Research Article
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Der 3D-Druck im Mikrometermaßstab ermöglicht das schnelle Prototyping von polymeren Bauelementen für neuronale Zellkulturen. Als Proof-of-Principle wurden strukturelle Verbindungen zwischen Neuronen durch die Schaffung von Barrieren und Kanälen eingeschränkt, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen, während die funktionellen Konsequenzen einer solchen Manipulation durch extrazelluläre Elektrophysiologie beobachtet wurden.
Neuronale Kulturen sind seit mehreren Jahrzehnten ein experimentelles Referenzmodell. Es fehlen jedoch die 3D-Zellanordnung, räumliche Einschränkungen des Neuritenwachstums und eine realistische synaptische Konnektivität. Letzteres schränkt die Untersuchung von Struktur und Funktion im Kontext der Kompartimentierung ein und verringert die Bedeutung von Kulturen in den Neurowissenschaften. Die Annäherung an die strukturierte anatomische Anordnung der synaptischen Konnektivität ex vivo ist nicht trivial, obwohl sie für die Entstehung von Rhythmen, synaptischer Plastizität und letztendlich für die Pathophysiologie des Gehirns von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird die Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) als 3D-Drucktechnik eingesetzt, die die schnelle Herstellung von polymeren Zellkulturgeräten unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) im Mikrometermaßstab ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen Replik-Formtechniken auf der Grundlage der Mikrophotolitographie ermöglicht der 2PP-Mikrodruck eine schnelle und kostengünstige Bearbeitung von Prototypen. Dieses Protokoll veranschaulicht das Design und die Herstellung von PDMS-basierten mikrofluidischen Geräten, die auf die Kultivierung modularer neuronaler Netze abzielen. Als Proof-of-Principle wird ein Zweikammergerät vorgestellt, um die Konnektivität physisch einzuschränken. Insbesondere wird ein asymmetrischer axonaler Auswuchs während der ex vivo-Entwicklung bevorzugt und darf von einer Kammer zur anderen geleitet werden. Um die funktionellen Konsequenzen unidirektionaler synaptischer Wechselwirkungen zu untersuchen, werden kommerzielle Mikroelektroden-Arrays ausgewählt, um die bioelektrische Aktivität miteinander verbundener neuronaler Module zu überwachen. Hier werden Methoden zur 1) Herstellung von Formen mit Mikrometergenauigkeit und 2) zur Durchführung extrazellulärer In-vitro-Multisite-Aufzeichnungen in kortikalen neuronalen Kulturen der Ratte veranschaulicht. Durch sinkende Kosten und die zukünftige breite Zugänglichkeit des 2PP-3D-Drucks wird diese Methode in Forschungslabors weltweit immer relevanter. Insbesondere in der Neurotechnologie und der neuronalen Datenaufzeichnung mit hohem Durchsatz wird die Leichtigkeit und Schnelligkeit des Prototypings vereinfachter In-vitro-Modelle die experimentelle Kontrolle und das theoretische Verständnis von in vivo großräumigen neuronalen Systemen verbessern.
Die Untersuchung der neuronalen Aktivität in sich verhaltenden Organismen bringt mehrere Herausforderungen mit sich. Zum Beispiel ist der physische Zugang zum Hirngewebe durch die Notwendigkeit begrenzt, seine Integrität zu erhalten, so dass die oberflächlichen Regionen des Gehirns leichter berücksichtigt werden können. Die Isolierung spezifischer Ziele innerhalb des intakten Gewebes ist oft eine entmutigende Aufgabe und manchmal unmöglich. Obwohl dissoziierte homogene neuronale Kulturen einen bequemen Zugang zu den molekularen, biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften einzelner (sub)zellulärer Komponenten eines neuronalen Schaltkreises bieten, geht eine realistische Konnektivität und anatomische Organisation des intakten Gehirns verloren. Diese grundlegenden Einschränkungen inspirierten die Forschungsbemühungen, einen Mittelweg zu finden, bei dem In-vivo-Komplexität vermieden wird, während die Struktur in vitro konstruiert werden kann, was bei Bedarf erforderlich ist 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Insbesondere modulare neuronale Kulturen waren in den letzten Jahrzehnten Gegenstand umfangreicher Forschung, die darauf abzielte, Schlüsselfragen der Gehirnphysiologie zu beantworten, wie im Folgenden beschrieben.
Organisation: In-vivo-Studien zeigen, dass das Gehirn anatomisch in Schichten mit präzisen Zelltypen und Anordnungen von Projektionen strukturiert ist. Funktionelle Assays zeigten die Organisation der neuronalen Netzwerke in Knotenanordnungen und Modulen mit präzisen Konnektivitätsschemata10,11. Die Rolle von Konnektivitäts- und Mikroschaltungsmotiven kann jedoch aufgrund der schieren Anzahl der beteiligten Synapsen sowie der miteinander verwobenen Effekte von entwicklungs- und aktivitätsabhängiger Plastizität in vivo nicht ausreichend untersucht werden.
Signalübertragung: In In-vivo - oder zufälligen In-vitro-Kulturen ist es schwierig, die Signalübertragung zu beurteilen. Die Untersuchung der axonalen Leitung und des Aktionspotentials entlang seiner Länge erfordert die Steuerung des Neuritenwachstums durch Oberflächenfunktionalisierung oder chemische Strukturierung, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei extrazellulären Auslesungen der elektrischen Aktivität liefert12.
Translationale Relevanz: Um die ausschließliche Rolle von prä- und postsynaptischen Elementen bei pathologischen Zuständen zu entschlüsseln, muss man individuell auf diese Elemente zugreifen. Modulare Kulturen mit eingeschränkter Konnektivität, die die prä- und postsynaptischen Elemente effektiv trennen, sind zu diesem Zweck unverzichtbare Werkzeuge13.
Es gibt mehrere Methoden, um eine Form von Struktur in der neuronalen Kultur zu erhalten. Sie können grob als chemische und physikalische Oberflächenmanipulation kategorisiert werden9. Die erstgenannten Methoden14,15 beruhen auf der Neigung neuronaler Zellen, sich an bestimmte (bio)chemische Verbindungen zu binden. Dazu müssen Klebstoffe oder attraktive Moleküle mit Präzision im Mikromaßstab und nach einem detaillierten Muster auf eine Oberfläche aufgetragen werden. Während dies eine teilweise Abdeckung der Zelloberfläche nach dem gewünschten Muster ermöglicht, sind chemische Methoden von Natur aus begrenzt und haben eine relativ geringe Erfolgsrate bei der Steuerung des Neuritenwachstums16. Die vollständige Kontrolle über die Axondirektionalität erfordert die Etablierung eines räumlichen Gradienten von Ad-hoc-Chemikalien, um die axonale Führung zu formen17. Letztere Methoden beinhalten die physikalische Oberflächenmanipulation und werden häufiger verwendet, um die neuronalen Netzwerke in vitro zu strukturieren. Neuronale Zellen sind an den gewünschten Stellen durch geometrische Einschlüsse wie mikroskopische Kammern, Wände, Kanäle usw. physikalisch eingeschränkt und formen ein biokompatibles Polymer wie Polydimethylsiloxan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20, das ausgehärtet und zu einem mikrofluidischen Gerät verfestigt wird. Das De-facto-Verfahren für die mikrofluidische Herstellung von PDMS ist die weiche Photolithographie21, bei der eine zweidimensionale Maske im Mikromaßstab strukturiert und verwendet wird, um ein siliziumbasiertes Material unter UV-Belichtung selektiv zu ätzen. Kurz gesagt, ein UV-härtendes Harz (d. h. Fotolack) wird durch Schleuderbeschichtung auf einen Siliziumwafer aufgetragen und erreicht eine bestimmte Höhe, die durch seine Viskosität und Schleudergeschwindigkeit bestimmt wird. Dann wird die gemusterte Maske über dem Fotolack positioniert und UV-Licht ausgesetzt. Transparente Bereiche innerhalb der Maske, die den interessierenden Regionen entsprechen, lassen UV-Licht eine lokalisierte Vernetzung der Fotolackmoleküle induzieren. Die Bereiche des unbelichteten Fotolacks werden mit einem Lösungsmittel abgewaschen, wodurch sich eine Urform bildet. Damit wird immer wieder ein Elastomer der Wahl (z.B. PDMS) eingebrannt, das dann mit den gewünschten Geometrien in beliebig viele Repliken graviert wird. Ein solches Herstellungsverfahren ist das gebräuchlichste Verfahren zur Herstellung mikrofluidischer Geräte22. Vielleicht sind die Haupteinschränkungen der weichen Photolithographie die Voraussetzung einer nennenswerten Kapitalinvestition und die Unkenntnis biologischer Labore mit den erforderlichen Techniken und Fachkenntnissen. Die Vorbereitung der Maske und die Schritte der weichen Photolithographie, die zum Entwerfen komplexer Geometrien mit mehreren Höhen und hohem Aspektverhältnis erforderlich sind, sind nicht trivial23 und erfordern oft Outsourcing. Auch wenn alternative und kostengünstige Methoden vorgeschlagen wurden, erfüllen sie nicht immer die hohen Präzisionsanforderungen des biologischen Prototyping24.
Hier wird ein alternatives Herstellungsverfahren vorgestellt, das auf Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) und additiver Fertigung basiert. Es ist unkompliziert und erfordert nicht per se fortgeschrittenes Fachwissen in der Mikrofabrikation und Mikrophotolitographie. Das Forschungsfeld der 2PP-Mikrofertigung entstand in den späten 90erJahren 25 und hat seitdem ein exponentielles Wachstum erlebt26. Mehr über die Grundprinzipien dieser Technik finden Sie an anderer Stelle26. Kurz gesagt, durch die Fokussierung des Anregungslichtimpulses im dreidimensionalen Raum nutzt 2PP die nichtlineare Abhängigkeit der Multiphotonenabsorption von der Intensität. Dies ermöglicht die Fähigkeit einer begrenzten Absorption und gewährleistet eine präzise und selektive Anregung in sehr lokalisierten Regionen. Im Wesentlichen wird ein Negativton-Fotolack, ein Material mit verminderter Löslichkeit bei Lichteinwirkung, einem fokussierten Strahl von Femtosekunden-Laserpulsen bei niedrigem Tastverhältnis27 ausgesetzt. Dies ermöglicht Impulse mit hoher Intensität bei niedrigen Durchschnittsleistungen und ermöglicht eine Polymerisation, ohne das Material zu schädigen. Die Wechselwirkung von photoinduzierten Radikalmonomeren führt zu radikalischen Oligomeren, die eine Polymerisation initiieren, die sich über den gesamten Fotolack bis zu einem bestimmten Volumen, d. h. Voxel, erstreckt, dessen Größe von der Intensität und Dauer der Laserpulse abhängt28.
In dieser Arbeit werden zwei Komponenten vorgestellt: A) das Design und die schnelle Herstellung einer 3D-gedruckten Form, die viele Male zur Herstellung von polymeren neuronalen Einweg-Zellkulturgeräten wiederverwendbar ist (Abbildung 1), und B) ihre mechanische Kopplung an die Oberfläche von planaren neuronalen Zellkultursubstraten oder sogar von substratintegrierten Mikroelektrodenarrays, die in der Lage sind, bioelektrische Signale an mehreren Standorten aufzuzeichnen.
Das computergestützte Design eines mechanischen 3D-Modells wird hier sehr kurz beschrieben und von den Schritten begleitet, die zu einer 3D-gedruckten Form und zur Herstellung von PDMS-Geräten führen.
Eine Vielzahl von computergestützten Design-Softwareanwendungen kann verwendet werden, um das Start-3D-Objektmodell zu generieren und eine STL-Datei zur Steuerung des 2PP-Druckprozesses zu erstellen. Innerhalb der Materialtabelle sind die erste und die letzte aufgeführte Anwendung kostenlos oder mit einer freien Lizenz versehen. Die Konstruktion eines 3D-Modells erfordert immer die Erstellung einer 2D-Skizze, die dann in nachfolgenden Modellierungsschritten extrudiert wird. Um dieses Konzept zu demonstrieren, wird im Protokollabschnitt ein generischer 3D-CAD-Software-Designprozess hervorgehoben, der zu einer Struktur aus überlappenden Würfeln führt. Für umfassendere Informationen stehen eine Reihe von Online-Tutorials und kostenlosen Schulungsressourcen zur Verfügung, wie in der Materialtabelle angegeben.
Die resultierende STL-Datei wird dann in eine Reihe von Befehlen übersetzt, die vom 3D-Drucker ausgeführt werden (d.h. Slicing-Verfahren). Für den jeweils verwendeten 2PP 3D-Drucker wird die Software DeScribe verwendet, um die STL-Datei zu importieren und in das proprietäre General Writing Language (GWL) Format zu konvertieren. Der Erfolg des 2PP-Druckverfahrens hängt von verschiedenen Parametern ab, insbesondere von der Laserleistung und der Scangeschwindigkeit, den Näh- und Schraffur-Schneide-Abständen. Die Wahl dieser Parameter sowie die Auswahl von Objektiv und Fotolack hängen von den kleinsten Merkmalen des Designs sowie der beabsichtigten Anwendung ab. Daher wird die Parameteroptimierung unerlässlich, um den Anforderungen verschiedener Designszenarien und Anwendungsfälle gerecht zu werden. Für diese Arbeit wurde die empfohlene Rezeptur IP-S 25x ITO Shell (3D MF) als Konfiguration für die Druckparameter berücksichtigt. Letztendlich wird ein mechanisch stabiles gedrucktes Teil mit der erforderlichen Auflösung gedruckt und gleichzeitig die 3D-Druckzeit minimiert.
Das Formdesign und die zugehörige STL-Datei, die in dieser Arbeit demonstriert werden, umfassen einen quadratischen Rahmen, um den Raum einer Zellkultur in zwei Kammern zu unterteilen: einen äußeren Bereich (d. h. später als Quelle bezeichnet) und einen inneren Bereich (d. h. später als Ziel bezeichnet). Diese beiden Kompartimente sind durch Sätze von Mikrokanälen verbunden, die jeweils durch scharfwinklige Grenzen gekennzeichnet sind, die speziell das Wachstum von Neuriten vom Ziel zur Quelle behindern sollen, aber nicht umgekehrt, und als solche eine gerichtete synaptische Konnektivität zwischen Neuronen fördern, die auf den beiden Bereichen wachsen.
Frühere Studien verwendeten verschiedene Geometrien von Mikrokanälen, um das gerichtete Wachstum von Neuriten zu fördern. Beispiele sind dreieckige Formen18, Kanal-Stachelstrukturen19 und sich verjüngende Kanäle20. Hier wird ein Design mit scharfen Winkelbarrieren über die Grenzen des Mikrokanals verwendet, das sich auch durch asymmetrische Eingänge auszeichnet. Diese Mikrokanäle dienen dazu, die Kontinuität zwischen einem geschlossenen Innenraum, dem Target-Kompartiment, und dem externen Bereich, dem Source-Kompartiment, herzustellen. Die Trichterform des anfänglichen Teils der Mikrokanäle von der Quellenseite aus soll die Bildung von axonalen Bündeln und deren Wachstum entlang des kürzesten, d.h. geraden Weges, der die Quelle mit dem Ziel verbindet, fördern. Der dreieckige Raum, der durch scharfe Winkel realisiert wird, hat ein größeres Volumen auf der Zielseite, um die Wegfindung von Neuriten effektiv zu verzögern und gleichzeitig das schnelle Schießen von Bündeln aus der Quelle und die Besetzung des verfügbaren Raums zu begünstigen. Die Wahl von 540 μm für die Länge der Mikrokanäle filtert den im Allgemeinen kürzeren dendritischen Auswuchs effektivheraus 39. Darüber hinaus verhindert ihre Höhe von 5 μm, dass Zellspalte durch die Mikrokanäle eindringen. Insgesamt hat sich gezeigt, dass diese Konfiguration die unidirektionale Konnektivität zwischen dem äußeren Quell- und dem inneren Zielmodul fördert, und sie wird hier als Proof-of-Principle unter den vielen alternativen Optionen vorgestellt.
Während die PDMS-Bauelemente, die durch die 2PP-Form hergestellt werden, an der Oberfläche gängiger Zellkultursubstrate wie Glasdeckgläser oder Petrischalen befestigt werden können, wurden in dieser Arbeit kommerziell erhältliche substratintegrierte Mikroelektrodenarrays verwendet. Es wurden keine Anstrengungen unternommen, um das 3D-Design für das Layout des Mikroelektrodenarrays zu optimieren, und die mechanische Kopplung wurde unter stereomikroskopischer Anleitung durchgeführt, um das Gerät nur über das Array zu positionieren, wobei auf beiden Seiten, der Quelle und dem Target, eine Mikroelektrode freigelegt wurde. Dies ermöglicht die vorläufige Bewertung der funktionellen Konsequenzen der eingeschränkten Konnektivität in neuronalen Zellkulturen.
Alle Verfahren im Zusammenhang mit dem Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den europäischen und italienischen Rechtsvorschriften durchgeführt (Richtlinie des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 [2010/63/EU]; Italienische Regierungsverordnung vom 4. März 2014, Nr. 26), wurden vom institutionellen OpBA (Komitee für Tierpflege) der Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati ausdrücklich genehmigt und vom italienischen Gesundheitsministerium offiziell genehmigt (Auth. Nr. 22DAB. N.UVD). Diese führten zur Verfügbarkeit von nicht-empfindungsfähigem Material aus dem explantierten Rattenhirngewebe, das für die experimentelle Validierung der in dieser Arbeit vorgestellten Methode verwendet werden konnte.
1. 3D Formenbau durch Zwei-Photonen-Polymerisation
2. Herstellung von PDMS-Geräten aus den Form- und Zellkultursubstraten
3. Neuronale Zellkultur und Elektrophysiologie
Hier wird über die Herstellung eines polymeren (neuronalen) Zellkulturgeräts mit 2 Kompartimenten berichtet, das die Verwendung des 2PP-3D-Drucks für das Rapid Prototyping von PDMS-Geräten veranschaulicht. Konkret wird ein Gerät für modulare neuronale Netzwerke mit unidirektionaler synaptischer Konnektivität hergestellt und seine funktionelle Charakterisierung in Bezug auf die extrazelluläre Elektrophysiologie an mehreren Standorten dargestellt. Kurz gesagt, eine Form im Mikrometermaßstab wurde mittels direktem Laserschreiben mit einem handelsüblichen 3D-Drucker realisiert. Insbesondere liefert der Drucker eine Leistung von 50 mW durch Laserpulse mit einer Mittenwellenlänge von 780 nm und einer Dauer von 80 bis 100 fs. Während des Herstellungsprozesses wird der Laserstrahl durch das Objektiv (25x, NA=0,8) des Druckers auf den Negativton-Fotolack (IP-S) fokussiert, um das Druckvolumen mit dem Galvo-Scanner für die x- und y-Achse und dem Piezotisch für die z-Achse zu scannen. Das Druckvolumen wurde entsprechend in Blöcke von 200 mm x 200 mm x 265 mm aufgeteilt, um eine Form mit einer Gesamtgröße von 6500 mm x 6500 mm x 545 mm und einem Nennvolumen von 12.423 ml zu realisieren. Abbildung 2A zeigt eine 2D-Skizze der Form, die ihre Abmessungen und die Größe der Merkmale hervorhebt, während Abbildung 2B eine Nahaufnahme des fertigen Geräts zeigt, das auf einem MEA montiert ist. Die wie im vorherigen Abschnitt beschriebenen Formen waren langlebig und konnten mehr als 50 Mal zur Herstellung von PDMS-Geräten wiederverwendet werden.
Die gedruckte Form wurde zum Gießen des PDMS-Geräts verwendet, das dann auf dem inneren Bereich von integrierten Glassubstrat-Arrays von Mikroelektrodenarrays (MEA) montiert wurde, um für extrazelluläre Aufzeichnungen neuronaler elektrischer Aktivität an mehreren Standorten und als Proof-of-Principle verwendet zu werden. Kommerzielle substratintegrierte MEAs wurden verwendet, um die Aktivität modularer Kulturen als Reaktion auf räumlich lokalisierte elektrische Reize zu überwachen, die extrazellulär von einer Untergruppe von Mikroeelectroden in jedem Kulturkompartiment abgegeben wurden. Jede MEA enthält 120 Titannitrat (TiN)-Mikroelektroden mit einem Durchmesser von 30 μm und einem Elektrodenabstand von 100 μm. Abbildung 2C-D zeigt die Platzierung des PDMS-Geräts auf der Oberseite der MEA. Die geometrischen Merkmale der einzelnen Mikrokanäle des Geräts führen zusammen mit dem in Abbildung 2C gezeigten Gesamtfootprint der Kammer zu einer Kompartimentierung der kultivierten Neuronen. Diese können anhand des Fachs unterschieden werden, zu dem sie gehören, im äußeren Bereich (Source) des Geräts oder im inneren Bereich (Target) des Geräts. Die bevorzugte axonale Führung, die von der Quelle zum Ziel beschränkt ist, wird durch die scharfwinkligen Kanten der Mikrokanäle bestimmt. Abbildung 2D zeigt die Platzierung des Polymergeräts auf dem MEA und den relativen Abdeckungsbereich der Aufzeichnungselektroden, die sich in den Quell- oder Zielkammern befinden. Beachten Sie, dass eine genaue Ausrichtung der Innenseite der Mikrokanäle des Geräts auf eine oder mehrere Reihen von MEA-Mikroelektroden für unsere Fallstudie weder erforderlich noch verfolgt wurde.
Repräsentative Beweise für das asymmetrische Neuritenwachstum sind in Abbildung 3 während der Ex-vivo-Entwicklung zu sehen, die fluoreszenzmarkierte Neuriten in der Live-Bildgebung zeigt, 6 Tage (Abbildung 3A) und 2 Tage nach der Zellbeschichtung (Abbildung 3B-D). Während die Neuriten auf der Zielseite des Geräts auf scharfe Winkelbarrieren stießen, die ihren Fortschritt durch den Raum behinderten, wuchsen die Neuriten, die von der Quellseite stammten, ununterbrochen und kreuzten die Kanäle. Diese Asymmetrie begünstigt eine unidirektionale axonale Verbindung zwischen Neuronen in den beiden Kompartimenten, die von der Quelle zum Ziel projiziert werden, wie es im Design ausdrücklich beabsichtigt ist. Dieses Ergebnis wird durch eine (funktionelle) elektrophysiologische Bewertung elektrischer Reaktionen unterstützt, die durch Stimuli hervorgerufen werden, die abwechselnd in jedem der beiden Kompartimente abgegeben werden.
Nach 3-4 Wochen in vitro, als die neuronalen Netzwerke ihre volle Reife erreichten29,30, konnte die funktionelle Konnektivität zwischen den beiden Kompartimenten untersucht werden, indem kurze elektrische Reize abgegeben und die neuronalen Reaktionen, die sie hervorriefen, überwachtwurden 31. Biphasische elektrische Impulse mit einer Amplitude von 800 mV wurden dann abwechselnd nur an die Quelle oder nur an die Zielpopulationen (N Wiederholungen = 150, N modulare Kulturen = 6) appliziert, die von 3 nebeneinander liegenden Paaren planarer Mikroelektroden in einer bipolaren Konfiguration und in einer verschachtelten Weise geliefert wurden. Daher könnten sich die 3 Elektrodenpaare innerhalb des Quellbereichs der MEA oder innerhalb des Zielbereichs der MEA befinden. Die von jedem Stimulus hervorgerufenen elektrischen Reaktionen konnten dann nach einer Ausbreitungsverzögerung von allen MEA-Mikroelektroden detektiert werden. Die Aufnahmen wurden mit einer Abtastrate von 25 kHz/Kanal durchgeführt, und die resultierenden extrazellulären elektrischen Rohsignale wurden mit einer Analog-Digital-Wandlungsauflösung von 16 Bit digitalisiert. Ein schwellenwertüberschreitender Peak-Detektionsalgorithmus32 wurde offline verwendet, um den Zeitpunkt des Auftretens extrazellulärer Aktionspotentiale zu detektieren, ohne eine Spike-Sortierung durchzuführen. Abbildung 4A-B zeigt deutlich eine starke Asymmetrie der evozierten Reaktionen, die je nach Ort der Stimulusabgabe 150 Mal wiederholt werden, was auf einen signifikanten funktionellen Einfluss der geometrischen Einschränkungen auf die bevorzugte Richtungsabhängigkeit der Konnektivität hindeutet. Tatsächlich stieg bei der Stimulation der Quellseite die Feuerrate der neuronalen Population der Quelle - geschätzt durch Berechnung des Peristimulus-Spike-Times-Histogramms - wie erwartet an, was einen vollständigen Netzwerk-Burst von Aktionspotentialenerzeugte 33,31,34, und es folgte, nach einer Verzögerung, ein Anstieg der Feuerrate der Zielpopulation. Da die Stimulation jedoch innerhalb der Zielpopulation erfolgte, stieg nur die Feuerrate der Zielpopulation an, während die Quellpopulation weitgehend stumm blieb. Abbildung 4C-D wiederholt das gleiche Stimulus/Reaktions-Paradigma in einer Kontrollkultur, ohne dass ein polymeres Gerät vorhanden ist (d. h. eine unstrukturierte neuronale Kultur), die extrazellulären Stimuli wurden ebenfalls über 4 Wiederholungen abgegeben. Bei solchen Kontrollbedingungen trat keine Asymmetrie in den Reaktionen auf, die durch einen der beiden Stimuli hervorgerufen wurden. Während die Untergruppe der MEA-Mikroelektroden, die zur Abgabe der Reize verwendet wurden, mit der in modularen Netzwerken übereinstimmte, führte der Ort der Stimulusabgabe zu einer ähnlich evozierten Reaktion der gesamten Bevölkerung. Dies bestätigt, dass das PDMS-Gerät eine unidirektionale synaptische Konnektivität über die beiden Kompartimente hinweg bevorzugte. Insgesamt deuten asymmetrische Reaktionen, die in modularen Kulturen (N = 6) hervorgerufen werden, und symmetrische Reaktionen, die in Kontrollkulturen hervorgerufen werden (N = 4), stark auf eine eingeschränkte anatomische Konnektivität eines kompartimentierten In-vitro-Systems hin. Die elektrophysiologischen Daten und die Skripte, die zur Generierung von Abbildung 4 verwendet wurden, werden über Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990) zur Verfügung gestellt.
Abbildung 1: Skizze der Herstellung von 2PP-Mikroformen und PDMS-Replika-Spritzguss. (A) Ein 3D-Modell wird in CAD entworfen und im STL-Format (Standard Tessellation Language) exportiert , (B) wird sein 2-Photonen-3D-Druck durch laserinduzierte Polymerisation in einem Tropfen Harz (IP-S) angewiesen. (C) Die resultierende Struktur wird als Form für die wiederholte Herstellung von PDMS-Repliken verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel für ein internes Rapid Prototyping eines polymeren (neuronalen) Zellkultur-PDMS-Geräts. (A) In weniger als 24 Stunden ermöglicht die additive Fertigung im Mikromaßstab den Übergang von einem CAD-Modell zu einem 3D-gedruckten Master, das sofort und wiederholt als Nachbildung einer Form mit biokompatiblen Elastomeren wie PDMS verwendet werden kann. (B-C) Die resultierenden PDMS-Geräte sind mit einem planaren neuronalen Zellkultursubstrat gekoppelt, das hier durch eine Anordnung von Mikroelektroden dargestellt wird. Für das spezifische Probendesign in (A) werden zwei Kammern definiert: eine wird als Quelle bezeichnet und mit S angezeigt, und die andere wird als Ziel bezeichnet und durch T angezeigt. (D) Neuronen, die in jeder Kammer plattiert sind, können ihre Neuriten nur durch eine Reihe von Mikrokanälen wachsen lassen. Bei entsprechender Ausrichtung unter stereomikroskopischer Anleitung in (C) bleiben zwei Sätze substratintegrierter Mikroelektroden frei, so dass die bioelektrische Aktivität benachbarter Neuronen, die sich in beiden Kompartimenten befinden, stimuliert und aufgezeichnet werden kann. Beachten Sie hierbei, dass das Ausrichten von Mikroelektroden innerhalb einzelner Mikrokanäle nicht die Priorität dieses Proof-of-Principle war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Live-Bildgebung von zellundurchlässigen fluoreszierenden Reportermolekülen, identifiziert Neuriten, die von Neuronen verlängert wurden, wenige Tage nach der Zellbeschichtung. (A-D) Repräsentative konfokale Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von modularen neuronalen Kulturen des Geräts, die aus Abbildung 1 und Abbildung 2 hergestellt wurden (N = 4, 128 einzelne Mikrokanäle), wurden 2 und 6 Tage nach der Zellbeschichtung aufgenommen. (B-D) Die 40-fache Vergrößerung und eine invertierte Graustufe der Schliffbilder sorgen für eine erhöhte Sichtbarkeit. Die Enden der Mikrokanäle aus dem Source- und dem Target-Kompartiment werden mit S bzw. T bezeichnet. (A) zeigt das Wide-Scan-Bild der Kultur, in dem Source (d. h. der innere quadratische Bereich) und Target (d. h. der äußere Bereich) 6 Tage nach dem Plattieren voller Zellen sind. (B) und (C) zeigen zum früheren Zeitpunkt von 2 Tagen nach der Beschichtung das Wachstum von Neuriten an der Quell- bzw. an der Zielseite der Mikrokanäle. Die kleinen schwarzen Dreiecke zeigen repräsentative Beispiele für mutmaßliche Axonbündel-Terminals, die anscheinend nur von der Quelle stammen. Die Grenzen der pfeilförmigen Mikrokanäle zeigen auf die Verlängerung der Neuriten entlang der Kante (B), wo ihr Durchgang ununterbrochen und zum Ziel geführt wird. In der entgegengesetzten Richtung und neben dem Zielende eines Mikrokanals (C) werden Neuriten, die vom Ziel ausgehen und zur Quellseite vordringen, an den scharfen Ecken eingeschlossen. (D) zeigt weiter die Details des Neuritenauswuchses in einem Mikrokanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Funktionelle Charakterisierung neuronaler elektrischer Reaktionen mit und ohne PDMS-Gerät. MEAs wurden als Zellkultivierungssubstrate verwendet und verwendet, um die netzwerkweiten Spike-Reaktionen zu messen, die durch einen sehr kurzen (d. h. 200 μs, 0,8 V) biphasischen elektrischen Stimulationsimpuls in einer bipolaren Konfiguration hervorgerufen wurden. Mit dem PDMS-Gerät in Abbildung 2 unterscheiden sich die neuronalen Spike-Reaktionen, die von der Quelle (rot) und vom Ziel (blau) aufgezeichnet werden, je nachdem, wo der Stimulus abgegeben wird. Mutmaßliche axonale, synaptische und Integrationsverzögerungen werden in (A), aber nicht in (B) deutlich, was darauf hindeutet, dass eine bevorzugte synaptische Konnektivität (d.h. von der Quelle zum Ziel) existiert. (C-D) Unter Kontrollbedingungen (d. h. ohne PDMS-Gerät) hängen evozierte Reaktionen, die an zwei verschiedenen Sätzen von MEA-Mikroelektroden detektiert werden, nicht vom Ort der Stimulusabgabe ab. Die blasse Schattierung, die die Linien in den Diagrammen umhüllt, bezeichnet den momentanen Standardfehler des Mittelwerts (N Stimuli = 150). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name der Lösung | Zusammensetzung |
| Polyethylenimin (PEI) 0,1 % | 1 ml PEI-Stammlösung, 9 ml steriles deionisiertes (DI) Wasser. |
| Nährmedium (50 ml) | Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt durch 20 μM Glukose, 50 μg/ml Gentamicin, 50 μM L-Glutamin und 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum. |
| Seziermedium (1000 ml) | Hanks′ Ausgewogene Salze 9,52 g, Natriumbicarbonat 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-Glukose 6 g, Kynurensäure (Endkonzentration 200 μM), D-AP5 (Endkonzentration 25 μM), Gentamicin 250 μl, Rinderserumalbumin 300 mg, Magnesiumsulfat 1,44 g. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein, schützen Sie ihn vor Licht und lagern Sie ihn bei 4 °C. |
| Aufschlussmedium (100 ml) | Natriumchlorid 800 mg, Kaliumchlorid 37 mg, Di-Natriumhydrogenphosphat 99 mg, HEPES 600 mg, Natriumbicarbonat 35 mg, Kynurensäure, 200 μl (ab 100 mM Lager), D-AP5 100 μL (ab Lager 25 mM). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, schützen Sie ihn vor Licht und lagern Sie ihn bei 4 °C. |
| Lösung 1 | Trypsin 5 mg, Desoxyribonuklease I 1,5 mg, in 2 ml Verdauungsmedium. |
| Lösung 2 | Trypsin-Inhibitor 5 mg, in 5 ml Dissektionsmedium. |
| Lösung 3 | Desoxyribonuklease I 1,5 g, in 2,5 ml Dissektionsmedium. |
Tabelle 1: Tabelle der Lösungen. Produktbeschreibungen finden Sie in der Materialtabelle.
Ergänzende Codierungsdatei 1: Die STL-Designdatei entspricht der in Abbildung 2A dargestellten Struktur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Der 3D-Druck im Mikrometermaßstab ermöglicht das schnelle Prototyping von polymeren Bauelementen für neuronale Zellkulturen. Als Proof-of-Principle wurden strukturelle Verbindungen zwischen Neuronen durch die Schaffung von Barrieren und Kanälen eingeschränkt, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen, während die funktionellen Konsequenzen einer solchen Manipulation durch extrazelluläre Elektrophysiologie beobachtet wurden.
M.G. dankt für die finanzielle Unterstützung durch das Rahmenprogramm H2020 der Europäischen Union durch den Europäischen Innovationsrat (IN-FET-Projekt, GA n. 862882, Arbor-IO-Projekt, FLAG-ERA und das Human Brain Project, ID 650003) und durch SISSA (Neuroscience Area). G.N. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung des italienischen Ministeriums für Universität und Forschung (MUR) durch das Stipendium Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Bereich Mathematik). Wir danken M. Gigante, B. Pastore und M. Grandolfo für ihre Unterstützung beim 3D-Druck, der Zellkultivierung und der Live-Bildgebung sowie Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente und H.C. Schultheiss für die Diskussionen. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB Cure Compact Polymerizer | PCube Srl | Wellenlängen 365-405 nm, Leistung 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | Formlabs | Harz für die Montage der 3D-gedruckten Form an der Petrischale | |
| Rinderserum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD-Anwendungssoftware SolidWorks | Dassault Systè mes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., USA), AutoCAD (Autodesk Inc., USA), PTC Creo (PTC Corp., USA), SolidWorks (Dassault Systè mes SolidWorks corp., USA) und Tinkercad (Autodesk Inc., USA). -------------------------------------- Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Schulungen: https://www.autodesk.com/training | |
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Natriumhydrogenphosphat | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Pferdeserum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA Aufzeichnungssystem MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Deutschland | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurensäure | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamin (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesiumsulfat | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA Recording Application Software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Deutschland | ||
| Minimum Essential | Medium Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmisches Stichmesser 15°; | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D-Drucker | Nanoscribe GmbH & Co. KG KG | SN617 | |
| Plasmareiniger | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethylenimin)-Lösung | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylenglykolmethyletheracetat (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repell-silan ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Kalknatron-ITO-beschichtete Substrate für 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substratintegrierte planare MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Deutschland | TiN-Elektroden, SiN-Isolator, 4 interne Referenzelektroden, 120 Aufzeichnungselektroden, Elektrodenabstand 100 & Mikro; m, Elektrodendurchmesser 30 & Mikro; m | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Vakuumpumpe Einphasig asynchron 2 Pole | CIMAMOTORI |
