Method Article

Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

DOI:

10.3791/66225

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March 29th, 2024

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1Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Institut für Biologie, Humboldt-Universität zu Berlin, 3Organoid platform, Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC)

In This Article

Summary

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Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.

Abstract

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In den letzten zehn Jahren hat sich die Einzelzell-Transkriptomik erheblich weiterentwickelt und ist zu einer Standardlabormethode für die gleichzeitige Analyse von Genexpressionsprofilen einzelner Zellen geworden, die die Erfassung der zellulären Vielfalt ermöglicht. Um die Einschränkungen durch schwer zu isolierende Zelltypen zu überwinden, kann für die Sequenzierung ein alternativer Ansatz verwendet werden, der darauf abzielt, einzelne Zellkerne anstelle von intakten Zellen zu gewinnen, wodurch das Transkriptom-Profiling einzelner Zellen universell anwendbar wird. Diese Techniken sind zu einem Eckpfeiler in der Erforschung von Gehirnorganoiden geworden und haben sie als Modelle des sich entwickelnden menschlichen Gehirns etabliert. Dieses Protokoll nutzt das Potenzial der Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomik in der Hirn-Organoidforschung und stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung dar, die wichtige Verfahren wie Organoid-Dissoziation, Einzelzell- oder Zellkernisolierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung umfasst. Durch die Implementierung dieser alternativen Ansätze können Forscher qualitativ hochwertige Datensätze erhalten, die die Identifizierung neuronaler und nicht-neuronaler Zelltypen, Genexpressionsprofile und Zelllinienverläufe ermöglichen. Dies ermöglicht umfassende Untersuchungen zellulärer Prozesse und molekularer Mechanismen, die die Entwicklung des Gehirns prägen.

Introduction

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In den letzten Jahren haben sich Organoidtechnologien als vielversprechendes Werkzeug für die Kultivierung organähnlicher Gewebe erwiesen 1,2,3. Gerade für Organe, die nicht leicht zugänglich sind, wie z.B. das menschliche Gehirn, bieten Organoide die Möglichkeit, Einblicke in die Entstehung und Krankheitsmanifestation zu gewinnen4. Daher wurden Gehirnorganoide häufig als experimentelles Modell zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen des menschlichen Gehirns verwendet, einschließlich Entwicklungs-, psychiatrischer oder sogar neurodegenerativer Erkrankungen 4,5,6.

Mit dem Aufkommen von Einzelzell-Transkriptom-Profiling-Technologien konnten primäre menschliche Gewebe und komplexe In-vitro-Modelle mit einer noch nie dagewesenen Granularität untersucht werden, was mechanistische Einblicke in Genexpressionsänderungen auf der Ebene von Zellsubpopulationen bei Gesundheit und Krankheit lieferte und über neue mögliche therapeutische Ziele informierte 7,8,9. Das Organoid-Feld hat sich weiterentwickelt, indem Einzelzell-Transkriptom-Profiling verwendet wurde, um die zelluläre Zusammensetzung, Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit von Organoid-Technologien im Gehirn zu beurteilen 10,11,12. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglichte die Zellklassifikation und die Identifizierung genetischer Dysregulation in erkrankten Organoiden13,14. Wichtig ist, dass die Komplexität von organoiden Geweben die Implementierung von Techniken erfordert, die die Profilerstellung einzelner Zellen ermöglichen. Die Charakterisierung von Organoiden mit Methoden wie dem Bulk Transcriptome Profiling (Bulk RNA Sequencing) führt zu maskierten zellulären Heterogenitäts- und Genexpressionsprofilen, die über alle Zelltypen innerhalb des komplexen Gewebes gemittelt werden, was letztendlich unser Verständnis der ablaufenden Prozesse während der Organoidentwicklung in Gesundheit und Krankheit einschränkt 15,16,17 . Mit der Weiterentwicklung der scRNA-seq-Methoden wird eine zunehmende Anzahl von Atlanten erstellt, wie z. B. der Allen Brain Atlas oder der Single cell atlas of human brain organoids von Uzquiano et al.18.

Die erfolgreiche Durchführung von scRNA-seq aus Gehirnorganoiden hängt von der effektiven Isolierung und dem Einfangen intakter Zellen ab. Da die Dissoziation von Gehirnorganoiden zur Gewinnung einzelner Zellen auf enzymatischer Verdauung basiert, kann sie die Genexpressionsmuster beeinflussen, indem sie Stress und Zellschäden induziert19,20. Daher ist die Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen der wichtigste Schritt. Ein alternativer Ansatz ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), die die enzymfreie Extraktion von Zellkernen sowohl aus frischem als auch aus gefrorenem Gewebe ermöglicht21,22. Die Isolierung von Zellkernen aus einem Gewebe bringt jedoch weitere Herausforderungen mit sich, wie z. B. die Anreicherung von Zelltypen von Interesse und den geringen RNA-Gehalt von Zellkernen im Vergleich zu Zellen.

Transkriptomstudien an Gehirnorganoiden werden häufig mit scRNA-seq 10,18,23 durchgeführt. Die Isolierung einzelner Kerne könnte jedoch eine orthogonale und ergänzende Methode zur Untersuchung des transkriptomischen Profils von Organoiden darstellen. Hier stellen wir eine Toolbox für scRNA- und snRNA-seq für Hirnorganoide vor und diskutieren die kritischen Punkte, um die besten Sequenzierungsdaten zu erhalten.

Protocol

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Das beschriebene Protokoll wird in einem Labor der Biosicherheitsstufe 1 des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin (Zulassungsnummer: 138/08) in Übereinstimmung mit den Anforderungen und in Übereinstimmung mit den EU- und nationalen Vorschriften zur Ethik in der Forschung durchgeführt.

1. Gewinnung von Vorderhirn-Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an mehreren verschiedenen iPS-Linien getestet, die in einer Vielzahl von Stammzellmedien verschiedener Unternehmen kultiviert wurden (Tabelle 1). Die Erzeugung von Vorderhirn-Organoiden hängt stark von qualitativ hochwertigen iPS-Zellen und einer Konfluenz von 60%-70% vor Beginn des Protokolls ab. Hier haben wir eine kommerziell erhältliche Zelllinie verwendet (siehe Materialtabelle).

  1. Tag 0: Bildung des embryoiden Körpers
    1. Für die Behandlung einer 96-Well-Platte mit pluronischer Lösung fügen Sie 80 μl steril gefilterte 2%ige pluronische Lösung pro Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte hinzu. Mindestens 15 min bei Raumtemperatur (RT) oder 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Mit Pluronic behandelte Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden und können ohne Waschschritte direkt für die Bildung von Embryoidkörpern verwendet werden.
    2. Entfernen Sie die pluronische Lösung aus jeder Vertiefung mit einem Aspirator oder einer Mehrkanalpipette, bevor Sie die Zellen aussäen.
    3. Bereiten Sie vor dem Start die folgenden Reagenzien für eine 96-Well-Platte vor: 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 mL vorgewärmtem DMEM: F12-Medium; 11 ml Stammzellmedium, ergänzt mit 50 μM Y-27632, pluronisch behandelte Platte (wie oben beschrieben).
    4. Aspirieren Sie Medien aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 60-70 % konfluenten iPSCs. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. 500 μl Reagenz auf Trypsinbasis zugeben und 2-6 min bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für die korrekte Ablösung von Zellen mit einem Reagenz auf Trypsinbasis hängt von der Zelldichte und den zellmatrixadhäsiven Eigenschaften jeder iPSC-Linie ab. Um eine Überverdauung zu vermeiden, wird empfohlen, die Zellmorphologie nach 2 Minuten Inkubation mit einem Reagenz auf Trypsinbasis mit einem Hellfeldmikroskop zu untersuchen.
    5. Nehmen Sie die Zellen mit einer 1000-μl-Pipette ab und geben Sie sie in das zuvor vorbereitete 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit DMEM:F12-Medium, um die Dissoziation zu stoppen.
    6. Zentrifugenzellensuspension für 3 min bei 300 x g. Überstand aspirieren und Zellpellet aufbewahren. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Stammzellmedium, das mit 50 μM Y-27632 ergänzt ist.
    7. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und geben Sie die gewünschte Anzahl von Zellen zu den Stammzellmedien, die mit 50 μM Y-27632 ergänzt sind. Für die Erzeugung eines einzelnen Embryoidkörpers werden je nach Zelllinie 3.000 bis 12.000 Zellen benötigt.
    8. Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 10-ml-Pipette in ein Mehrkanal-Reagenzreservoir. Mit einer Mehrkanalpipette 100 μl/Well der Zellsuspension in die zuvor mit Pluronik behandelte 96-Well-Platte einfüllen.
    9. Die 96-Well-Platte bei 37 °C, 5 % O2 und 5 % CO2 in einen Inkubator stellen. Um Störungen während der Körperbildung von Embryoiden zu vermeiden, sollten Sie die Platte nicht bewegen.
  2. Tag 2: Untersuchung der Embryoidkörperbildung
    1. Untersuchen Sie die Körperbildung von Embryoiden mit einem 10-fach-Objektiv eines Hellfeldmikroskops. Embryoidkörper sollten klare Kanten und minimalen Zelltod aufweisen.
    2. Aspirieren Sie so viel Medium wie möglich und ersetzen Sie es durch 100 μl/Vertiefung Stammzellmedium. (Kritisch) Embryoidkörper lassen sich während des Medienaustauschs leicht aus der Vertiefung entfernen. Achten Sie darauf, sie nicht zu entfernen, überwachen Sie daher das Medium nach der Aspiration.
  3. Tag 3: Neuroektoderm-Induktion
    1. Saugen Sie so viel Medium wie möglich an und ersetzen Sie es durch 120 μl/Vertiefung Induktionsmedium und setzen Sie die Platte bei 37 °C, 20 % O2 und 5 % CO2 ein.
  4. Tag 6: Einbettung
    1. Abhängig von der iPSC-Linie sind 3 oder 4 Tage erforderlich, um das Auftauchen des Neuroektoderms zu induzieren. Überwachen Sie die Embryoidkörper regelmäßig. Sobald die Ränder hell werden, sind die embryoiden Körper bereit für die Einbettung. Verwenden Sie eine der beiden verschiedenen Methoden, die für die Einbettung des Embryoidkörpers verwendet werden können, wie unten beschrieben24.
    2. Einbettungsmethode 1: Einbettung von Cookies
      1. Tauen Sie ein Aliquot des unverdünnten extrazellulären Matrixgels 1-2 Stunden lang auf Eis auf. (Kritisch) Bewahren Sie extrazelluläres Matrixgel immer auf Eis auf, um eine Verfestigung zu verhindern. Bereiten Sie Aliquote im Voraus vor, um die Auftauzeit und wiederholte Auftauzyklen zu minimieren.
      2. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipette mit einer Krallenzange ab und sammeln Sie 16-32 Embryoidkörper in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. Übertragen Sie die Embryoidkörper in 67 μl des Mediums in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. 100 μl extrazelluläres Matrixgel mit einer abgeschnittenen 200 μl Pipettenspitze zugeben und vorsichtig mischen.
      4. Verteilen Sie die Embryoidkörper gleichmäßig in einer 6 cm großen Schale und stellen Sie die Platte für 5-10 Minuten auf, damit sich das extrazelluläre Matrixgel verfestigen kann.
      5. Etwa 4 ml Differenzierungsmedium zugeben und bei 37 °C, 20 % O2 und 5 % CO2 inkubieren. Stellen Sie die Schale am nächsten Tag auf einen Orbitalschüttler (84 U/min). Stellen Sie sicher, dass sich alle embryoiden Körper von der Unterseite lösen. Wenn nicht, verwenden Sie eine abgeschnittene Pipettenspitze und ein abgeschnittenes Medium, um sie vorsichtig zu lösen.
    3. Einbettungsmethode 2: Flüssiges Einbetten
      1. Tauen Sie ein Aliquot des unverdünnten extrazellulären Matrixgels 1-2 h auf Eis auf und legen Sie das Differenzierungsmedium auf Eis. (Kritisch) Das Medium muss eiskalt sein, wenn extrazelluläres Matrixgel hinzugefügt wird.
      2. Sobald das Medium kalt ist, fügen Sie extrazelluläres Matrixgel bis zur Endkonzentration von 2% hinzu. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipette mit einer Krallenzange ab und übertragen Sie bis zu 24 Embryoidkörper in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
      3. Entfernen Sie alle überschüssigen Medien und geben Sie etwa 4 ml 2% extrazelluläres Matrixgel/Differenzierungsmedium in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Stellen Sie die Platte sofort auf den Orbitalschüttler (84 U/min).
  5. Tag 9-20: Führen Sie alle 3-4 Tage einen vollständigen Medienaustausch mit Differenzierungsmedien durch.
  6. Tag 21-30: Übertragen Sie die Organoide in das Reifungsmedium und führen Sie alle 3-4 Tage einen vollständigen Medienaustausch durch.
  7. Dissoziation von Organoiden: Verwenden Sie für die Dissoziation von Einzelkernen und Zellen Organoide von hoher Qualität. Um übermäßige Mengen an Zelltod zu vermeiden, schneiden Sie die Organoide regelmäßig ab, um die Bildung eines nekrotischen Kerns zu verhindern, und lassen Sie sie sich 2 Wochen lang erholen, bevor Sie sie für die weitere Analyse dissoziieren.

2. Ableitung einer Einzelzelle aus Organoiden

HINWEIS: Die Einzelzelldissoziation wird mit dem Neural Tissue Dissociation Kit (Tabelle 2) durchgeführt, das eine mechanische und enzymatische Dissoziation verwendet. Hier beschreiben wir eine manuelle mechanische Dissoziation. Alternativ kann eine Dissoziationsmaschine verwendet werden.

  1. Bereiten Sie die STOP-Lösung und 0,04 % BSA auf Eis vor. Enzymmischung 1 und 2 und 0,04% BSA in PBS zubereiten und auf Eis legen.
  2. Sammeln Sie bis zu 5 Organoide in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, aspirieren Sie überschüssige Medien und waschen Sie sie einmal mit PBS, um das Kulturmedium zu entfernen. Organoide in die Mitte der Vertiefung legen und mit einem Skalpell die Organoide gründlich zerkleinern.
  3. Enzymmix 1 zugeben und bei 37 °C, 20 % O2 und 5 % CO2 10-15 min bei 90 U/min schütteln.
  4. Mit einer 1000-μl-Pipettenspitze können Sie Organoide resuspendieren, indem Sie bis zu 10x pipettieren. Fügen Sie die Enzymmischung 2 hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie sie mit einer 1000-μl-Pipettenspitze pipettieren. Bei 37 °C, 20 % O2 und 5 % CO2 unter 10-15 min bei 90 U/min schütteln.
  5. Stoppen Sie den Dissoziationsprozess, indem Sie die Zelllösung in 10 ml kalter STOP-Lösung resuspendieren. Filtrieren Sie die Zelllösung mit einem 70 μM Zellsieb. Die filtrierte Zelllösung 10 min bei 300 x g bei 4 °C zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden.
  6. Aspirieren Sie das Medium, hinterlassen Sie ein Zellpellet und resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml kaltem 0,04 % BSA. Filtrieren Sie die Zelllösung mit einem 40 μM Zellsieb und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler.
  7. Die Zelllösung wird 10 min lang bei 300 x g bei 4 °C zentrifugiert. Aspirieren Sie die BSA-Lösung, wobei ein Zellpellet übrig bleibt. Resuspendieren Sie Zellen gemäß einem mikrofluidikbasierten snRNA-seq-Kit-Handbuch im NSB+-Medium.

3. Isolierung einzelner Zellkerne aus Organoiden

  1. Organoide in gekühltes PBS überführen und jedes Organoid in 4 Stücke schneiden. Organoide 2x mit gekühltem PBS waschen.
  2. Schneiden Sie mit einer Schere die Pipettenspitze einer 1000 μL Pipette ab und geben Sie Organoidstücke in einen 2 mL Douncer. Aspirieren Sie PBS vollständig und fügen Sie 1 ml NP40-Lysepuffer hinzu.
  3. 3x mit Stößel A und 3x mit Stößel B übergehen. Suspension in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Douncer mit zusätzlich 1 mL NP40 Lysepuffer waschen und in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. 5 min bei RT inkubieren und anschließend die Suspension 5 min bei 500 x g zentrifugieren .
  4. Überstand aspirieren, wobei 50 μl Überstand zurückbleiben. Fügen Sie 1 ml NSB+ hinzu, ohne das Pellet zu stören. Nach 5 Minuten Inkubation wieder suspendieren.
  5. Schichtsuspension auf einem Percoll-Gradienten (untere Schicht: 1 mL NSB+ und 250 μl Percoll, mittlere Schicht: 1 mL NSB+ und 188 μl Percoll, obere Schicht: 1 mL NSB+ und 125 μl Percoll). (Kritisch) Führen Sie die Schichtung sehr sorgfältig durch, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
  6. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren, Überstand aspirieren und in NSB+ resuspendieren. Filtrieren Sie die Kernlösung mit einem 40 μM Zellsieb.
  7. Färben und Zählen von Kernen mit DAPI und einer Neubauer-Kammer. Resuspendieren Sie Zellkerne gemäß einem mikrofluidikbasierten scRNA-seq-Kit-Handbuch.

4. Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek

  1. Laden Sie 10.000 Zellen und Zellkerne in ein Mikrofluidik-System und generieren Sie die Bibliothek gemäß dem Handbuch des mikrofluidikbasierten scRNA-seq-Kits (Table of Materials).
  2. Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit geschätzten 6 x 108 Reads pro snRNA-seq-Bibliothek und 1,6 x 108 Reads pro scRNA-seq-Bibliothek, was zu einer Sequenzierungssättigung von 87 % für den snRNA-seq-Datensatz und 36 % Sequenzierungssättigung für den scRNA-seq-Datensatz führt.

5. Analyse

  1. Führen Sie die Analyse der Sequenzierung mit einer Datenanalyse-Pipeline für scRNA-seq und snRNA-seq durch und richten Sie sie mit dem menschlichen GRCh38-Genom ab. Prüfen Sie die von dieser Pipeline generierte Zählmatrix einer weiteren Analyse mit dem R-Paket Seurat (Version 4.1.1)25.
  2. Erstellen Sie das Seurat-Objekt, indem Sie Gene berücksichtigen, die in mindestens 5 Zellen vertreten waren, und Zellen integrieren, die mindestens 300 Gene enthalten. Führen Sie eine zusätzliche Qualitätskontrollfilterung durch, indem Sie Zellen zurückhalten, die mehr als 1000 Gene, aber weniger als 4000 Gene für den scRNA-seq-Datensatz und mehr als 800, aber weniger als 4000 Gene pro Zellkern für den snRNA-seq-Datensatz enthielten. Ausschließen von Datensätzen, Zellen und Zellkernen mit mehr als 5 % mitochondrialen Lesevorgängen.
  3. Um Batch-Effekte zwischen beiden Methoden zu vermeiden, integrieren Sie beide gefilterten Datensätze, normalisieren und visualisieren Sie sie über Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Lassen Sie Cluster 1 aus, der einen niedrigen Unique Molecular Identifier (UMI) und eine niedrige Genanzahl aufweist. Anschließend werden für die Cluster Zellidentitäten basierend auf bekannten Markergenen und dem 30 Tage alten Organoid-Datensatz von Ana Uzquiano et. al. (Ergänzende Kodierungsdatei 1)18.

Results

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Um die Zelltypzusammensetzung von Hirnorganoiden mit scRNA-seq und snRNA-seq zu untersuchen, wurden Hirnorganoide nach 30-tägiger Kultur geerntet, da Organoide in diesem Stadium bereits neuroepitheliale Schleifen aufweisen, die aus Vorläufern bestehen, die von intermediären Vorläuferzellen und Neuronen im Frühstadium umgeben sind 4,18. Die Überwachung der Qualität der Organoide während des gesamten Wachstums und der Kultivierung ist unerlässlich, um zuverlässige Einzelzell- und Einzelkerndaten zu erhalten.

Organoide werden durch die Aggregation von iPSCs zu embryoiden Körpern gebildet (Abbildung 1B,C). Es wird erwartet, dass diese embryoiden Körper nach dem Zusammenbau klare Kanten mit minimalen Zelltrümmern aufweisen (Abbildung 1C). Nach der Induktion des Neuroektoderms zeigen die embryoiden Körper eine beobachtbare Aufhellung um die Oberfläche herum mit einer vergleichsweise dunkleren inneren Region, was auf eine erfolgreiche neuronale Induktion hinweist (Abbildung 1D). In den folgenden Wochen entwickeln die Organoide sogenannte Loops, neuronale rosettenartige Strukturen, die hauptsächlich aus Neuroepithelzellen bestehen (Abbildung 1E,F). Obwohl diese Organoide über mehrere Monate in Kultur gehalten werden können, ist zu beachten, dass es mit zunehmender Größe zu einer entsprechenden Zunahme des Zelltods im inneren Teil der Organoide aufgrund des Mangels an Nährstoffen und Sauerstoffverfügbarkeit kommt, was schließlich zur Entwicklung eines nekrotischen Kerns führt.

Um die zelluläre Diversität innerhalb kortikaler Organoide durch Sequenzierungsanalyse zu untersuchen, haben wir sowohl Einzelzellen als auch Zellkerne aus Organoiden isoliert. Um die inhärente Heterogenität innerhalb einer einzigen Charge von Gehirn-Organoiden auszugleichen, führten wir eine Sequenzierung von vier gepoolten Organoiden aus einer Charge durch. Zusätzlich wurden diese Organoide zu Vergleichszwecken zwischen den Isolierungsprozessen und um Batch-Effekte zwischen der snRNA-seq- und der scRNA-seq-Bibliothek zu eliminieren, in zwei Hälften geteilt (insgesamt acht Hälften; Abbildung 2). Nach der enzymatischen Isolierung einzelner Zellen ist es entscheidend, sicherzustellen, dass die Zellviabilität über 80% bleibt, wobei zu beobachten ist, dass die Zellen eine runde Morphologie beibehalten (Abbildung 3A,B). In ähnlicher Weise sollte die mechanische Isolierung einzelner Kerne intakte Kerne unterschiedlicher Größe mit minimalen bis keinen nachweisbaren Trümmern ergeben (Abbildung 3C,D).

Die Sequenzierungsanalyse zeigte, dass mehr Zellen als Zellkerne gefangen und sequenziert wurden. Beide Datensätze zeigten eine gute Qualität, die durch die hohe Gen- und UMI-Anzahl pro Zelle und Zellkern und den geringen Prozentsatz der mitochondrialen Reads beurteilt wurde (Abbildung 4A-C). Wie erwartet, machen sowohl mitochondriale als auch ribosomale Reads einen höheren Anteil der Gesamtreads aus, die im scRNA-seq-Datensatz im Vergleich zum snRNA-seq-Datensatz wiedergefunden wurden. Im scRNA-seq-Datensatz enthielten die meisten Zellen weniger als 30 % ribosomale Reads, während im snRNA-seq-Datensatz die Mehrheit der Zellkerne weniger als 5 % ribosomale Reads enthielt. Darüber hinaus enthält die Mehrheit der im scRNA-seq-Datensatz erfassten Zellen weniger als 5 % mitochondriale Reads. Nach dem Herausfiltern der mitochondrialen Reads erreichten rund 10.000 Zellen und 3.000 Zellkerne die Qualitätsschwelle.

Die integrative Analyse beider Datensätze ergab, dass alle Cluster in beiden Datensätzen vertreten sind, was darauf hindeutet, dass beide Methoden dieselben Zelltypen wiederherstellen (Abbildung 5A,C). Die Annotation des Datensatzes zeigt, dass die Hauptzellpopulationen aus radialen Gliazellen, intermediären Vorläuferzellen, subkortikalen Vorläuferzellen und Neuronen sowie neugeborenen Tiefenschichtprojektionsneuronen und weniger repräsentierten Zelltypen wie Cajal-Retzius, dem kortikalen Saum und den Plexus choroideus bestehen (Abbildung 5B). Insgesamt konnten mit scRNA-seq und snRNA-seq alle Zelltypen wiederhergestellt werden, von denen erwartet wird, dass sie in einem 30 Tage alten Gehirnorganoid vorhanden sind20.

Zeitleiste der Embryoidkörperbildung bis zur Reifung; Mikroskopie-Bilder; Stadien der Zelldifferenzierung.
Abbildung 1: Erzeugung von Hirnorganoiden aus iPSCs. Zeitverlauf der Bildung von Organoiden im Gehirn (A). Beispielhafte Bilder einer erfolgreichen kortikalen Differenzierung von iPSCs (B), die Embryoidkörper bilden (72 h nach der Aussaat) (C) und eine erfolgreiche neuronale Induktion nach 7 Tagen Kultur zeigen (D). Organoid zeigt deutliche Schleifen an Tag 15 (E) und Tag 30 (F). Maßstabsleiste: B-D 200 μm, E 400 μm, F 800 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Einzelzell- und Zellkern-RNA-Sequenzierungsdiagramm; Enzymatische Dissoziation, Percoll-Gradienten-Methode.
Abbildung 2: Arbeitsablauf zur Gewinnung von Einzelzellen und Einzelkernen aus Hirnorganoiden. Die Dissoziation der Organoide in einzelne Zellen erfolgt durch Zerkleinern der Organoide mit einem Skalpell, gefolgt von einem enzymatischen Aufschluss (oben). Die Isolierung der Zellkerne erfolgt durch mechanische Dissoziation, gefolgt von der Reinigung über einen Percoll-Gradienten (unten). Die Einzelzell- und Zellkernsuspension werden filtriert und in ein Mikrofluidiksystem geladen, um die Bibliothek zu generieren und zu sequenzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zellmikroskopische Bilder, die verschiedene Zelldichten und Färbemuster zeigen; Die Methode beinhaltet das Färben.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse von isolierten Zellen und Zellkernen aus 30 Tage alten Organoiden. (A) Beispielhaftes Bild von Trypanblau-gefärbten Zellen, aufgenommen mit einem Zellzähler und (B) entsprechende Nahaufnahme. (C) Überlagerung eines Hellfeld- und Fluoreszenzbildes von DAPI-gefärbten Kernen und (D) entsprechende Nahaufnahme. Maßstabsleiste: 100 μM Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Violin-Diagramme, die die Datenvariabilität nach Identität zeigen; statistische Analyseergebnisse.
Abbildung 4: Qualitätskontrolle von scRNA- und snRNA-seq. Violin-Diagramme veranschaulichen die absolute UMI-Zahl (A), Genzahl (B), mitochondriale (C) und ribosomale Lesewerte (D) von Zellen (blau) und Zellkernen (rosa-violett). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

UMAP-Diagramm mit scRNAseq- und snRNAseq-Clustern, Genexpressionsanalyse in neuronalen Zellen.
Abbildung 5: scRNA-seq und snRNA-seq gewinnen ähnliche Zellpopulationen in 30 Tage alten Organoiden. Integrierte eingebettete UMAP von 30 Tage alten Organoiden, die scRNA-seq- (blau) und snRNA-seq-Ergebnisse (rosa-violett) (A) zeigen, integriert und annotiert sowie individuelle Profile von scRNA-seq und snRNA-seq (B,C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zellkulturmedien und Beschichtungskomponenten Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Dissoziationspuffer für scRNA und snRNA-seq. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Codierungsdatei, die zur Analyse der scRNA-seq- und snRNA-seq-Daten verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

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Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen und einzelner Zellkerne hat sich zu einem zentralen Werkzeug für das Verständnis der genregulatorischen Mechanismen in komplexen Geweben entwickelt. Beide Methoden ermöglichen Transkriptom-Untersuchungen von Hirnorganoiden. Um einen insgesamt erfolgreichen Versuch zu gewährleisten, ist die Qualität des Ausgangsmaterials von hoher Relevanz. Daher ist es notwendig, die Organoide regelmäßig zu schneiden, um die Bildung eines nekrotischen Kernszu verhindern 26. Es ist auch möglich, dieses Problem mit einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur27 zu beseitigen. Um Batch-Effekte aufgrund der Heterogenität der Organoide zu reduzieren, empfehlen wir, mindestens vier Organoide pro Extraktion zu verwenden. Alternativ ist es möglich, mehrere Sequenzierungsläufe einzelner Organoide durchzuführen, was zusätzlich die Untersuchung der Variabilität innerhalb derselben Chargeermöglicht 17. Bei gleichzeitiger Anwendung beider Methoden, scRNA-seq und snRNA-seq, können durch das parallele Teilen von Organoiden und deren Aufteilung für jede Methode die durch die Heterogenität der Organoide verursachten Unterschiede weiter reduziert werden.

Um ein qualitativ hochwertiges Transkriptomprofil einer einzelnen Zelle oder eines Zellkerns zu erhalten, ist es entscheidend, dass die Zell- oder Kernmembran während des gesamten Verfahrens intakt bleibt. Daher ist es entscheidend, sowohl die Enzymkonzentration als auch den Zeitpunkt der enzymatischen Verdauung zu optimieren, die an das Alter und die Größe des Organoids angepasst werden müssen. Darüber hinaus ist es wichtig, die richtigen Temperaturen und Zentrifugationsgeschwindigkeiten zu verwenden und hartes Pipettieren zu vermeiden. Bei geringer Lebensfähigkeit kann nach der Dissoziation der Organoide in einzelne Zellen ein Kit zur Entfernung toter Zellen verwendet werden. Komplementär ist es für die Isolierung von Zellkernen wichtig, das Organoid sorgfältig mit PBS zu waschen und die Anzahl der Hübe mit dem Douncer an die Größe des Organoids anzupassen. Es ist auch wichtig, den Percoll-Gradienten sorgfältig zu schichten, um Störungen in der Schichtung zu vermeiden. Wenn nach der Isolierung beschädigte Zellkerne übrig bleiben, wird empfohlen, einen Sortierschritt über die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung22 durchzuführen. Insgesamt ist der Einsatz von RNAse-Inhibitoren für alle Schritte von der Probendissoziation bis zur Bibliotheksgenerierung von entscheidender Bedeutung, um die qualitativ hochwertige RNA jeder Zelle oder jedes Zellkerns zu erhalten.

In dieser Studie ergab scRNA-seq mehr Zellen, was einen breiteren Überblick über die Zellpopulationen ermöglicht. Darüber hinaus enthalten Zellen mehr RNA und sind im Vergleich zu Zellkernen durch Oberflächenmarker leichter für bestimmte Zelltypen anzureichern. Die Dissoziation einzelner Zellen beruht jedoch auf einem enzymatischen Prozess, der die Transkription von stressbezogenen RNAs induzieren kann 19,28. Insbesondere bei Erkrankungen, die mit einer erhöhten Stressreaktion einhergehen, kann dies zu dissoziationsinduzierten Artefakten führen20. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Isolierung einzelner Zellen zum Verlust empfindlicher Zellpopulationen führte 3,29. Obwohl dies in dieser Studie möglicherweise nicht offensichtlich ist, ist es ein mögliches Ergebnis bei der Verwendung älterer Gehirnorganoide, die sich durch eine höhere zelluläre Diversität auszeichnen.

Da beide Datensätze die gleichen Zellpopulationen gewinnen, hängt die Wahl der Isolationsmethode stark von Forschungsfragen, Gewebeakquisition und Zeitmanagement ab. Während nach der Dissoziation die Fixierung und Lagerung einzelner Zellen aus Hirnorganoiden in Methanol gut etabliert ist30, muss die Isolierung einzelner Zellkerne aus gefrorenen Hirnorganoiden noch optimiert werden.

Insgesamt bieten unsere Protokolle eine vielseitige und anpassungsfähige Plattform, um das transkriptomische Profil einzelner Zellen und Zellkerne in Gehirnorganoiden zu untersuchen und ebnen den Weg für eingehende Untersuchungen entwicklungs- und krankheitsbezogener Fragen in den In-vitro-Modellen des menschlichen Gehirns.

Disclosures

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Acknowledgements

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Wir danken Valeria Fernandez-Vallone für die Originalanleitung für das Miltenyi Neural Dissociation Kit. Wir danken auch der Genomics Technology Platform des Max Delbrück Centrums für die Bereitstellung des Rezepts für den NP40-Lysepuffer und die wertvolle Beratung bei der Einrichtung dieses Protokolls. Wir danken auch Margareta Herzog und Alexandra Tschernycheff für die organisatorische Unterstützung des Labors.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma  43816-10ML
1,5 ml DNA-Röhrchen mit geringer Bindung VWR525-0130Mikrozentrifugenröhrchen
10x Cellranger Rohrleitung Analysepipeline
15 ml FalconFalconZentrifugenröhrchen
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconZentrifugenröhrchen
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotikum/Antimykotische Lösung (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement ohne Vitamin ALife Technologies12587010
Rinderserumalbumin, fettsäurefrei (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Zellsieb 40 & micro; mNeolab352340
Zellsieb 70 & Mikro; m (weiß) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Weiter GEM Zubehör-Kit10X Genomics1000204
Chrom Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chrom Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-freier Proteasehemmer CocktailRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce Tissue Grinder Set 2 mL komplettSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Zellzählung ObjektträgerVWREVS-050 ( 734-2676)
Fötales Rinderserum tetracyclinfrei (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-frei (Beschichtung)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi BiotecDissoziationsmaschine
GlutaMAX ergänztLife Technologies35050038
Heparin-Natrium-ZellkulturtestsSigmaH3149-10KU
humane rekombinante BDNFStemCell Technologies78005.3
humane rekombinante GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulinlösung HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout-SerumersatzLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochlorid 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM nicht-essentielle Aminosäure (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesiumchlorid (1M) RNAse-freiThermo WissenschaftlicheAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276Stammzellmedium
mTeSR1StemCell Technologies85850Stammzellmedium
N2 Ergänzung StemCell Technologies17502048
Dissoziationskit für neuronales GewebeMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 SystemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps WaschmittelLösung Life Technologies28324
PBS Dulbecco' sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife TechnologiesEO0382
Gesteinsinhibitor (Y-27632 Dihydrochlorid) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Natriumchlorid NaCl (5M), RNase-frei-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401Stammzellmedium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Stammzellmedium
TC-Platte 96 Well, runder BodenSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzym, ohne PhenolrotLife Technologies12604013Trypsin-basiertes Reagenz
UltraPure 1M Tris-HCl Puffer, pH 7,5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life SciencesBML-WN100-0005

References

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Single Cell TranscriptomicsSingle Nuclei TranscriptomicsBrain OrganoidsOrganoid DissociationNuclei IsolationLibrary PreparationRNA SequencingSpatial TranscriptomicsCell Type RecoveryGene Expression Profiles

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