetzung von Zytokinen auslösen und zum Gefäßleck beitragen, indem es an den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) und die endotheliale Glykokalyxbindet 8,9. In-vitro-Forschungen haben gezeigt, dass NS1 mit Endothelzellen interagiert und Apoptose induziert. Dieser Zustand kann zu endothelialer Dysfunktion und Gefäßleckbeitragen 10. Die NS1-Antigenspiegel, korreliert mit den Serum-Interleukin (IL)-10-Spiegeln, waren bei Patienten mit schwerer klinischer Erkrankung signifikant erhöht11. Dengue NS1 trägt auch zur Krankheitspathogenese bei, indem es IL-10 induziert und DENV-spezifische T-Zell-Antworten unterdrückt12,13. Darüber hinaus war das Dengue-NS1-Protein mit einer schweren klinischen Erkrankung verbunden, und die Konzentration von NS1 > 600 ng ml-1 in den ersten 3 Tagen der Krankheit war mit der Entwicklung von DHF14 verbunden.

Die Persistenz des Dengue-NS1-Antigens bei Patienten mit DHF könnte als Marker für schweres Dengue-6 verwendetwerden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von NS1 in klinischen Proben, wie z. B. den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und den Schnelltest15. Der Goldstandard für die Messung der Konzentration von NS1-Proteinen im klinischen Umfeld ist die ELISA-Methode. Die ELISA-Methode ist jedoch teuer und erfordert qualifiziertes Personal und Laboreinrichtungen16. Daher ist die Entwicklung der Technologie zum Nachweis und zur Quantifizierung von NS1-Proteinen im Point-of-Care-Test (POCT) noch nicht abgeschlossen. In den letzten zehn Jahren sind papierbasierte Immunoassays wie Lateral-Flow-Assays (LFAs) und mikrofluidische papierbasierte Analysegeräte (μPADs) aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit, Kosteneffizienz und Spezifität als diagnostische Tests beliebt geworden 17,18,19. In einem papierbasierten Immunoassay wurden mehrere Markierungen verwendet, um Signale zu erzeugen, wie z. B. Goldnanopartikel (AuNPs)20, magnetische Nanopartikel21,22, Quantenpunkte23 und Fluoreszenzmaterialien24,25. AuNPs sind die am häufigsten verwendeten Etiketten in papierbasierten Immunoassays aufgrund ihrer kostengünstigen Produktionskosten, einfachen Herstellung, Stabilität und einfachen Ablesung. Derzeit werden Lateral-Flow-Assays (LFAs) für Dengue NS1 bekanntermaßen im klinischen Umfeld eingesetzt26,27. Bei der herkömmlichen LFA-Markierungserkennung wird jedoch häufig mit bloßem Auge gearbeitet und nur qualitative Ergebnisse geliefert.

In den letzten zehn Jahren wurden weltweit mehr als 5 Milliarden Smartphones eingesetzt, und es besteht Potenzial für die Entwicklung einer tragbaren Erkennung 28,29. Smartphones verfügen über multifunktionale Fähigkeiten wie eingebaute physische Sensoren, Multi-Core-Prozessoren, Digitalkameras, USB-Anschlüsse, Audioanschlüsse, WLAN und Anwendungssoftware, wodurch sie für den Einsatz in verschiedenen Biosensorplattformen geeignetsind 30. Darüber hinaus ermöglichen drahtlose Technologien einen schnellen Datenversand und können für die Echtzeit- und Vor-Ort-Überwachung verwendet werden31. Mudanyali et al. kombinierten den papierbasierten Immunoassay und Smartphones, um eine tragbare, gerätelose, schnelle, kostengünstige und benutzerfreundliche POCT-Plattform für Malaria, Tuberkulose und HIV32 zu entwickeln. Ling et al. berichteten über einen Lateral-Flow-Assay in Kombination mit einer Smartphone-Kamera, um die alkalische Phosphatase-Aktivität in Milch quantitativ nachzuweisen33. Hou et al. entwickelten auch ein Smartphone-basiertes, dual-modales Bildgebungssystem für quantitative Signale von Farbe oder Fluoreszenz im Lateral-Flow-Assay34. Darüber hinaus kann die Verwendung des Smartphones als kolorimetrisches und quantitatives Lesegerät die Empfindlichkeit verbessern, während das bloße Auge das Vorhandensein des Ziels35 nicht sicher melden kann.

Das DEN-NS1-PAD36,37,38 (im Folgenden als Gerät bezeichnet) stellt einen Durchbruch in der Dengue-Diagnostik dar und bietet eine tragbare und effiziente Lösung. Mit Hilfe von wachsgedruckter mikrofluidischer papierbasierter Technologie quantifiziert dieses Gerät NS1 mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität durch Bildverarbeitung. Um den Nutzen weiter zu erhöhen, haben wir eine benutzerfreundliche Smartphone-App für die kolorimetrische und quantitative Ablesung entwickelt. Die klinische Validierung anhand von Patientenproben aus thailändischen Krankenhäusern unterstreicht die unmittelbare Wirkung auf die Echtzeit-Patientenbeurteilung. Unsere Innovation markiert einen entscheidenden Fortschritt im optimierten Point-of-Care-Dengue-Management und verspricht, die Diagnostik in ressourcenbegrenzten Gesundheitslandschaften zu revolutionieren.

Protokoll

Die Ethikkommission des Institutional Review Board, Royal Thai Army Medical Department, Phramongkutklao Hospital, Bangkok, Thailand (IRBRTA 1218/2562) erteilte die Genehmigung. Bei der Durchführung dieser Studie haben wir alle notwendigen ethischen Vorschriften eingehalten.

1. Geräteherstellung des papierbasierten Immunoassays

HINWEIS: Das papierbasierte Immunoassay-Gerät wurde nach zuvor etablierten Methoden36,37 und dem thailändischen Patentantrag Nr. 19010081638 hergestellt.

  1. Design und Musterzeichnung: Entwerfen Sie das Papieranalysegerät (Abbildung 1A,B) mit 18 PAD-Wachsmodellen auf einem Computer.
    HINWEIS: Das Design ist spezifisch und für Papier im A5-Format vorgesehen. Die Anzahl der PADs hängt mit der Größe des Papiers zusammen, wie es der Benutzer benötigt.
  2. Drucken Sie das entworfene Muster mit einem Wachsdrucker auf das Zellulosepapier (Materialtabelle).
  3. Das Wachsdruckpapier im Laborofen 75 s bei 150 °C schmelzen. Bewahren Sie es anschließend in einer Kieselsäurebox auf, bis es für die nachfolgenden Schritte benötigt wird.
  4. Tragen Sie 0,5 μl 0,025 % Poly-L-Lysin (PLL) sowohl auf den Test- als auch auf den Kontrollbereich auf. Bei Raumtemperatur (RT) 2 min in einer Silica-Box inkubieren und dann 5 min bei 65 °C im Ofen erhitzen.
  5. Tragen Sie 0,5 μl 1 μg μl-1 Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper auf den Kontrollbereich und 0,5 μl 1 μg μl-1 des Capture-Antikörpers auf den Testbereich auf. Lassen Sie die Tropfen in einer Kieselgel-Box bei RT 30 Minuten trocknen.
  6. Tragen Sie 2 μl des Blockierungspuffers auf den Probenbereich, 3 μl auf den konjugierten Bereich und 2 μl auf den Nachweisbereich auf. Lassen Sie die Tropfen bei RT in einer Kieselgel-Box 30 min trocknen.
  7. Tragen Sie 2 μl Gold-Nanopartikel-Antikörper-Komplex-Lösung (AuNPs-Ab) auf den konjugierten Bereich auf und lassen Sie sie 30 Minuten lang in einer Kieselgelbox bei RT trocknen.

2. Zusammenbau des papierbasierten Immunoassays

  1. Entfernen Sie vorsichtig die Schutzfolie auf der Rückseite der selbstklebenden Kunststoff-Trägerkarte, um den Klebstoff freizulegen.
  2. Richten Sie das behandelte Zellulosepapier an der selbstklebenden Kunststoff-Trägerkarte aus und drücken Sie die beiden Schichten fest zusammen.
    Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das hydrophile Feld zu berühren, um das Risiko einer Kontamination oder Beschädigung des Geräts zu minimieren.
  3. Lege eine Plastikfolie auf, um das Papier zu beschichten, und drücke sie zusammen.
  4. Schneiden Sie das gewünschte Gerät mit einer Schere aus Blechen komplett montierter Geräte.
  5. Die DEN-NS1-PADs (Abbildung 1C) sind jetzt einsatzbereit. Für Langzeitstabilität bei 4 °C lagern.

3. Herstellung des AuNPs-Ab-Konjugats

HINWEIS: Der AuNPs-Ab wurde wie zuvor von Prabowo et al.36 beschrieben hergestellt.

  1. Kombinieren Sie 10 μl 1 mg ml−1 Anti-NS1-Antikörper in PBS, 1 ml 40-nm-AuNPs-Kolloid und 0,1 ml 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5).
  2. Drehen Sie die Mischung 60 Minuten lang bei 50 U/min und inkubieren Sie sie bei RT.
  3. Tragen Sie 0,1 ml 10 mg ml−1 BSA in BBS auf, drehen Sie bei 50 U/min und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei RT.
  4. Die Lösung wird bei 20.187 × g und 4 °C 30 min lang zentrifugiert.
  5. Den Überstand vorsichtig pipettieren und vom ausgefällten AuNPs-Ab trennen.
  6. Resuspendieren Sie das AuNPs-Ab in 500 μl BBS und dispergieren Sie es mit Ultraschall.
  7. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 20.187 × g und 4 °C für 30 min.
    HINWEIS: Wiederholen Sie den Dispergier- und Zentrifugationsprozess 3x.
  8. Geben Sie 50 μl des konjugierten Puffers in die Suspension und bereiten Sie ihn für die Anwendung auf dem konjugierten Bereich vor.

4. Entwicklung mobiler Anwendungen

  1. Bildverarbeitung und Entwicklung von maschinellem Lernen
    1. Sammeln Sie einen Datensatz für ein überwachtes Bildmodell, indem Sie über 900 Autofokus-Bilder von DEN-NS1-PADs sammeln und verschiedene Bedingungen wie unterschiedliche Konzentrationen, Kameramarken (12-13 Megapixel), Drehungen (90° und 180°) und Beleuchtungseinstellungen erfassen. Streben Sie 30 Bilder unter jeder spezifischen Bedingung an.
    2. Kennzeichnen Sie die Grundwahrheit, indem Sie zwei Interessenbereiche als Test- und Kontrollbereiche innerhalb der gesammelten Bilder für überwachtes Lernen identifizieren und kommentieren.
    3. Entwerfen Sie einen Algorithmus, um den Hintergrundstreifen zu identifizieren. Lokalisieren Sie die Mittellinie zwischen dem Test- und dem Kontrollbereich, berechnen Sie ihren Mittelpunkt, und legen Sie einen quadratischen Bereich fest, der proportional zur durchschnittlichen Größe der beiden Hauptbereiche ist, während die gleiche Rotationsausrichtung beibehalten wird.
    4. Erstellen Sie ein Bildsegmentierungsmodell mit dem Datensatz und den Ground-Truth-Beschriftungen aus den Schritten 4.1.1 und 4.1.2, um ein Bildsegmentierungsmodell zur Identifizierung der interessierenden Regionen zu trainieren.
  2. Anwendungsalgorithmus
    1. Wenden Sie das trainierte Bildsegmentierungsmodell auf neue Bilder an, um die Test-, Kontroll- und Hintergrundbereiche automatisch zu finden.
    2. Verwenden Sie grundlegende Bildverarbeitungstechniken, um einen einzelnen Intensitätswert für jeden der drei interessierenden Bereiche (Test, Kontrolle und Hintergrund) zu erhalten.
    3. Transformieren Sie das Bild in eine 3D-Array-Darstellung (y, x-Kanal), um auf Pixelwerte zuzugreifen.
    4. Konvertieren Sie das Bild in Graustufen, indem Sie RGB-Werte mitteln, und wenden Sie die Inversion mit der Formel (255-x) an.
    5. Normalisieren Sie die Werte des Test- und Kontrollbereichs, indem Sie den Wert des Hintergrundbereichs subtrahieren.
    6. Verwenden Sie die voreingestellte Kalibrierungskurve, um die Konzentration von NS1 zu berechnen.
    7. Klassifizieren Sie die Ergebnisse als positiv oder negativ basierend auf einem Cut-off-Wert von 0,1103, der aus den normalisierten Graustufenintensitäten37 abgeleitet wird.

5. Kalibrierkurve und Empfindlichkeiten

  1. Bereiten Sie die NS1-Probe in Humanserum für die Kalibrierung mit Konzentrationen von 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 μg ml-1 vor.
  2. Geben Sie 50 μl jeder Konzentration auf den Probenbereich und führen Sie Messungen in dreifacher Ausführung durch.
  3. Lassen Sie die Proben vollständig in das Gerät eindringen, was 20-30 Minuten dauern kann, bis Sie Ergebnisse erhalten.
  4. Nehmen Sie nach 5 Minuten Inkubation Bilder des Geräts mit einer Digitalkamera oder einem Smartphone auf.
  5. Analysieren Sie die Test- und Kontrollbereiche mit ImageJ und einer benutzerdefinierten mobilen Anwendung.
  6. Erstellen Sie die Kalibrierungskurve basierend auf Daten aus ImageJ und der mobilen Anwendung.
  7. Berechnen Sie die Blindgrenze (LOB), die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) mit den folgenden Gleichungen (1-3):
    LOB = Mittelwert der Blinddaten + 1:645* ð (Standardabweichung der Blinddaten) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (Standardabweichung der niedrigsten Konzentrationsdaten) (2)
    LOQ = Mittelwert der Blinddaten + 10*ð (Standardabweichung der Blinddaten) (3)

6. Durchführung eines papierbasierten Immunoassays mit klinischen Proben

  1. Sammeln und verarbeiten Sie 300 μl peripheres Blut von 30 Patienten am ersten Tag des Krankenhausaufenthalts in violette EDTA-Röhrchen nach guter klinischer Praxis.
  2. Das Blut bei 2.884 × g und 4 °C für 20 min zentrifugieren.
  3. Übertragen Sie die flüssige Komponente (Plasma) mit einer Pipette in ein sauberes Polypropylenröhrchen.
  4. Lagern Sie das Plasma sofort im Gefrierschrank bei -20 °C für die anschließende Analyse.
  5. Tragen Sie 20 μl Plasma auf den Probenbereich auf der Oberseite des Geräts auf. Fügen Sie dann 30 μl Waschpuffer hinzu (0,05 % v/v Tween 20 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung).
  6. Lassen Sie die Probe vollständig in das Gerät einziehen, was 20-30 Minuten dauern kann, bis die Ergebnisse vorliegen.
  7. Nehmen Sie Bilder des Geräts mit einer Digitalkamera oder einem Smartphone nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf.
  8. Analysieren Sie die Test- und Kontrollbereiche mit ImageJ und einer benutzerdefinierten mobilen Anwendung.

7. Quantifizierung mit mobiler Anwendung

HINWEIS: Die Intensität des papierbasierten Immunoassays wird in der mobilen Anwendung analysiert (Abbildung 2).

  1. Öffnen Sie die entwickelte mobile Anwendung auf dem Smartphone.
  2. Wählen Sie Kamera verwenden oder Aus Galerie hochladen , um die Datenquelle auszuwählen oder hochzuladen. Tun Sie dies durch Kameraaufnahmen oder durch Auswahl eines Bildes aus der Galerie des Geräts.
  3. Navigieren Sie zum Analysebereich und berühren Sie die Schaltfläche Analysieren auf dem Bildschirm.
  4. Warten Sie, bis die Anwendung die Daten analysiert und die Ergebnisse angezeigt hat.

Ergebnisse

Die Auswahl einer Herstellungsmethode ist entscheidend, um reproduzierbare Assay-Leistungen in papierbasierten Immunoassay-Geräten zu gewährleisten. In unserer Studie haben wir verschiedene Herstellungsverfahren und Materialien im Rahmen der Demonstration eines papierbasierten Immunoassays untersucht. Unsere gewählte Methode verwendet ein Wachsdrucksystem, um hydrophobe Barrieren in papierbasierten mikrofluidischen Geräten zu erzeugen. Dieser Ansatz zeichnet sich durch seine Einfachheit, Geschwindigkeit und konsistenten Ergebnisse aus. Bemerkenswert ist, dass es den Vorteil bietet, die Verwendung von Fotolackchemikalien zu vermeiden, die das Potenzial haben, die Proteinadsorption zu stören und die Hydrophobie von Zellulosepapier zu erhöhen. Darüber hinaus sorgt der Wachsdruck für konsistente Abmessungen der fluidischen Kanäle und trägt so zu einer wiederholbaren Assay-Leistung bei.

Nach der Bildung hydrophober Barrieren wurden die notwendigen Reagenzien für den Immunoassay auf die Zellulosepapieroberfläche aufgebracht. Mit elektrostatischer Adsorption unterstützte PLL die Immobilisierung von Biomolekülen, indem es sowohl mit der positiven Ladung der funktionellen Amingruppen als auch mit dem negativ geladenen Antikörper interagierte. Dieser Schritt erleichtert die Modifikation und Immobilisierung von Antikörpern und die Anwendung von Markierungs-Antikörper-Konjugaten während des Herstellungsprozesses. Wichtig ist, dass dieser Schritt parallel durchgeführt werden kann. Die Montage der Papierimmunoassay-Geräte (DEN-NS1-PAD, wie in Abbildung 1A gezeigt) wird abgeschlossen, indem das modifizierte Papier auf eine selbstklebende Kunststoff-Trägerkarte gestapelt und mit einer Kunststofffolie laminiert wird.

Das Hauptziel dieser Studie ist es, eine benutzerfreundliche Methode zu entwickeln, die ein Smartphone zur Messung der NS1-Konzentrationen verwendet. Dieser Ansatz könnte als Point-of-Care-Testgerät (POCT) sowohl im häuslichen als auch im klinischen Umfeld eingesetzt werden. Angesichts des breiten Bereichs der NS1-Konzentrationen im Patientenserum wurden auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Experimente einfache lineare Modelle verwendet. Für jede NS1-Konzentration wurde ein Datensatz mit drei Testgeräten erstellt. Die Fotos der Geräte wurden mit einem Smartphone unter Standardeinstellungen und optimalen Lichtverhältnissen aufgenommen, so dass keine dunkle Box erforderlich war. Die Testzone der PADs enthält den monoklonalen Dengue-NS1-Antikörper der Maus, während die Kontrollzone den Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper enthält. Bei einem Sandwich-Assay-Format entsprechen höhere NS1-Konzentrationen in Proben einer erhöhten Intensität der roten Farbe in der Testzone. Im Gegensatz dazu bleibt die Farbintensität in der Regelzone relativ konstant. Abbildung 1B zeigt unverarbeitete Smartphone-Bilder, die eine vorteilhafte visuelle Beobachtung ermöglichen, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind.

Mit einer speziellen mobilen Anwendung normalisierten wir die Intensitäten und berechneten einfache lineare Modelle für erhöhte NS1-Konzentrationen in Serumproben - die Koeffizientenkorrelation (r2), die aus der mobilen Anwendung erhalten wurde. Die Koeffizientenkorrelation (r2), die aus der mobilen Anwendung erhalten wurde, betrug 0,92 (Abbildung 3) und entsprach damit den Erwartungen. Dieser Smartphone-basierte Ansatz übertraf die Beobachtung mit bloßem Auge und verbesserte die Empfindlichkeit um 178 %. Zusätzlich wurden die Blindgrenze (LoB), die Nachweisgrenze (LoD) und die Bestimmungsgrenze (LoQ) für die normalisierten Intensitäten berechnet, wie in Tabelle 1 dargestellt.

Anhand von klinischen Beispielen aus der Praxis wurde die praktische Funktionalität von DEN-NS1-PADs im klinischen Umfeld demonstriert. Der papierbasierte Immunoassay erzeugte innerhalb von 20-30 Minuten qualitative Farbanzeigen, die eine visuelle Bestimmung negativer oder positiver Ergebnisse ermöglichten. Serumproben von Patienten mit Verdacht auf Dengue wurden dem Gerät unterzogen. Abbildung 4 veranschaulicht und vergleicht die Ergebnisse des Geräts und eines kommerziellen Schnelldiagnosetests (RDT). Tabelle 2 fasst die Ergebnisse der visuellen Messungen und des Smartphone-basierten Systems zusammen. Die kommerzielle RDT und das Gerät lieferten ähnliche Ergebnisse, mit sieben positiven und 23 negativen Ergebnissen beim visuellen Lesen. Im Gegensatz dazu meldete das Smartphone-basierte Lesesystem, das ausschließlich auf das Gerät angewendet wurde, neun positive und 21 negative Ergebnisse aus klinischen Proben.

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Abbildung 1: Bilder des entworfenen und hergestellten DEN-NS1-PAD. (A,B) Ein einzelner Kanal der wachsstrukturierten hydrophoben Barriere wird in drei Zuständen (C) vor und (D,E) nach dem Einbringen der Probenlösung in den vorgesehenen Bereich entworfen und dargestellt und zeigt die (D) negativen bzw. (E) positiven Ergebnisse. Die Probenlösung wird durch den Kanal geleitet (siehe Pfeil beschriftet) und interagiert mit den Komponenten an Schlüsselstellen - AuNPs-Ab im konjugierten Bereich, Anti-NS1-Antikörper im Testbereich (was auf ein positives Dengue-NS1-Ergebnis hinweist) und Anti-Maus-IgG im Kontrollbereich. Die Ergebnisse sind mit bloßem Auge gut erkennbar und können durch Bildverarbeitung mit einem Flachbettscanner oder einer Smartphone-Kamera quantifiziert werden. Abkürzung: AuNPs-Ab = Gold-Nanopartikel-Antikörper-Konjugat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Screenshots des Telefonbildschirms aus der mobilen App. (A) Benutzerbildschirm der Android-Anwendung, die auf dem Mobiltelefon ausgeführt wird, (B) Anzeige des Anwendungsbildschirms, (C) Hauptmenü der Anwendung, das die Benutzer auswählen können, um die Kamera zu verwenden oder ein Bild aus der Galerie hochzuladen, (D) Anzeige eines verwandten Bildes zum Testen, (E) Anzeige der zu analysierenden Countdown-Zeit, (F) Anzeige der Testergebnisse, einschließlich der Intensität der Test- und Kontrollzone, der Entscheidung über eine Infektion (positiv/negativ) und der Konzentration von NS1 in der Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Lineare Kalibrierkurve für die NS1-Detektion im Serum. Das Gerät wurde verwendet und Bilder durch Verarbeitung über eine Anwendung auf Basis von Smartphone-Daten interpretiert. Die Fehlerbalken zeigen ±1 Standardabweichung, n = 3. Abkürzungen: T = Testfläche; C = Kontrollbereich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Bild von DEN-NS1-PAD aus dem klinischen Probenassay. Serum (50 μl) wurde in einem papierbasierten Immunoassay verwendet. (A) Beispiel für ein negatives Ergebnis, (B) positive Ergebnisse, (C) Gesamtergebnisse und Vergleich von RDT und papierbasiertem Immunoassay. Abkürzungen: RDT = Rapid Diagnostic Test; Pos = positiv; Neg = negativ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

ParameterMit bloßem AugeMobile App
Limit des Leerzeichens (LoB)-43,15 ng ml-1
Nachweisgrenze (LoD)200 ng ml-1112,19 ng ml-1
Quantifizierungsgrenze (LoQ)-373,58 ng ml-1

Tabelle 1: LoB, LoD und LoQ aus ImageJ und mobiler Anwendung auf dem Datenkalibrierungsstandard NS1 im Serum. Abkürzungen: LoB = Grenze des Leerzeichens; LoD = Nachweisgrenze; LoQ = Bestimmungsgrenze.

Patient Nr.Bloße AugenSmartphone-AppBildJ
DREHTRANSFORMATORPapierbasierter Immunoassay
1----
2----
3----
4----
5----
6----
7----
8----
9++++
10--++
11----
12++++
13----
14----
15----
16++++
17++++
18----
19----
20----
21++++
22++++
23----
24++++
25----
26----
27----
28----
29----
30--++

Tabelle 2: Vergleich der Ergebnisse des visuellen Lesens und des Smartphone-basierten Lesesystems für Serumproben. (+) und (-) zeigen positive bzw. negative Interpretationen der Ergebnisse an.

Diskussion

Einer der wichtigsten Designparameter für ein Smartphone-basiertes Lesesystem ist die Fähigkeit, eine reproduzierbare bildgebende Verarbeitung von Proben zu ermöglichen. In dieser Studie wurden die Bilder der Einfachheit und Bequemlichkeit halber von drei verschiedenen Smartphone-Marken mit 12-13-MP-Kameras aufgenommen, ohne eine Bildbox oder Zubehör zu verwenden. Variable Bedingungen der Bildaufnahme, wie z. B. die Auflösung der Kamera, die Bildaufnahmezeit, die Lichtverhältnisse und die Umgebung, können die Farbintensität der Test- und Kontrollpunkte auf dem Gerät beeinflussen. Die Auswirkungen unterschiedlicher Bilderfassungszeiten auf die Beleuchtung und Trocknung von PAD auf die Signalintensitäten der Geräte wurden durch die Verwendung der normalisierten Signalintensitäten minimiert, die über die zu verschiedenen Zeiten aufgenommenen Bilder konsistentblieben 36. Die Subtraktion von Hintergrundsignalen entwickelte sich als Strategie zur Verbesserung der Genauigkeit von Farbintensitätsmessungen, wodurch der Einfluss der Lichtverhältnisse effektiv gemildert wurde. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Forschungen überein, die die Wirksamkeit von Basis- oder Hintergrundsubtraktionstechniken bei der Minimierung von Umweltauswirkungen hervorheben39,40.

Die anhaltende Debatte um die Überlegenheit der Verwendung einer Imagingbox oder einer zubehörfreien Methode hat Auswirkungen auf die Bildverarbeitung39,41. Eine Imaging-Box kann die Robustheit der Bildverarbeitungsergebnisse verbessern, indem sie Schwankungen der Bildgebungsbedingungen minimiert 41,42,43. In dieser Studie haben wir eine mobile Anwendung verwendet, die auf maschinellem Lernen in der Cloud für die Bildverarbeitung basiert. Dieser Ansatz nutzt maschinelles Lernen innerhalb einer Cloud-basierten Plattform, um Bilddaten automatisch zu klassifizieren, zu extrahieren und anzureichern. Die Anwendung identifizierte und verarbeitete effektiv den interessierenden Bereich innerhalb von Bildern, einschließlich der Hintergrund-, Test- und Kontrollzonen. Dieser Schritt war entscheidend für die Unterscheidung zwischen diesen Zonen38. Frühere Forschungen deuten darauf hin, dass die Bildverarbeitung mit maschinellem Lernen eine überlegene Klassifizierung zwischen den Ergebnissen für Kontroll- und Testproben liefert 43,44,45. In dieser Studie erzeugte die Verwendung der festen Position und der Hintergrundsubtraktion ein konsistentes Hintergrundsignal von den Cellulose-μPADs, was die Konsistenz und Klassifizierungsgenauigkeit der von der mobilen Anwendung bereitgestellten Messwerte verbesserte40,43.

Im Hinblick auf die konsistente Leistung bei der Demonstration eines papierbasierten Immunoassays spielt die Herstellungsmethode eine wichtige Rolle. In einer früheren Studie36 wurden mehrere Optimierungsbedingungen für das Design- und Herstellungsverfahren von DEN-NS1-PAD untersucht, wie z. B. Konzentrationen von PLL, Blockierungssubstanz und NS1-Antikörper. Das Gerät testete NS1 sowohl qualitativ als auch quantitativ erfolgreich in Puffer, Zellkultur und menschlichem Serum.

Matrixeffekte, die von Serumkomponenten ausgehen, können die Nachweisgrenze des Geräts beim Testen von Serumproben beeinträchtigen. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass der entwickelte Immunoassay NS1-Konzentrationen in Serumproben erfolgreich nachweisen konnte, was zu Ergebnissen führte, die mit denen der kommerziellen RDT vergleichbar waren (Tabelle 2). Die offensichtlichen Ergebnisse der visuellen Inspektion und der mobilen Anwendung (Abbildung 4) wurden beobachtet, was die Wirksamkeit des Assays für Serumtests unterstreicht. Die höhere Viskosität des Serums kann zwar die Analysezeiten beeinflussen, behindert aber nicht die Interpretation der Ergebnisse36. Die Verwendung einer mobilen Anwendung kann positivere Ergebnisse für Probenassays liefern, da die Verwendung einer mobilen Anwendung die Empfindlichkeit von Probentests erheblich verbessert46. Es ist erwähnenswert, dass weitere Vergleiche mit molekularen Assays wie RT-PCR 15,47,48 für Dengue NS1 erforderlich sind, um potenzielle falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse zu bestimmen.

Eine bemerkenswerte Einschränkung dieser Studie ergibt sich, wenn eine komplexere Probenmatrix wie Blut betrachtet wird. Die im Blut vorhandenen Komponenten könnten in der Tat die Nachweisgrenze des Geräts beeinträchtigen. In solchen Fällen stellt der Einsatz zusätzlicher absorbierender Pads zur Verbesserung der Absorption des Laufpuffers eine mögliche Lösung dar. Diese Modifikation kann die Blutgerinnung unterstützen, indem sie die hämostyptischen Eigenschaften von Cellulose nutzt, indem sie die Blutplättchen beeinflusst49. Ein anderer Ansatz besteht darin, 4% (w/v) Kochsalztropfen auf das Probenpad aufzutragen, um die Blutgerinnung zu verbessern. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Salze wie Calciumchlorid und Natriumchlorid die Gerinnung roter Blutkörperchen (RBC) induzieren 50,51. Na+ kann die Suspension von Erythrozyten im Blut destabilisieren, indem es die elektrische Doppelschicht auf der Erythrozytenoberfläche unterdrückt und die Ladungsabstoßung zwischen Erythrozyten reduziert. Darüber hinaus induziert eine hohe Salzkonzentration auch eine Blutaggregation52. Darüber hinaus unterdrückt die Gegenionenvalenzladung des Na+ die Dicke der geladenen Doppelschicht von Erythrozyten, was zur Aggregation der entleerten Erythrozyten führt. Die Zugabe von 4%iger (w/v) Kochsalzlösung (NaCl) erleichtert die Plasmatrennung auf Zellulosepapier51. Eine sorgfältige Optimierung der Kochsalzkonzentration ist jedoch erforderlich, um unerwünschte Wirkungen auf die Blutaggregation und die Goldnanopartikelaggregation zu vermeiden53,54.

Kommerzielle Wachsdrucker boten eine ideale Kombination aus Kosten und Einfachheit des Prototypings. Da diese Drucker 2016 eingestellt wurden, waren alternative Herstellungsmethoden wie Tintenstrahldruck55, Siebdruck56 und Fotolithographie57 erforderlich. Ein Bürotonerdrucker ist ein guter Kandidat für die Herstellung von μPAD. Das Polyesterharz im Toner erzeugt bei 200 °C für 60 min hydrophobe Muster mit verschiedenen Designs58.

In dieser Forschung wurde der vom Unternehmen spezifizierte Antikörper NS1 Serotyp zwei verwendet. Wir fanden jedoch heraus, dass dieser Antikörper auch mit allen Serotypen interagiert36,37. Die Sensitivitäten für den Nachweis von DENV-4 sind im Vergleich zu anderen Serotypen geringer (87,5%). Die Empfindlichkeit von DENV-1 und DENV-2 beträgt ca. 88,89 % und für DENV-3 100 %37. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Untersuchungen überein, die auch eine geringere Empfindlichkeit der RDT gegenüber DENV-4 im Vergleich zu anderen Serotypen berichteten59. Die Gesamtsensitivität des Geräts beträgt ~88,89% mit einer Spezifität von ca. 86,67%. Es ist bemerkenswert, dass die tatsächliche Empfindlichkeit von DEN-NS1-PAD die der kommerziellen RDT übertreffen kann. RDT zeigt jedoch einen positiven Vorhersagewert (PPV) von 84,62 % und eine Genauigkeit von 87,67 %. Bemerkenswert ist, dass das DEN-NS1-PAD in den ersten 5-6 Tagen beim Nachweis einer Dengue-Infektion besser abgeschnitten hat, während RDT nur in den ersten 5 Tagen wirksam ist37.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination eines tragbaren papierbasierten Immunoassays (DEN-NS1-PAD) mit einer Smartphone-Anwendung für die Dengue-NS1-Messung vielversprechend ist. Die mobile Anwendung verbessert die Empfindlichkeit und Effizienz bei der Quantifizierung von NS1 in Serumproben im Vergleich zur Beobachtung mit bloßem Auge erheblich. Zu den Vorteilen der mobilen Anwendung gehören eine reduzierte Analysezeit, Benutzerfreundlichkeit und Kompatibilität mit verschiedenen Smartphone-Geräten, Positionen und Lichtverhältnissen. Es sind jedoch weitere Verbesserungen erforderlich, um die Empfindlichkeit und Leistung zu verbessern. In der Zwischenzeit ist eine Modifikation des papierbasierten Immunoassays erforderlich, um seine Leistung beim Umgang mit Blutproben zu verbessern. Darüber hinaus sind umfassende Auswertungen des DEN-NS1-PAD erforderlich, um Dengue-Fieber anhand einer größeren Anzahl von Primärinfektions-Serotypen und ausgewählten Proben von verschiedenen Patienten (Kindern und Erwachsenen) zu erkennen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

M.H.P. dankt dem Stipendienforschungsfonds der Universitas Islam Indonesia (UII). Die Autoren danken Herrn Nutchanon Ninyawee für sein wertvolles Fachwissen und seine Unterstützung während der Entwicklung der mobilen Anwendung und seine Beiträge zum Manuskript. Darüber hinaus würdigen die Autorinnen und Autoren die finanzielle Unterstützung durch Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (Projekt-Nr. FRB660073/0164) im Rahmen des Programms Smart Healthcare der King Mongkut's University of Technology Thonburi.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materials0,1
M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2)
BBS mit 0,1 % Tween 20, 10 % Saccharose und 1 % Kasein & nbsp;  der konjugierte Behandlungs- und Blockierungspuffer
Borat gepufferte Kochsalzlösung (BBS) (25 mM Natriumborat und 150 mM Natriumchlorid bei pH 8,2), ergänzt mit 1 % BSA der Waschpuffer während des Konjugationsprozesses AuNPs mit dem Antikörper
BorsäureMerck10043-35-3
Rinderserumalbuminfraktion V (BSA)    PAA Lab GmbH (Deutschland)K41-001 
CaseinMerck9005-46-3
Chromatographie-Papier Güteklasse 2 GE Healthcare3002-911 
Klarlackfolie3M (Schreibwarengeschäfte)
DinatriumhydrogenphosphatMerck7558-79-4
DoppelbandseiteSchreibwarengeschäfte
Ziege Anti-Maus IgG Antikörper MyBiosource (USA)MBS435013
Gold-Nanopartikel (40 nm)   Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Polyklonaler IgG-Antikörper  MerckAG711-M
Monoklonaler Dengue-NS1-Antikörper für die MausMyBiosource (USA)MBS834415
monoklonaler Dengue-NS1-Antikörper für die MausMyBiosource (USA)MBS834236
NS1 Serotyp 2 AntigeneMyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X mit 0,1% Tween 20 wurde alsT-Elutionspuffer
Kunststoff-Trägerkarte 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-Lysin (PLL)Sigma AldrichP4832
KaliumchloridMerck104936
KaliummonophosphatMerck104877
NatriumchloridMerck7647-14-5
Natriumtetraborat Sigma Aldrich1303-96-4
SaccharoseMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 Multimode ReaderBioTek
HandysHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
FotoscannerEpson Perfection V30
OvenMemmert
Wachsdrucker Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection DokumentationGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software
verwendet

Referenzen

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Schlagwörter

Dengue NS1 Nachweiskolorimetrischer Nachweismikrofluidisches Papierger tGoldnanopartikel KonjugatBlutprobenanalyseLateral Flow AssayBildanalyse

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