Method Article

Zwei-Photonen-Polymerisation 3D-Druck von neuronalen Zellkulturgeräten im Mikromaßstab

DOI:

10.3791/66142

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June 7th, 2024

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1Neuroscience Department, International School for Advanced Studies, 2Mathematics Department, International School for Advanced Studies

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der 3D-Druck im Mikrometermaßstab ermöglicht das schnelle Prototyping von polymeren Bauelementen für neuronale Zellkulturen. Als Proof-of-Principle wurden strukturelle Verbindungen zwischen Neuronen durch die Schaffung von Barrieren und Kanälen eingeschränkt, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen, während die funktionellen Konsequenzen einer solchen Manipulation durch extrazelluläre Elektrophysiologie beobachtet wurden.

Abstract

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Neuronale Kulturen sind seit mehreren Jahrzehnten ein experimentelles Referenzmodell. Es fehlen jedoch die 3D-Zellanordnung, räumliche Einschränkungen des Neuritenwachstums und eine realistische synaptische Konnektivität. Letzteres schränkt die Untersuchung von Struktur und Funktion im Kontext der Kompartimentierung ein und verringert die Bedeutung von Kulturen in den Neurowissenschaften. Die Annäherung an die strukturierte anatomische Anordnung der synaptischen Konnektivität ex vivo ist nicht trivial, obwohl sie für die Entstehung von Rhythmen, synaptischer Plastizität und letztendlich für die Pathophysiologie des Gehirns von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird die Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) als 3D-Drucktechnik eingesetzt, die die schnelle Herstellung von polymeren Zellkulturgeräten unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) im Mikrometermaßstab ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen Replik-Formtechniken auf der Grundlage der Mikrophotolitographie ermöglicht der 2PP-Mikrodruck eine schnelle und kostengünstige Bearbeitung von Prototypen. Dieses Protokoll veranschaulicht das Design und die Herstellung von PDMS-basierten mikrofluidischen Geräten, die auf die Kultivierung modularer neuronaler Netze abzielen. Als Proof-of-Principle wird ein Zweikammergerät vorgestellt, um die Konnektivität physisch einzuschränken. Insbesondere wird ein asymmetrischer axonaler Auswuchs während der ex vivo-Entwicklung bevorzugt und darf von einer Kammer zur anderen geleitet werden. Um die funktionellen Konsequenzen unidirektionaler synaptischer Wechselwirkungen zu untersuchen, werden kommerzielle Mikroelektroden-Arrays ausgewählt, um die bioelektrische Aktivität miteinander verbundener neuronaler Module zu überwachen. Hier werden Methoden zur 1) Herstellung von Formen mit Mikrometergenauigkeit und 2) zur Durchführung extrazellulärer In-vitro-Multisite-Aufzeichnungen in kortikalen neuronalen Kulturen der Ratte veranschaulicht. Durch sinkende Kosten und die zukünftige breite Zugänglichkeit des 2PP-3D-Drucks wird diese Methode in Forschungslabors weltweit immer relevanter. Insbesondere in der Neurotechnologie und der neuronalen Datenaufzeichnung mit hohem Durchsatz wird die Leichtigkeit und Schnelligkeit des Prototypings vereinfachter In-vitro-Modelle die experimentelle Kontrolle und das theoretische Verständnis von in vivo großräumigen neuronalen Systemen verbessern.

Introduction

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Die Untersuchung der neuronalen Aktivität in sich verhaltenden Organismen bringt mehrere Herausforderungen mit sich. Zum Beispiel ist der physische Zugang zum Hirngewebe durch die Notwendigkeit begrenzt, seine Integrität zu erhalten, so dass die oberflächlichen Regionen des Gehirns leichter berücksichtigt werden können. Die Isolierung spezifischer Ziele innerhalb des intakten Gewebes ist oft eine entmutigende Aufgabe und manchmal unmöglich. Obwohl dissoziierte homogene neuronale Kulturen einen bequemen Zugang zu den molekularen, biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften einzelner (sub)zellulärer Komponenten eines neuronalen Schaltkreises bieten, geht eine realistische Konnektivität und anatomische Organisation des intakten Gehirns verloren. Diese grundlegenden Einschränkungen inspirierten die Forschungsbemühungen, einen Mittelweg zu finden, bei dem In-vivo-Komplexität vermieden wird, während die Struktur in vitro konstruiert werden kann, was bei Bedarf erforderlich ist 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Insbesondere modulare neuronale Kulturen waren in den letzten Jahrzehnten Gegenstand umfangreicher Forschung, die darauf abzielte, Schlüsselfragen der Gehirnphysiologie zu beantworten, wie im Folgenden beschrieben.

Organisation: In-vivo-Studien zeigen, dass das Gehirn anatomisch in Schichten mit präzisen Zelltypen und Anordnungen von Projektionen strukturiert ist. Funktionelle Assays zeigten die Organisation der neuronalen Netzwerke in Knotenanordnungen und Modulen mit präzisen Konnektivitätsschemata10,11. Die Rolle von Konnektivitäts- und Mikroschaltungsmotiven kann jedoch aufgrund der schieren Anzahl der beteiligten Synapsen sowie der miteinander verwobenen Effekte von entwicklungs- und aktivitätsabhängiger Plastizität in vivo nicht ausreichend untersucht werden.

Signalübertragung: In In-vivo - oder zufälligen In-vitro-Kulturen ist es schwierig, die Signalübertragung zu beurteilen. Die Untersuchung der axonalen Leitung und des Aktionspotentials entlang seiner Länge erfordert die Steuerung des Neuritenwachstums durch Oberflächenfunktionalisierung oder chemische Strukturierung, die ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei extrazellulären Auslesungen der elektrischen Aktivität liefert12.

Translationale Relevanz: Um die ausschließliche Rolle von prä- und postsynaptischen Elementen bei pathologischen Zuständen zu entschlüsseln, muss man individuell auf diese Elemente zugreifen. Modulare Kulturen mit eingeschränkter Konnektivität, die die prä- und postsynaptischen Elemente effektiv trennen, sind zu diesem Zweck unverzichtbare Werkzeuge13.

Es gibt mehrere Methoden, um eine Form von Struktur in der neuronalen Kultur zu erhalten. Sie können grob als chemische und physikalische Oberflächenmanipulation kategorisiert werden9. Die erstgenannten Methoden14,15 beruhen auf der Neigung neuronaler Zellen, sich an bestimmte (bio)chemische Verbindungen zu binden. Dazu müssen Klebstoffe oder attraktive Moleküle mit Präzision im Mikromaßstab und nach einem detaillierten Muster auf eine Oberfläche aufgetragen werden. Während dies eine teilweise Abdeckung der Zelloberfläche nach dem gewünschten Muster ermöglicht, sind chemische Methoden von Natur aus begrenzt und haben eine relativ geringe Erfolgsrate bei der Steuerung des Neuritenwachstums16. Die vollständige Kontrolle über die Axondirektionalität erfordert die Etablierung eines räumlichen Gradienten von Ad-hoc-Chemikalien, um die axonale Führung zu formen17. Letztere Methoden beinhalten die physikalische Oberflächenmanipulation und werden häufiger verwendet, um die neuronalen Netzwerke in vitro zu strukturieren. Neuronale Zellen sind an den gewünschten Stellen durch geometrische Einschlüsse wie mikroskopische Kammern, Wände, Kanäle usw. physikalisch eingeschränkt und formen ein biokompatibles Polymer wie Polydimethylsiloxan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20, das ausgehärtet und zu einem mikrofluidischen Gerät verfestigt wird. Das De-facto-Verfahren für die mikrofluidische Herstellung von PDMS ist die weiche Photolithographie21, bei der eine zweidimensionale Maske im Mikromaßstab strukturiert und verwendet wird, um ein siliziumbasiertes Material unter UV-Belichtung selektiv zu ätzen. Kurz gesagt, ein UV-härtendes Harz (d. h. Fotolack) wird durch Schleuderbeschichtung auf einen Siliziumwafer aufgetragen und erreicht eine bestimmte Höhe, die durch seine Viskosität und Schleudergeschwindigkeit bestimmt wird. Dann wird die gemusterte Maske über dem Fotolack positioniert und UV-Licht ausgesetzt. Transparente Bereiche innerhalb der Maske, die den interessierenden Regionen entsprechen, lassen UV-Licht eine lokalisierte Vernetzung der Fotolackmoleküle induzieren. Die Bereiche des unbelichteten Fotolacks werden mit einem Lösungsmittel abgewaschen, wodurch sich eine Urform bildet. Damit wird immer wieder ein Elastomer der Wahl (z.B. PDMS) eingebrannt, das dann mit den gewünschten Geometrien in beliebig viele Repliken graviert wird. Ein solches Herstellungsverfahren ist das gebräuchlichste Verfahren zur Herstellung mikrofluidischer Geräte22. Vielleicht sind die Haupteinschränkungen der weichen Photolithographie die Voraussetzung einer nennenswerten Kapitalinvestition und die Unkenntnis biologischer Labore mit den erforderlichen Techniken und Fachkenntnissen. Die Vorbereitung der Maske und die Schritte der weichen Photolithographie, die zum Entwerfen komplexer Geometrien mit mehreren Höhen und hohem Aspektverhältnis erforderlich sind, sind nicht trivial23 und erfordern oft Outsourcing. Auch wenn alternative und kostengünstige Methoden vorgeschlagen wurden, erfüllen sie nicht immer die hohen Präzisionsanforderungen des biologischen Prototyping24.

Hier wird ein alternatives Herstellungsverfahren vorgestellt, das auf Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) und additiver Fertigung basiert. Es ist unkompliziert und erfordert nicht per se fortgeschrittenes Fachwissen in der Mikrofabrikation und Mikrophotolitographie. Das Forschungsfeld der 2PP-Mikrofertigung entstand in den späten 90erJahren 25 und hat seitdem ein exponentielles Wachstum erlebt26. Mehr über die Grundprinzipien dieser Technik finden Sie an anderer Stelle26. Kurz gesagt, durch die Fokussierung des Anregungslichtimpulses im dreidimensionalen Raum nutzt 2PP die nichtlineare Abhängigkeit der Multiphotonenabsorption von der Intensität. Dies ermöglicht die Fähigkeit einer begrenzten Absorption und gewährleistet eine präzise und selektive Anregung in sehr lokalisierten Regionen. Im Wesentlichen wird ein Negativton-Fotolack, ein Material mit verminderter Löslichkeit bei Lichteinwirkung, einem fokussierten Strahl von Femtosekunden-Laserpulsen bei niedrigem Tastverhältnis27 ausgesetzt. Dies ermöglicht Impulse mit hoher Intensität bei niedrigen Durchschnittsleistungen und ermöglicht eine Polymerisation, ohne das Material zu schädigen. Die Wechselwirkung von photoinduzierten Radikalmonomeren führt zu radikalischen Oligomeren, die eine Polymerisation initiieren, die sich über den gesamten Fotolack bis zu einem bestimmten Volumen, d. h. Voxel, erstreckt, dessen Größe von der Intensität und Dauer der Laserpulse abhängt28.

In dieser Arbeit werden zwei Komponenten vorgestellt: A) das Design und die schnelle Herstellung einer 3D-gedruckten Form, die viele Male zur Herstellung von polymeren neuronalen Einweg-Zellkulturgeräten wiederverwendbar ist (Abbildung 1), und B) ihre mechanische Kopplung an die Oberfläche von planaren neuronalen Zellkultursubstraten oder sogar von substratintegrierten Mikroelektrodenarrays, die in der Lage sind, bioelektrische Signale an mehreren Standorten aufzuzeichnen.

Das computergestützte Design eines mechanischen 3D-Modells wird hier sehr kurz beschrieben und von den Schritten begleitet, die zu einer 3D-gedruckten Form und zur Herstellung von PDMS-Geräten führen.

Eine Vielzahl von computergestützten Design-Softwareanwendungen kann verwendet werden, um das Start-3D-Objektmodell zu generieren und eine STL-Datei zur Steuerung des 2PP-Druckprozesses zu erstellen. Innerhalb der Materialtabelle sind die erste und die letzte aufgeführte Anwendung kostenlos oder mit einer freien Lizenz versehen. Die Konstruktion eines 3D-Modells erfordert immer die Erstellung einer 2D-Skizze, die dann in nachfolgenden Modellierungsschritten extrudiert wird. Um dieses Konzept zu demonstrieren, wird im Protokollabschnitt ein generischer 3D-CAD-Software-Designprozess hervorgehoben, der zu einer Struktur aus überlappenden Würfeln führt. Für umfassendere Informationen stehen eine Reihe von Online-Tutorials und kostenlosen Schulungsressourcen zur Verfügung, wie in der Materialtabelle angegeben.

Die resultierende STL-Datei wird dann in eine Reihe von Befehlen übersetzt, die vom 3D-Drucker ausgeführt werden (d.h. Slicing-Verfahren). Für den jeweils verwendeten 2PP 3D-Drucker wird die Software DeScribe verwendet, um die STL-Datei zu importieren und in das proprietäre General Writing Language (GWL) Format zu konvertieren. Der Erfolg des 2PP-Druckverfahrens hängt von verschiedenen Parametern ab, insbesondere von der Laserleistung und der Scangeschwindigkeit, den Näh- und Schraffur-Schneide-Abständen. Die Wahl dieser Parameter sowie die Auswahl von Objektiv und Fotolack hängen von den kleinsten Merkmalen des Designs sowie der beabsichtigten Anwendung ab. Daher wird die Parameteroptimierung unerlässlich, um den Anforderungen verschiedener Designszenarien und Anwendungsfälle gerecht zu werden. Für diese Arbeit wurde die empfohlene Rezeptur IP-S 25x ITO Shell (3D MF) als Konfiguration für die Druckparameter berücksichtigt. Letztendlich wird ein mechanisch stabiles gedrucktes Teil mit der erforderlichen Auflösung gedruckt und gleichzeitig die 3D-Druckzeit minimiert.

Das Formdesign und die zugehörige STL-Datei, die in dieser Arbeit demonstriert werden, umfassen einen quadratischen Rahmen, um den Raum einer Zellkultur in zwei Kammern zu unterteilen: einen äußeren Bereich (d. h. später als Quelle bezeichnet) und einen inneren Bereich (d. h. später als Ziel bezeichnet). Diese beiden Kompartimente sind durch Sätze von Mikrokanälen verbunden, die jeweils durch scharfwinklige Grenzen gekennzeichnet sind, die speziell das Wachstum von Neuriten vom Ziel zur Quelle behindern sollen, aber nicht umgekehrt, und als solche eine gerichtete synaptische Konnektivität zwischen Neuronen fördern, die auf den beiden Bereichen wachsen.

Frühere Studien verwendeten verschiedene Geometrien von Mikrokanälen, um das gerichtete Wachstum von Neuriten zu fördern. Beispiele sind dreieckige Formen18, Kanal-Stachelstrukturen19 und sich verjüngende Kanäle20. Hier wird ein Design mit scharfen Winkelbarrieren über die Grenzen des Mikrokanals verwendet, das sich auch durch asymmetrische Eingänge auszeichnet. Diese Mikrokanäle dienen dazu, die Kontinuität zwischen einem geschlossenen Innenraum, dem Target-Kompartiment, und dem externen Bereich, dem Source-Kompartiment, herzustellen. Die Trichterform des anfänglichen Teils der Mikrokanäle von der Quellenseite aus soll die Bildung von axonalen Bündeln und deren Wachstum entlang des kürzesten, d.h. geraden Weges, der die Quelle mit dem Ziel verbindet, fördern. Der dreieckige Raum, der durch scharfe Winkel realisiert wird, hat ein größeres Volumen auf der Zielseite, um die Wegfindung von Neuriten effektiv zu verzögern und gleichzeitig das schnelle Schießen von Bündeln aus der Quelle und die Besetzung des verfügbaren Raums zu begünstigen. Die Wahl von 540 μm für die Länge der Mikrokanäle filtert den im Allgemeinen kürzeren dendritischen Auswuchs effektivheraus 39. Darüber hinaus verhindert ihre Höhe von 5 μm, dass Zellspalte durch die Mikrokanäle eindringen. Insgesamt hat sich gezeigt, dass diese Konfiguration die unidirektionale Konnektivität zwischen dem äußeren Quell- und dem inneren Zielmodul fördert, und sie wird hier als Proof-of-Principle unter den vielen alternativen Optionen vorgestellt.

Während die PDMS-Bauelemente, die durch die 2PP-Form hergestellt werden, an der Oberfläche gängiger Zellkultursubstrate wie Glasdeckgläser oder Petrischalen befestigt werden können, wurden in dieser Arbeit kommerziell erhältliche substratintegrierte Mikroelektrodenarrays verwendet. Es wurden keine Anstrengungen unternommen, um das 3D-Design für das Layout des Mikroelektrodenarrays zu optimieren, und die mechanische Kopplung wurde unter stereomikroskopischer Anleitung durchgeführt, um das Gerät nur über das Array zu positionieren, wobei auf beiden Seiten, der Quelle und dem Target, eine Mikroelektrode freigelegt wurde. Dies ermöglicht die vorläufige Bewertung der funktionellen Konsequenzen der eingeschränkten Konnektivität in neuronalen Zellkulturen.

Protocol

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Alle Verfahren im Zusammenhang mit dem Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den europäischen und italienischen Rechtsvorschriften durchgeführt (Richtlinie des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 [2010/63/EU]; Italienische Regierungsverordnung vom 4. März 2014, Nr. 26), wurden vom institutionellen OpBA (Komitee für Tierpflege) der Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati ausdrücklich genehmigt und vom italienischen Gesundheitsministerium offiziell genehmigt (Auth. Nr. 22DAB. N.UVD). Diese führten zur Verfügbarkeit von nicht-empfindungsfähigem Material aus dem explantierten Rattenhirngewebe, das für die experimentelle Validierung der in dieser Arbeit vorgestellten Methode verwendet werden konnte.

1. 3D Formenbau durch Zwei-Photonen-Polymerisation

  1. Generieren der CAD-Dateien
    HINWEIS: Die folgenden Schritte demonstrieren einen generischen 3D-Konstruktions-Workflow unter Verwendung von computergestützter Konstruktionssoftware (d. h. SolidWorks). Die in dieser Arbeit beschriebene Beispiel-STL-Designdatei (Abbildung 2) ist als ergänzende Codierungsdatei 1 sowie über Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110) verfügbar.
    1. Starten Sie die Desktop-Anwendung der Computer-Aided-Design-Software. Wählen Sie in der oberen Menüleiste Neu aus.
    2. Wählen Sie in den Optionen Teil: eine 3D-Darstellung einer einzelnen Konstruktionskomponente. Drücken Sie die Tastenkombination Strg + 5 , um die Draufsicht auf die Skizze herzustellen.
    3. Wählen Sie im Seitenbereich Skizze und dann Eckrechteck aus. Wählen Sie eine Kante des Rechtecks aus, indem Sie darauf klicken. Wenn ein Parameterfenster angezeigt wird, stellen Sie die Länge auf 100 Einheiten ein.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3 für die Kante senkrecht zur vorherigen: Stellen Sie ihre Länge auf 50 Einheiten ein. Wählen Sie das Rechteck aus, indem Sie bei gedrückter linker Maustaste darüber ziehen.
    5. Wählen Sie im Menü Beziehung hinzufügen die Option Korrigieren aus, um die Beziehungen zwischen den Linien einzuschränken.
    6. Beenden Sie die Skizze und wiederholen Sie die Schritte 1.1.3 bis 1.1.5, wobei Sie ein neues (kleineres) Rechteck erstellen, das die vorherige Skizze überlappt.
    7. Wählen Sie im Seitenbereich Features und dann Extrudierte Nabe/Basis: Legen Sie die Tiefe des großen und kleinen Rechtecks auf 5 bzw. 10 Einheiten fest.
    8. Speichern Sie das Teil im Menü Datei im STL-Format (d. h. Standard Tessellation Language).
  2. Bearbeitung der CAD-Dateien
    1. Übertragen Sie die STL-Datei auf einen PC, der mit der DeScribe-Anwendungssoftware ausgestattet ist.
    2. Starten Sie Describe und öffnen Sie im Menü Datei die STL-Datei. Eine 3D-Darstellung des Modells wird angezeigt.
    3. Drehen Sie das Modell im Abschnitt "Ausrichtung" im Menü auf der rechten Seite, um es entsprechend im Raum auszurichten, und zentrieren Sie es in der Ebene.
    4. Passen Sie die Gesamtskalierung an, indem Sie im Menü auf der rechten Seite den Abschnitt Skalierung auswählen.
    5. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü oben das Rezept IP-S 25x ITO Shell (3D MF) aus. Diese spezifiziert IP-S als Fotolack, 25x für die Vergrößerungsleistung des Objektivs, Indiumzinnoxid (ITO) beschichtetes Substrat als Drucksubstrat und Schalen- und Gerüstdruck als Betriebsart mit mittelgroßen Merkmalen (MF).
    6. Navigieren Sie durch den Assistenten, und wählen Sie den Schnittabstand auf 1 μm und den Schraffurabstand auf 0,5 μm für die Schale und das Gerüst aus.
    7. Definieren Sie im Ausgabeschritt des Importassistenten unter Splitten die Blockgröße als X = 200 μm, Y = 200 μm und Z = 265 μm und den Blockversatz als X = 133 μm, Y = 133 μm und Z = 0, um sicherzustellen, dass die filigranen Strukturen der Mikrokanäle nicht durch die Stitching-Linien beeinträchtigt werden.
    8. Verwenden Sie als Scan-Modus die Standardeinstellung: Galvo für die X-Y-Ebene und Piezo für die Z-Achse.
    9. Drücken Sie Speichern und ersetzen Sie im nächsten Textmenü die Linie var $baseLaserPower = $shellLaserPower durch var $baseLaserPower = 75, um die Laserleistung auf der untersten Schicht des Drucks auf 75 % zu reduzieren.
    10. Übertragen Sie die mit den obigen Schritten erhaltenen GWL-Dateien auf die für den 2PP-3D-Druck vorgesehene Workstation.
  3. 3D-Druck und Musterentwicklung
    1. Starten Sie die NanoWrite-Anwendungssoftware . Klicken Sie nach der Druckerinitialisierung auf der Softwareoberfläche auf Exchange Holder , um den Substrathalter einzusetzen und das Objektiv zu montieren.
    2. Montieren Sie das 25x-Objektiv in der entsprechenden Position am Objektivrevolver. Identifizieren Sie, welche Seite des Glassubstrats mit ITO beschichtet ist, indem Sie ein elektronisches Multimeter zur Messung von Widerständen verwenden: Der Messwert sollte niedrige Werte betragen, z. B. 100-300 Ω, aber nur für die ITO-beschichtete Seite.
    3. Positionieren Sie das Glassubstrat auf der Halterung und richten Sie die ITO-beschichtete Seite nach oben aus. Verwenden Sie Klebeband, um es fest an Ort und Stelle zu halten.
    4. Tragen Sie unter dem chemischen Abzug einen Tropfen IP-S-Fotolack auf die Mitte des Glassubstrats auf.
    5. Setzen Sie den Halter in den 3D-Drucker ein, wobei der Harztropfen zum Objektiv zeigt (d. h. nach unten).
    6. Laden Sie über das Dateimenü der Software die GWL-Dateien. Wählen Sie Annäherungsprobe, um das Objektiv in die Nähe des Harztropfens zu bewegen.
    7. Wählen Sie Schnittstelle suchen , um die Erkennung der ITO-Fotolack-Druckschnittstelle basierend auf der Brechungsindexdifferenz der beiden Materialien zu ermöglichen.
    8. Wählen Sie Auftrag starten , um den Druckvorgang zu starten. Wenn der Druckvorgang abgeschlossen ist, drücken Sie Halter austauschen , um den Halter abzurufen.
    9. Nehmen Sie den Halter heraus und entfernen Sie vorsichtig das Substrat mit dem gedruckten Teil. Tauchen Sie das Glassubstrat 20 Minuten lang unter den Abzug in Propylenglykolmethyletheracetat (PGMEA), um das gedruckte Teil zu entwickeln.
    10. Entfernen Sie das Substrat von PGMEA und tauchen Sie es 5 Minuten lang in Isopropanol. Lassen Sie das gedruckte Teil unter dem chemischen Abzug an der Luft trocknen.
  4. Nachbearbeitung und Formmontage
    1. Härten Sie das gedruckte Teil durch Einwirkung von UV-Licht (d. h. 365-405 nm) mit ausreichender Leistung für 5-20 Minuten aus (siehe Diskussion für Leistungsdetails).
    2. Entfernen Sie unter einer Laminar-Flow-Haube das gedruckte Teil vorsichtig vom Glassubstrat. Geben Sie ~2 μl Harz auf den Boden einer 35 mm x 10 mm großen Petrischale.
    3. Positionieren Sie das gedruckte Teil vorsichtig über dem Tropfen und lassen Sie das Harz unter das Teil fließen. Härten Sie das gedruckte Teil 5 Minuten lang unter UV-Licht weiter aus.
    4. Decken Sie die Petrischale mit ihrer Kappe ab und stellen Sie sie zum Aushärten über 30 min bei 80 °C in den Ofen. Heizen Sie den Backofen nicht vor, um eine Verformung oder einen Bruch des gedruckten Teils zu vermeiden. Nach dem Aushärten wird das gedruckte Teil dauerhaft am Boden der Petrischale befestigt. Von nun an wird das gedruckte und montierte Teil als Form bezeichnet.

2. Herstellung von PDMS-Geräten aus den Form- und Zellkultursubstraten

  1. Herstellung von PDMS-Geräten
    1. Bereiten Sie 20 ml 10:1 (Gewichtsverhältnis) Mischung aus Basis undHärter aus nicht polymerisiertem PDMS vor. Für jedes Gerät und abhängig von seiner erforderlichen Höhe reichen 1-2 ml PDMS-Mischung aus. Lagern Sie das überschüssige unpolymerisierte PDMS bei -20 °C für die spätere Verwendung.
    2. Unter einer Laminar-Flow-Haube die Mischung 4 Minuten lang gründlich umrühren. Da die Mischung Luftblasen gleichmäßig einfängt, wird sie undurchsichtig.
    3. Die Mischung in ein 50-μl-μ-Röhrchen geben und 5 Minuten lang bei 168 x g zentrifugieren, um Luftblasen aus der Mischung zu entfernen und ein klares Aussehen zu erzielen.
    4. Behandeln Sie die Form mit 10 μl Hydrophobierungsmittel (d. h. Repel-Silan ES) und lassen Sie sie 7 Minuten ruhen, um später eine reibungslose Ablösung des polymerisierten PDMS von der Form zu gewährleisten.
    5. Spülen Sie die Form 1x mit 70% Ethanol und 2x mit deionisiertem (DI) Wasser. Lassen Sie die Form unter der Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.
    6. Gießen Sie die PDMS-Mischung vorsichtig auf die Form, bis die vorgesehene Endhöhe des Geräts erreicht ist. Um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, gießen Sie die Mischung vorsichtig und aus geringem Abstand zur Formoberfläche.
    7. Die Form abdecken und für 18 min in einen vorgeheizten und bei 80 °C stabilisierten Ofen zum Aushärten geben. Bei Gerätehöhen von mehr als 5 mm und bis zu 1 cm verlängern Sie die Aushärtezeit von 18 auf 25 min.
    8. Lösen Sie den ausgehärteten PDMS-Block unter der Laminar-Flow-Haube vorsichtig von der Form und tauchen Sie ihn mindestens 10 Minuten lang in Isopropanol in eine Glas-Petrischale. Isopropanol eliminiert unvernetztes PDMS. Halten Sie den PDMS-Block immer abgedeckt.
    9. Erneuern Sie das Isopropanol und schneiden Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig den zentralen quadratischen Teil des Geräts (in dieser Arbeit als Zielbereich bezeichnet) mit einem Augenstichmesser aus. Schneiden Sie dann weiter entlang der Kanten, um die endgültige Form des Geräts zu erreichen.
    10. Nehmen Sie das Gerät aus Isopropanol und tauchen Sie es 30 Minuten lang in Ethanol und spülen Sie es dann 3x mit sterilem DI-Wasser ab. Halten Sie die Sterilität von diesem Punkt an aufrecht.
    11. Übertragen Sie das Gerät unter einer Laminar-Flow-Haube in eine neue Petrischale, wobei Sie die Kappe leicht geöffnet lassen. Lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen.
  2. Gerätemontage und Vorbereitung von Zellkultursubstraten.
    1. Sterilisieren Sie jedes Mikroelektroden-Array (MEAs), indem Sie 30 Minuten lang 70 % Ethanol eintauchen und dann 3x mit sterilem DI-Wasser spülen.
    2. Montieren Sie das PDMS-Gerät mit einer sterilen Feinpinzette unter einer Laminar-Flow-Haube und einem Stereomikroskop auf dem Innenbereich eines MEA. Richten Sie eine Seite des PDMS-Geräts in der Mitte des inneren MEA-Bereichs mit substratintegrierten Mikroelektroden aus, sodass nur wenige Mikroelektroden sowohl im Quell- als auch im Zielbereich unbedeckt bleiben (siehe Abbildung 2).
      HINWEIS: Für diese Arbeit ist es nicht erforderlich, MEA-Mikroelektroden auf den Mikrokanal des PDMS-Geräts auszurichten. Ein sanfter Druck auf das Gerät kann erforderlich sein, um eine dichte Abdichtung zwischen dem PDMS-Gerät und der MEA-Oberfläche zu erreichen. Vermeiden Sie es um jeden Preis, die Mikroelektroden mit der Pinzettenspitze zu berühren.
    3. Setzen Sie das MEA mit PDMS-Gerät in die Plasmareinigungskammer ein, um die Oberflächenaktivierung durch Luftplasma zu aktivieren. Beginnen Sie den Prozess mit einer 4-minütigen Vakuumpumpenevakuierung der Kammer. Öffnen Sie anschließend das Luftventil leicht, um eine kontrollierte Luftentlüftung zu ermöglichen. Schließen Sie das Luftventil und schalten Sie die Plasmainduktoren ein, wobei Sie die HF-Leistung zwischen 10 W und 18 W einstellen.
    4. Sobald ein leuchtendes Licht erscheint, lassen Sie den Prozess 80 s lang laufen. Schalten Sie dann den Plasmainduktor aus, schließen Sie das Vakuumpumpenventil und öffnen Sie vorsichtig das Luftventil. Öffnen Sie die Kammer, um die MEA zu holen.
      HINWEIS: Wenn bei der Plasmabehandlung MEAs einer nicht sterilen Umgebung ausgesetzt werden, stellen Sie jede MEA 30 Minuten lang unter UV-Licht in einer Laminar-Flow-Haube, um die Sterilität zu gewährleisten.
    5. Geben Sie 1 ml Polyethylenimin (PEI) 0,1 % Gew.-% / vol-Lösung in die MEA und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Aspirieren Sie die PEI-Lösung und spülen Sie sie 5x mit sterilem DI-Wasser ab. Geben Sie 1 ml des Zellkulturmediums in das MEA und inkubieren Sie es vor der Zellaussaat.

3. Neuronale Zellkultur und Elektrophysiologie

  1. Bereiten Sie im Voraus das Seziermedium, die Aufschlusslösung und die Lösungen 1-3 vor (siehe Tabelle 1).
  2. Dissoziierte neuronale Zellkultur.
    1. Fassen Sie einen neugeborenen Wistar-Rattenwelpen im Alter von 0-1 Tagen vorsichtig an der Schnauze und führen Sie eine schnelle Enthauptung mit einer scharfen Schere durch.
    2. Ziehen Sie die Kopfhaut ab, machen Sie mit einer feinen Schere einen Schnitt entlang der sagittalen Mittellinie des Schädels und machen Sie dann einen koronalen Schnitt durch den Schädel an der Verbindung des Kleinhirns.
    3. Entfernen Sie den Schädel, schöpfen Sie das Gehirn mit einem feinen Spatel heraus und geben Sie es in kaltes (4 °C) Seziermedium.
    4. Entfernen Sie das subkortikale Gewebe, den Hippocampus und die Hirnhäute. Zerkleinern Sie das Gewebe in kleine Stücke (d. h. 1-2 mm3) und übertragen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie das Gewebe mit frischem Seziermedium ab, gefolgt von einer Wäsche mit Aufschlussmedium.
    5. Entsorgen Sie das Aufschlussmedium und fügen Sie dann 1 ml Lösung 1 hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 5 Minuten. Lösung 1 verwerfen und das Gewebe mit frischem Seziermedium ausspülen. Fügen Sie dann 1 ml Lösung 2 hinzu und halten Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 4 °C.
    6. Entsorgen Sie Lösung 2 und spülen Sie das Gewebe mit frischem Seziermedium aus. Fügen Sie dann 1 ml Lösung 3 hinzu. Dissoziieren Sie die Zellen mechanisch, indem Sie die Lösung 20 bis 30 Mal langsam auf und ab pipettieren. Wenn eine gleichmäßig trübe Mischung dissoziierter Zellen erscheint, erhöhen Sie ihr Volumen auf 3 ml, indem Sie Dissektionsmedium hinzufügen.
    7. Sammeln Sie das Zellpellet, indem Sie die Mischung bei 100 x g für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml vorgewärmtem Kulturmedium.
    8. Zählen Sie die Zellen (d. h. durch eine Zellzählkammer) und passen Sie die Dichte der Zellaussaatlösung entsprechend an.
    9. Säen Sie jede MEA mit 1 ml Aussaatlösung mit einer nominalen Zelldichte von 1,8 x 106 (~ 6500 Zellen/mm2). Inkubieren Sie die ausgesäten MEAs in einem feuchten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage gegen frisches (d. h. wöchentlich hergestelltes) Nährmedium aus.
  3. Extrazelluläre Elektrophysiologie
    HINWEIS: Dissoziierte neuronale Zellkulturen erreichen nach 2-3 Wochen in vitro einen voll ausgereiften elektrischen Phänotyp. Die folgenden Abschnitte beschreiben ein extrazelluläres Stimulationsprotokoll, das eine kommerzielle MEA-Anwendungssoftware (Experimenter) verwendet, um eine der in Modulen kultivierten neuronalen Populationen, d.h. Source oder Target, elektrisch zu stimulieren und gleichzeitig die Aktivität beider Populationen in reifen Netzwerken aufzuzeichnen.
    1. Montieren Sie einen MEA vorsichtig in der Kopfstufe des elektronischen Mehrkanalverstärkers in einem Trockeninkubator (37 °C, 5 % CO2) und lassen Sie ihn 10 Minuten lang aufnehmen. Eine kundenspezifische PDMS-Kappe kann separat hergestellt und als dichte Abdeckung für jede MEA verwendet werden, um die Wasserverdunstung zu reduzieren und die Sterilität aufrechtzuerhalten.
    2. Starten Sie die Experimenter-Software. Stellen Sie die Abtastrate auf 25 kHz ein und starten Sie die Datenerfassung durch Drücken von Start DAQ. Im Bedienfeld "Datenanzeige" werden die Rohspuren der extrazellulär aufgezeichneten Aktivitäten für jeden Kanal angezeigt.
    3. Überwachen Sie die spontane Aktivität und identifizieren und wählen Sie visuell 3 Paare benachbarter Mikroelektroden aus, die während Bursts von netzwerkweiten spontanen synchronisierten Aktivitätsbursts aktiv sind, entweder von den Mikroelektroden auf der Quell- oder Zielseite.
    4. Konfigurieren Sie im Stimulator-Panel der Software die Parameter für jedes der stimulierenden Mikroelektrodenpaare in bipolarer Konfiguration: Wählen Sie eine zweiphasige Pulswellenform und stellen Sie die Spitzenamplituden auf ± 800 mV und die Pulsdauer auf 200 μs ein.
    5. Stellen Sie den Rekorder ein und nehmen Sie ihn für einen Zeitraum von 300 ms vor bis 1000 ms nach der Stimulation auf.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3 bis 3.3.5 für die Quell- und die Zielseite in einer verschachtelten Weise für die erforderliche Anzahl von Wiederholungen.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird über die Herstellung eines polymeren (neuronalen) Zellkulturgeräts mit 2 Kompartimenten berichtet, das die Verwendung des 2PP-3D-Drucks für das Rapid Prototyping von PDMS-Geräten veranschaulicht. Konkret wird ein Gerät für modulare neuronale Netzwerke mit unidirektionaler synaptischer Konnektivität hergestellt und seine funktionelle Charakterisierung in Bezug auf die extrazelluläre Elektrophysiologie an mehreren Standorten dargestellt. Kurz gesagt, eine Form im Mikrometermaßstab wurde mittels direktem Laserschreiben mit einem handelsüblichen 3D-Drucker realisiert. Insbesondere liefert der Drucker eine Leistung von 50 mW durch Laserpulse mit einer Mittenwellenlänge von 780 nm und einer Dauer von 80 bis 100 fs. Während des Herstellungsprozesses wird der Laserstrahl durch das Objektiv (25x, NA=0,8) des Druckers auf den Negativton-Fotolack (IP-S) fokussiert, um das Druckvolumen mit dem Galvo-Scanner für die x- und y-Achse und dem Piezotisch für die z-Achse zu scannen. Das Druckvolumen wurde entsprechend in Blöcke von 200 mm x 200 mm x 265 mm aufgeteilt, um eine Form mit einer Gesamtgröße von 6500 mm x 6500 mm x 545 mm und einem Nennvolumen von 12.423 ml zu realisieren. Abbildung 2A zeigt eine 2D-Skizze der Form, die ihre Abmessungen und die Größe der Merkmale hervorhebt, während Abbildung 2B eine Nahaufnahme des fertigen Geräts zeigt, das auf einem MEA montiert ist. Die wie im vorherigen Abschnitt beschriebenen Formen waren langlebig und konnten mehr als 50 Mal zur Herstellung von PDMS-Geräten wiederverwendet werden.

Die gedruckte Form wurde zum Gießen des PDMS-Geräts verwendet, das dann auf dem inneren Bereich von integrierten Glassubstrat-Arrays von Mikroelektrodenarrays (MEA) montiert wurde, um für extrazelluläre Aufzeichnungen neuronaler elektrischer Aktivität an mehreren Standorten und als Proof-of-Principle verwendet zu werden. Kommerzielle substratintegrierte MEAs wurden verwendet, um die Aktivität modularer Kulturen als Reaktion auf räumlich lokalisierte elektrische Reize zu überwachen, die extrazellulär von einer Untergruppe von Mikroeelectroden in jedem Kulturkompartiment abgegeben wurden. Jede MEA enthält 120 Titannitrat (TiN)-Mikroelektroden mit einem Durchmesser von 30 μm und einem Elektrodenabstand von 100 μm. Abbildung 2C-D zeigt die Platzierung des PDMS-Geräts auf der Oberseite der MEA. Die geometrischen Merkmale der einzelnen Mikrokanäle des Geräts führen zusammen mit dem in Abbildung 2C gezeigten Gesamtfootprint der Kammer zu einer Kompartimentierung der kultivierten Neuronen. Diese können anhand des Fachs unterschieden werden, zu dem sie gehören, im äußeren Bereich (Source) des Geräts oder im inneren Bereich (Target) des Geräts. Die bevorzugte axonale Führung, die von der Quelle zum Ziel beschränkt ist, wird durch die scharfwinkligen Kanten der Mikrokanäle bestimmt. Abbildung 2D zeigt die Platzierung des Polymergeräts auf dem MEA und den relativen Abdeckungsbereich der Aufzeichnungselektroden, die sich in den Quell- oder Zielkammern befinden. Beachten Sie, dass eine genaue Ausrichtung der Innenseite der Mikrokanäle des Geräts auf eine oder mehrere Reihen von MEA-Mikroelektroden für unsere Fallstudie weder erforderlich noch verfolgt wurde.

Repräsentative Beweise für das asymmetrische Neuritenwachstum sind in Abbildung 3 während der Ex-vivo-Entwicklung zu sehen, die fluoreszenzmarkierte Neuriten in der Live-Bildgebung zeigt, 6 Tage (Abbildung 3A) und 2 Tage nach der Zellbeschichtung (Abbildung 3B-D). Während die Neuriten auf der Zielseite des Geräts auf scharfe Winkelbarrieren stießen, die ihren Fortschritt durch den Raum behinderten, wuchsen die Neuriten, die von der Quellseite stammten, ununterbrochen und kreuzten die Kanäle. Diese Asymmetrie begünstigt eine unidirektionale axonale Verbindung zwischen Neuronen in den beiden Kompartimenten, die von der Quelle zum Ziel projiziert werden, wie es im Design ausdrücklich beabsichtigt ist. Dieses Ergebnis wird durch eine (funktionelle) elektrophysiologische Bewertung elektrischer Reaktionen unterstützt, die durch Stimuli hervorgerufen werden, die abwechselnd in jedem der beiden Kompartimente abgegeben werden.

Nach 3-4 Wochen in vitro, als die neuronalen Netzwerke ihre volle Reife erreichten29,30, konnte die funktionelle Konnektivität zwischen den beiden Kompartimenten untersucht werden, indem kurze elektrische Reize abgegeben und die neuronalen Reaktionen, die sie hervorriefen, überwachtwurden 31. Biphasische elektrische Impulse mit einer Amplitude von 800 mV wurden dann abwechselnd nur an die Quelle oder nur an die Zielpopulationen (N Wiederholungen = 150, N modulare Kulturen = 6) appliziert, die von 3 nebeneinander liegenden Paaren planarer Mikroelektroden in einer bipolaren Konfiguration und in einer verschachtelten Weise geliefert wurden. Daher könnten sich die 3 Elektrodenpaare innerhalb des Quellbereichs der MEA oder innerhalb des Zielbereichs der MEA befinden. Die von jedem Stimulus hervorgerufenen elektrischen Reaktionen konnten dann nach einer Ausbreitungsverzögerung von allen MEA-Mikroelektroden detektiert werden. Die Aufnahmen wurden mit einer Abtastrate von 25 kHz/Kanal durchgeführt, und die resultierenden extrazellulären elektrischen Rohsignale wurden mit einer Analog-Digital-Wandlungsauflösung von 16 Bit digitalisiert. Ein schwellenwertüberschreitender Peak-Detektionsalgorithmus32 wurde offline verwendet, um den Zeitpunkt des Auftretens extrazellulärer Aktionspotentiale zu detektieren, ohne eine Spike-Sortierung durchzuführen. Abbildung 4A-B zeigt deutlich eine starke Asymmetrie der evozierten Reaktionen, die je nach Ort der Stimulusabgabe 150 Mal wiederholt werden, was auf einen signifikanten funktionellen Einfluss der geometrischen Einschränkungen auf die bevorzugte Richtungsabhängigkeit der Konnektivität hindeutet. Tatsächlich stieg bei der Stimulation der Quellseite die Feuerrate der neuronalen Population der Quelle - geschätzt durch Berechnung des Peristimulus-Spike-Times-Histogramms - wie erwartet an, was einen vollständigen Netzwerk-Burst von Aktionspotentialenerzeugte 33,31,34, und es folgte, nach einer Verzögerung, ein Anstieg der Feuerrate der Zielpopulation. Da die Stimulation jedoch innerhalb der Zielpopulation erfolgte, stieg nur die Feuerrate der Zielpopulation an, während die Quellpopulation weitgehend stumm blieb. Abbildung 4C-D wiederholt das gleiche Stimulus/Reaktions-Paradigma in einer Kontrollkultur, ohne dass ein polymeres Gerät vorhanden ist (d. h. eine unstrukturierte neuronale Kultur), die extrazellulären Stimuli wurden ebenfalls über 4 Wiederholungen abgegeben. Bei solchen Kontrollbedingungen trat keine Asymmetrie in den Reaktionen auf, die durch einen der beiden Stimuli hervorgerufen wurden. Während die Untergruppe der MEA-Mikroelektroden, die zur Abgabe der Reize verwendet wurden, mit der in modularen Netzwerken übereinstimmte, führte der Ort der Stimulusabgabe zu einer ähnlich evozierten Reaktion der gesamten Bevölkerung. Dies bestätigt, dass das PDMS-Gerät eine unidirektionale synaptische Konnektivität über die beiden Kompartimente hinweg bevorzugte. Insgesamt deuten asymmetrische Reaktionen, die in modularen Kulturen (N = 6) hervorgerufen werden, und symmetrische Reaktionen, die in Kontrollkulturen hervorgerufen werden (N = 4), stark auf eine eingeschränkte anatomische Konnektivität eines kompartimentierten In-vitro-Systems hin. Die elektrophysiologischen Daten und die Skripte, die zur Generierung von Abbildung 4 verwendet wurden, werden über Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990) zur Verfügung gestellt.

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Abbildung 1: Skizze der Herstellung von 2PP-Mikroformen und PDMS-Replika-Spritzguss. (A) Ein 3D-Modell wird in CAD entworfen und im STL-Format (Standard Tessellation Language) exportiert , (B) wird sein 2-Photonen-3D-Druck durch laserinduzierte Polymerisation in einem Tropfen Harz (IP-S) angewiesen. (C) Die resultierende Struktur wird als Form für die wiederholte Herstellung von PDMS-Repliken verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Beispiel für ein internes Rapid Prototyping eines polymeren (neuronalen) Zellkultur-PDMS-Geräts. (A) In weniger als 24 Stunden ermöglicht die additive Fertigung im Mikromaßstab den Übergang von einem CAD-Modell zu einem 3D-gedruckten Master, das sofort und wiederholt als Nachbildung einer Form mit biokompatiblen Elastomeren wie PDMS verwendet werden kann. (B-C) Die resultierenden PDMS-Geräte sind mit einem planaren neuronalen Zellkultursubstrat gekoppelt, das hier durch eine Anordnung von Mikroelektroden dargestellt wird. Für das spezifische Probendesign in (A) werden zwei Kammern definiert: eine wird als Quelle bezeichnet und mit S angezeigt, und die andere wird als Ziel bezeichnet und durch T angezeigt. (D) Neuronen, die in jeder Kammer plattiert sind, können ihre Neuriten nur durch eine Reihe von Mikrokanälen wachsen lassen. Bei entsprechender Ausrichtung unter stereomikroskopischer Anleitung in (C) bleiben zwei Sätze substratintegrierter Mikroelektroden frei, so dass die bioelektrische Aktivität benachbarter Neuronen, die sich in beiden Kompartimenten befinden, stimuliert und aufgezeichnet werden kann. Beachten Sie hierbei, dass das Ausrichten von Mikroelektroden innerhalb einzelner Mikrokanäle nicht die Priorität dieses Proof-of-Principle war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Live-Bildgebung von zellundurchlässigen fluoreszierenden Reportermolekülen, identifiziert Neuriten, die von Neuronen verlängert wurden, wenige Tage nach der Zellbeschichtung. (A-D) Repräsentative konfokale Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von modularen neuronalen Kulturen des Geräts, die aus Abbildung 1 und Abbildung 2 hergestellt wurden (N = 4, 128 einzelne Mikrokanäle), wurden 2 und 6 Tage nach der Zellbeschichtung aufgenommen. (B-D) Die 40-fache Vergrößerung und eine invertierte Graustufe der Schliffbilder sorgen für eine erhöhte Sichtbarkeit. Die Enden der Mikrokanäle aus dem Source- und dem Target-Kompartiment werden mit S bzw. T bezeichnet. (A) zeigt das Wide-Scan-Bild der Kultur, in dem Source (d. h. der innere quadratische Bereich) und Target (d. h. der äußere Bereich) 6 Tage nach dem Plattieren voller Zellen sind. (B) und (C) zeigen zum früheren Zeitpunkt von 2 Tagen nach der Beschichtung das Wachstum von Neuriten an der Quell- bzw. an der Zielseite der Mikrokanäle. Die kleinen schwarzen Dreiecke zeigen repräsentative Beispiele für mutmaßliche Axonbündel-Terminals, die anscheinend nur von der Quelle stammen. Die Grenzen der pfeilförmigen Mikrokanäle zeigen auf die Verlängerung der Neuriten entlang der Kante (B), wo ihr Durchgang ununterbrochen und zum Ziel geführt wird. In der entgegengesetzten Richtung und neben dem Zielende eines Mikrokanals (C) werden Neuriten, die vom Ziel ausgehen und zur Quellseite vordringen, an den scharfen Ecken eingeschlossen. (D) zeigt weiter die Details des Neuritenauswuchses in einem Mikrokanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Funktionelle Charakterisierung neuronaler elektrischer Reaktionen mit und ohne PDMS-Gerät. MEAs wurden als Zellkultivierungssubstrate verwendet und verwendet, um die netzwerkweiten Spike-Reaktionen zu messen, die durch einen sehr kurzen (d. h. 200 μs, 0,8 V) biphasischen elektrischen Stimulationsimpuls in einer bipolaren Konfiguration hervorgerufen wurden. Mit dem PDMS-Gerät in Abbildung 2 unterscheiden sich die neuronalen Spike-Reaktionen, die von der Quelle (rot) und vom Ziel (blau) aufgezeichnet werden, je nachdem, wo der Stimulus abgegeben wird. Mutmaßliche axonale, synaptische und Integrationsverzögerungen werden in (A), aber nicht in (B) deutlich, was darauf hindeutet, dass eine bevorzugte synaptische Konnektivität (d.h. von der Quelle zum Ziel) existiert. (C-D) Unter Kontrollbedingungen (d. h. ohne PDMS-Gerät) hängen evozierte Reaktionen, die an zwei verschiedenen Sätzen von MEA-Mikroelektroden detektiert werden, nicht vom Ort der Stimulusabgabe ab. Die blasse Schattierung, die die Linien in den Diagrammen umhüllt, bezeichnet den momentanen Standardfehler des Mittelwerts (N Stimuli = 150). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name der LösungZusammensetzung
Polyethylenimin (PEI) 0,1 %1 ml PEI-Stammlösung, 9 ml steriles deionisiertes (DI) Wasser.
Nährmedium (50 ml)Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt durch 20 μM Glukose, 50 μg/ml Gentamicin, 50 μM L-Glutamin und 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum.
Seziermedium (1000 ml)Hanks′ Ausgewogene Salze 9,52 g, Natriumbicarbonat 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-Glukose 6 g, Kynurensäure (Endkonzentration 200 μM), D-AP5 (Endkonzentration 25 μM), Gentamicin 250 μl, Rinderserumalbumin 300 mg, Magnesiumsulfat 1,44 g. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein, schützen Sie ihn vor Licht und lagern Sie ihn bei 4 °C.
Aufschlussmedium (100 ml)Natriumchlorid 800 mg, Kaliumchlorid 37 mg, Di-Natriumhydrogenphosphat 99 mg, HEPES 600 mg, Natriumbicarbonat 35 mg, Kynurensäure, 200 μl (ab 100 mM Lager), D-AP5 100 μL (ab Lager 25 mM). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, schützen Sie ihn vor Licht und lagern Sie ihn bei 4 °C.
Lösung 1Trypsin 5 mg, Desoxyribonuklease I 1,5 mg, in 2 ml Verdauungsmedium.
Lösung 2Trypsin-Inhibitor 5 mg, in 5 ml Dissektionsmedium.
Lösung 3Desoxyribonuklease I 1,5 g, in 2,5 ml Dissektionsmedium.

Tabelle 1: Tabelle der Lösungen. Produktbeschreibungen finden Sie in der Materialtabelle.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Die STL-Designdatei entspricht der in Abbildung 2A dargestellten Struktur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwohl die 2PP-Technologie Jahrzehnte alt ist, ist die Anwendung der 2PP-Technologie im PDMS-basierten Replik-Spritzguss im Mikrometermaßstab eine neue Entwicklung43,44. In diesem Zusammenhang werden im Folgenden eine Reihe von Punkten erörtert, die den Benutzern bei der effektiven Reproduktion dieser Arbeit helfen sollen.

Stellen Sie bei der 3D-Modellkonstruktion sicher, dass das Modell keine Löcher oder Selbstschnitte aufweist. Privilegieren Sie das binäre Dateiformat beim Speichern als STL, da es eine geringere Dateigröße als ASCII-codiert hat. Dies ist besonders vorteilhaft für Designs mit komplizierten Geometrien und für milliliterbreite Objekte. Die Verwendung von binären STL-Dateien impliziert auch eine geringe CPU-Last, wodurch später im Prozess das mechanische Teil für den 3D-Druck vorbereitet wird. Die physischen Abmessungen der Features in der STL-Datei werden in dimensionslosen Einheiten dargestellt. Bei der Nachbearbeitung der STL-Datei werden Einheiten als Mikrometer interpretiert. Daher wird empfohlen, bei der Vorbereitung der Datei im Voraus die interessierende Einheit, d. h. Mikrometer, zu verwenden. Die Genauigkeit des gedruckten Modells wird durch die Anzahl der Oberflächen bestimmt, die sich den mosaikartierten Dreiecken annähern. Bei einer unzureichenden Anzahl von Oberflächen tritt eine unerwünschte Oberflächenrauheit auf. Das Streben nach übermäßig hoher Genauigkeit durch eine sehr große Anzahl von Oberflächen geht jedoch mit einer hohen Rechenlast einher, was zu einer langsamen Dateiverarbeitung führt.

Beim 3D-Druck wird das physische 3D-Objekt während des Drucks durch schnelles Galvo-Scannen in der x-y-Ebene und Piezobewegung in z-Richtung geformt. Dadurch wird der Femtosekunden-Laserstrahl innerhalb eines bestimmten 3D-Voxels fokussiert. Wenn die Druckstrukturen jedoch größer sind als die räumlichen Abdeckungsbereiche von Galvo und Piezo, muss das Objekt programmgesteuert in Blöcke aufgeteilt werden. Während dies eine Anforderung für millimetergroße gedruckte Teile ist, sind Verbindungsstellen zwischen Blöcken mit (unvollkommenen) Heftlinien verbunden. Eine sorgfältige Optimierung der Anzahl der Blöcke und die Platzierung von Stitching-Linien in x-, y- und z-Richtung sind entscheidend, um zu vermeiden, dass kritische geometrische Merkmale des endgültigen Objekts durch Stitching-Linien gestört werden. Blasen können sich aus verschiedenen Gründen an der Druckschnittstelle bilden (z. B. Verunreinigungen und Inhomogenitäten von Fotolacken von Substraten) und sich negativ auf die Qualität und Integrität der gedruckten Struktur auswirken. Darüber hinaus kann eine höhere Laserleistung zu einer Zunahme ihres Auftretens führen. Durch die Reduzierung der Laserleistung in der untersten Schicht des gedruckten Teils wird die Wahrscheinlichkeit der Blasenbildung minimiert. Als Alternative zum Drucken des gesamten Teils als feste Struktur kann das Schalen-Gerüst-Verfahren in Betracht gezogen werden. Dabei werden nur die Außenfläche des Teils (Schale) sowie dreieckige Prismenelemente darin gedruckt. Diese Elemente sind durch horizontale Schichten (Gerüst) getrennt, die das nicht polymerisierte Harz in kleinen Taschen halten. Dieses Verfahren verkürzt die Druckzeit erheblich, was insbesondere für millimetergroße Strukturen relevant ist. Da jedoch nicht polymerisiertes Harz zurückbleibt, ist eine UV-Belichtung nach dem Druck unerlässlich, um die volle mechanische Stabilität zu gewährleisten, obwohl dieser Schritt vorsichtig durchgeführt werden muss, um eine Verformung des gedruckten Teils zu vermeiden. Die Nachhärtungszeit hängt vom gewählten Harz, der Dicke des Teils und der UV-Leistung40 ab. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wird empfohlen, einen ersten Versuch durchzuführen, um die Zeit abzuschätzen, die für die vollständige Aushärtung benötigt wird, indem ein Tropfen Fotolack verwendet und der Schnitt nach der UV-Exposition ausgewertet wird. Die übliche Aushärtungszeit liegt zwischen 5 und 20 Minuten.

Für das PDMS-Replik-Spritzgießen kann die saubere Herstellung eines PDMS-Geräts mit mikrometergroßen Merkmalen ohne Reinraumeinrichtungen eine Herausforderung darstellen: Luftgetragene Mikropartikel können sich auf der stark haftenden Oberfläche des PDMS befinden und die Abdichtung zwischen dem Gerät und dem Substrat behindern oder den Abschnitt einzelner Mikrokanäle blockieren. Die Durchführung der Protokollschritte unter einer Laminar-Flow-Haube und die konsequente Abschirmung der PDMS-Oberfläche mit Isopropanol minimiert das Kontaminationsrisiko erheblich. Die Aushärtungstemperatur und ihre Dauer wirken sich direkt auf die PDMS-Vernetzung und die daraus resultierenden physikalischen Eigenschaften aus. Insbesondere die Haftfähigkeit von ausgehärtetem PDMS ist ein kritischer Faktor. Einerseits ist eine dichte Abdichtung zwischen dem PDMS-Gerät und der für die neuronale Zellkultivierung verwendeten Oberfläche (z. B. einem Glasdeckglas oder einem MEA) erforderlich, um den Durchgang der Neuriten effektiv zu begrenzen. Andererseits sollte das PDMS-Gerät reversibel an der Oberfläche befestigt werden, damit die empfindliche Isolierschicht MEAs nach dem Entfernen des Geräts nicht beschädigt wird. Während die PDMS-Schrumpfung während der Aushärtung auftritt und durch eine vorherige Neuskalierung der Form korrigiert werden kann, beträgt die Schrumpfung bei den hier angegebenen Temperaturen und Aushärtungsintervallen weniger als 2 %42 und wirkt sich nicht wesentlich auf einschichtige PDMS-Geräte aus. Befolgen Sie insgesamt genau die empfohlenen Werte für Aushärtungstemperatur und -dauer, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

Vorteile und Grenzen der Methode im Überblick
Eine Technik, die auf direktem 2-Photonen-Laserschreiben basiert, wird für die schnelle Herstellung von polymeren Bauelementen im Mikromaßstab für die experimentelle Untersuchung modularer neuronaler Netze vorgeschlagen. Im Gegensatz zur weichen Photolithographie erfordert der vorgeschlagene Ansatz kein hohes Maß an technischem Fachwissen, vorausgesetzt, ein funktionaler 2PP-3D-Druckaufbau ist zugänglich und betriebsbereit. Bemerkenswerterweise ermöglicht die Methode den Übergang von einem CAD-entworfenen 3D-Modell zu einem funktionsfähigen PDMS-Gerät innerhalb eines einzigen Tages und bietet so einen direkten und effizienten Weg vom Konzept zur greifbaren Realisierung. Insbesondere die Entscheidung für den Schalen- und Gerüstdruckmodus reduziert die Zeit, die für die Erstellung der Form benötigt wird, erheblich, da nur ein Bruchteil ihres Volumens gedruckt wird. Die anschließende UV-Härtung des gedruckten Bauteils garantiert dessen mechanische Stabilität und Robustheit, wie hier über 50 Gießzyklen mit PDMS nachgewiesen.

Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren bietet der 2PP-3D-Druck einen klaren Vorteil, der am deutlichsten ausgeprägt ist, wenn es um die Herstellung von Formen mit einem signifikanten Seitenverhältnis, hohen Auflösungsanforderungen und komplexen dreidimensionalen Geometrien geht. Die Herstellung von Urformen mit Standard-UV-Lithographie ist durch eine Lackdicke von ca. 200 μm eingeschränkt. Komplizierte Sequenzen von Schleuderbeschichtungs- und Belichtungszyklen35, kostspielige LIGA-Prozesse (Lithographie, Galvanik und Formgebung) oder Deep Reactive Ion Etching (DRIE)36 sind erforderlich, um größere Höhen- und Aspektverhältnisse zu erreichen. Im Gegensatz dazu bietet die 2PP-Technik, wie in der Pionierarbeit von Kumi et al. aus dem Jahr 201037 gezeigt wurde, einen im Wesentlichen unbegrenzten Spielraum für das Aspektverhältnis der gedruckten Teile, das von Submikrometern bis zu Millimetern reicht. Hier wurde der Mikroherstellungsprozess einer Form mit signifikanten Höhenunterschieden ihrer Teile veranschaulicht, wobei die Höhe der Mikrokanäle (5 μm) und die maximale Werkzeughöhe (545 μm; siehe Abbildung 2) mehr als 100-fach voneinander unterschieden wurden.

Außerdem könnte eine Auflösung im Submikrometerbereich leicht erreicht werden, indem die beschriebenen Protokollspezifikationen befolgt werden. Im Vergleich dazu erfordert das Erreichen verbesserter Formauflösungen durch UV-Photolithographie Kapitalinvestitionen. Die Masken mit der feinsten Auflösung, bei denen Chromabscheidung auf Quarz mit einer nominalen Auflösung von 600 nm verwendet wird, sind um mehrere Größenordnungen teurer als die lasergedruckten Overhead-Transparenzmasken, die eine Auflösung von 250μm 35 besitzen, siehe jedoch die Arbeit von Pirlo et al.41. Um für den internen Einsatz rentabel zu sein, muss eine gewählte Methode kostengünstig sein. Für viele biologische Labore stellen die Gesamtkosten, die mit der herkömmlichen Soft-Photolithographie oder dem direkten Laserschreiben verbunden sind, ein Hindernis dar. Es ist zwar möglich, beide Technologien durch den Kauf und die Montage der wesentlichen Komponenten zugänglicher zu machen, aber dieser Ansatz erfordert zusätzliches Know-how und erfordert dennoch eine beträchtliche Investition. Ein wesentlicher Punkt ist in diesem Zusammenhang das breitere Anwendungsspektrum, das durch direktes Laserschreiben erreicht werden kann. Im Gegensatz zur herkömmlichen weichen Fotolithographie, die hauptsächlich auf die Mikrofertigung von Formen beschränkt ist, weist der 2PP-3D-Druck eine bemerkenswerte Vielseitigkeit auf. Die Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Mikrofluidik und Mikrooptik bis hin zur integrierten Photonik und Mikromechanik. Dies macht die Investition in diese Technologie als gemeinsame Einrichtung für mehrere und unterschiedliche wissenschaftliche Bereiche attraktiv. Zum Beispiel ist die 2PP-basierte Methodik, die in diesem Protokoll entwickelt wurde, das Ergebnis einer interdisziplinären Zusammenarbeit zwischen neurowissenschaftlichen und mathematischen Abteilungen innerhalb unserer Institution. Darüber hinaus ist die Entwicklung von Fotolacken ein aktives Forschungsfeld und kann das Anwendungsspektrum des 2PP-3D-Drucks erweitern. Ein typisches Beispiel ist die kürzliche Einführung von IP-PDMS-Harz. Durch die Polymerisation in Strukturen mit Eigenschaften wie PDMS38 erschließt dieses Harz das Potenzial für die direkte Mikrofabrikation biokompatibler Komponenten mit gewellter Oberfläche oder Hohlräumen. Diese Feinheiten stellen ein Hindernis dar, um ähnliche Ergebnisse durch herkömmliche Nachbauverfahren zu erzielen.

Als Demonstration dieser Methode wurden Beweise für die Entwicklung einer unidirektionalen Konnektivität zwischen zwei Modulen in einem modularen neuronalen Netzwerk vorgelegt. Die im 2PP-Verfahren hergestellte Mikroform hatte genug Ausdauer, um mehreren PDMS-Gussarbeiten unterzogen zu werden, und verfügt über die erforderliche Präzision im Mikromaßstab. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Anwendungsbereich des in dieser Arbeit beschriebenen Protokolls über den dargestellten Fall hinausgeht. Mit zunehmender Verbreitung des Zugangs zur 2PP-Drucktechnologie werden die für die Implementierung erforderlichen Anfangsinvestitionen sinken und gleichzeitig die Anwendungsmöglichkeiten erweitert.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.G. dankt für die finanzielle Unterstützung durch das Rahmenprogramm H2020 der Europäischen Union durch den Europäischen Innovationsrat (IN-FET-Projekt, GA n. 862882, Arbor-IO-Projekt, FLAG-ERA und das Human Brain Project, ID 650003) und durch SISSA (Neuroscience Area). G.N. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung des italienischen Ministeriums für Universität und Forschung (MUR) durch das Stipendium Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Bereich Mathematik). Wir danken M. Gigante, B. Pastore und M. Grandolfo für ihre Unterstützung beim 3D-Druck, der Zellkultivierung und der Live-Bildgebung sowie Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente und H.C. Schultheiss für die Diskussionen. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-PropanolSigma-Aldrich650447
BB Cure Compact PolymerizerPCube SrlWellenlängen 365-405 nm, Leistung 120W
BioMed Amber Resin 1 LFormlabsHarz für die Montage der 3D-gedruckten Form an der Petrischale
Rinderserum AlbuminSigma-AldrichA9418
CAD-Anwendungssoftware SolidWorksDassault Systè mes SolidWorks Corporation, USFusion 360 (Autodesk Inc., USA), AutoCAD (Autodesk Inc., USA), PTC Creo (PTC Corp., USA), SolidWorks (Dassault Systè mes SolidWorks corp., USA) und Tinkercad (Autodesk Inc., USA).
                                                                --------------------------------------
Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Schulungen: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
D-AP5Tocris#0106
Deoxyribonuclease ISigma-AldrichD5025
DeScribeNanoscribe GmbH & Co.  KG
di-NatriumhydrogenphosphatSigma-Aldrich106585
GentamicinThermo Fisher15710049
Hanks′ Balanced SaltsSigma-AldrichH2387
HEPESSigma-AldrichH7523
PferdeserumSigma-AldrichH1138
in vitro MEA Aufzeichnungssystem MEA2000 miniMultichannel Systems GmBH, Reutlingen, Deutschland
IP-S PhotoresistNanoscribe GmbH & Co.  KG
KynurensäureSigma-AldrichK3375
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030081
MagnesiumsulfatSigma-AldrichM2643
MEA Recording Application Software (Experimenter)Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Deutschland
Minimum EssentialMedium Sigma-Aldrich51412C
NanoWriteNanoscribe GmbH & Co.  KG
ophthalmisches Stichmesser 15°;HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D-DruckerNanoscribe GmbH & Co. KG KGSN617
PlasmareinigerHARRICK PLASMA
Poly(ethylenimin)-LösungSigma-AldrichP3143
KaliumchloridSigma-AldrichP3911
Propylenglykolmethyletheracetat (PGMEA)Sigma-Aldrich484431
Repell-silan ESSigma-AldrichGE17133201
Kalknatron-ITO-beschichtete Substrate für 3D MF DiLLNanoscribe GmbH & Co.  KG
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS6014
NatriumchloridSigma-AldrichS9888
Substratintegrierte planare MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr)Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, DeutschlandTiN-Elektroden, SiN-Isolator, 4 interne Referenzelektroden, 120 Aufzeichnungselektroden, Elektrodenabstand 100 & Mikro; m, Elektrodendurchmesser 30 & Mikro; m
SYLGARD 184 KitDow Corning
TrypsinSigma-AldrichT1005
Trypsin-InhibitorSigma-AldrichT9003
Vakuumpumpe Einphasig asynchron 2 Pole CIMAMOTORI

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