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Methodenartikel

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

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DOI:

10.3791/66229

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18. April 2025

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1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Organoide revolutionieren die personalisierte Gewebemodellierung für die Organentwicklung, Wirkstoffforschung und Krankheitsforschung. Die Organoid-Technik schreitet voran und führt zur Herstellung komplizierter synthetischer Gewebe. Ziel ist es, Morphogenese, Assembloid-Technologie und Biomatrizen zu integrieren, um das Tissue Engineering voranzutreiben. Dieses Protokoll hilft bei der Modellierung der Leberorganogenese und der Festlegung von Richtlinien für den Aufbau synthetischer Gewebe.

Zusammenfassung

Chronische Lebererkrankungen haben epidemische Ausmaße erreicht und betreffen weltweit über 800 Millionen Menschen. Die derzeitige Behandlung, die orthotope Lebertransplantation, hat mehrere Einschränkungen. Auf dem Gebiet der regenerativen Lebermedizin haben sich vielversprechende Lösungen herauskristallisiert, wobei die Leberorganogenese ein erhebliches Potenzial birgt. Die frühe Organogenese der Leber, die zwischen E8.5 und 11.5 stattfindet, beinhaltet die Bildung von epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen, die zur Morphogenese, zur Bildung des Leberstrangs und zur kollektiven Migration führen. Es fehlen jedoch Methoden zur In-vitro-Modellierung dieses Prozesses. In dieser Arbeit wird eine detaillierte Reihe von Methoden vorgestellt, die es ermöglichen, verschiedene Stadien und Aspekte der Leberorganogenese mit humanen Zelllinien zu modellieren. In einer Methodenreihe wird die Assembloid-Technologie mit hepatischen (HEP) und mesenchymalen (MES) Sphäroiden verwendet, die frühe Strukturen der Leberorganogenese repliziert, die frühe Morphogenese modelliert und die interstitielle Zellmigration in vivo demonstriert. Diese innovativen Assembloid-Systeme helfen bei der Identifizierung von Faktoren, die die Bildung und Migration von Assembloiden beeinflussen. HEP-Sphäroid-Kultivierungssysteme wurden auch eingesetzt, um die kollektive Migration und die Verzweigungsmorphogenese zu modellieren. Mesenchymalkonditionierte Medien (M-CM) spielen eine wichtige Rolle bei der Initiierung der dosisabhängigen Verzweigungsmigration. Alle vorgestellten Methoden erwiesen sich als hochgradig reproduzierbar mit einer hohen Erfolgsquote. Durch die Verknüpfung dieser Ereignisse wird unsere Arbeit die Nachbildung sequentieller, morphogenetischer Ereignisse ermöglichen, um die Organogenese in vitro und in vivo zurückzuentwickeln.

Einleitung

Die Migration von Leberzellen spielt eine bedeutende Rolle bei der Organogenese, Krankheit und Zelltherapie der Leber. Während der Leberorganogenese (E8.5-9.0, Maus) beginnt das ventrale prähepatische Epithel des Vorderdarms, Lebergene aufgrund induktiver Signale zu exprimieren, die vom umgebenden Mesenchym und vom Herzen ausgehen. Bei E9.0 verdickt sich das Epithel des Vorderdarms, wenn die Zellen von einer quaderförmigen zu einer pseudostratifizierten säulenförmigen Morphologie übergehen und das Leberdivertikel bilden1,2. In diesem kritischen Stadium besteht das Leberdivertikel aus nur ~1.500 Zellen. Als nächstes verdickt sich das hepatische Endoderm, das das Leberdivertikel auskleidet, delaminiert und bildet Stränge aus wandernden Hepatoblasten (HBs). Diese HBs wandern gemeinsam mit Endothelzellen und mesenchymalen Zellen, verzweigen sich in das umgebende mesenchymale Gewebe und initiieren eine dreidimensionale kollektive Zellmigration, um die Leberknospe zu bilden3,4. Tatsächlich durchlaufen Zellen in diesem Stadium kollektiv (1) Co-Migration oder Bewegung zusammen mit anderen Zelltypen, (2) verzweigte Morphogenese oder Bildung verzweigter röhrenartiger Strukturen und (3) interstitielle Migration oder Migration auf oder zwischen anderen Zellen. Bei E11.5 hört die Migration auf, und die primitive Leber hat sich gebildet und expandiert um das 10-3-fache3. Die Migration von Leberzellen kann auch in späteren Stadien der Leberorganogenese erforderlich sein, da die Expression der HBs von Ratten Hinweise auf stark hochregulierte Gene gezeigt hat, die mit kollektiver 3D-Zellmigration, Morphogenese und dem Umbau der extrazellulären Matrix verbunden sind5. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der frühen Organogenese der Leber ist die kollektive 3D-Migration eng mit der lokalen Ausbreitung und Metastasierung des fortgeschrittenen hepatozellulären Karzinoms (HCC) verbunden, was letztendlich zu einer verschlechterten Prognose und einer erhöhten Behandlungsresistenz führt6. Adulte und fetale Hepatozyten nutzen ebenfalls eine kollektive Migration, wenn sie sich während der Leberrepopulation von der Milz in die Leber bewegen. In-vivo-Bildgebungsstudien haben gezeigt, dass transplantierte Hepatozyten innerhalb von Stunden in die Pfortader und dann in die Kapillaren gelangen und über die Lebersinusoide und durch das Lebergewebe wandern7,8,9. Schließlich zeigen neuere Studien, dass migrierende HBs während der Leberregeneration von Mäusen und Menschen entstehen, mit einigen Hinweisen auf Bewegungen in Sheets10. Insgesamt spielt die kollektive Migration der Leber, die zu mehreren Modi der Morphogenese fähig ist, eine wichtige Rolle bei der Organogenese, Krebs, Hepatozytenzelltherapie und Leberregeneration.

Zahlreiche genetische Studien haben die molekularen Wege untersucht, die der kollektiven 3D-Zellmigration der Leber zugrunde liegen. Diese Studien zeigen, dass das Fehlen von Lebersträngen die Leberbildung behindert, was die Notwendigkeit der Leberstrangbildung und ihrer Wechselwirkungen mit unterstützenden Zellen für die Leberbildung unterstreicht1,11,12,13. Diese Studien zeigen auch, dass das Leberwachstum durch verschiedene Faktoren ausgelöst wird, darunter FGF-2, das vom kardialen Mesoderm sezerniert wird, BMP4, das vom umgebenden Mesenchym sezerniert wird, HGF und Endothelzellinteraktionen. Darüber hinaus spielen migrationsassoziierte Transkriptionsfaktoren, einschließlich HEX, PROX1 und TBX3, eine entscheidende Rolle2,14. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass genetische Studien den Beweis erbringen, dass die Signalübertragung löslicher Faktoren, die zur Expression von Transkriptionsfaktoren führt, die Migration, die Signalübertragung und die molekularen Wechselwirkungen zwischen HBs und ihrem umgebenden Mesenchym antreibt.

Obwohl die Zellmigration in der frühen Leberorganogenese ausgiebig untersucht wurde, verwenden aktuelle in vitro Studien zur Lebermigration häufig 2D-Assays mit hochmigratorischen HCC-Zellen neben in vivo Tumormodellen15. Diese Studien haben Einblicke in mehrere Faktoren gegeben, die die Lebermigration beeinflussen, darunter TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 und miRNAs21,22,23. Obwohl bemerkenswerte Fortschritte beim Verständnis der molekularen Mechanismen bei der 3D-Leberzellmigration erzielt wurden, deuten die deutlichen Unterschiede zwischen 2D- und 3D-Zellmigration darauf hin, dass 2D-Assays inhärente Einschränkungen aufweisen. Darüber hinaus fehlen in diesen Modellen oft die Einbeziehung von mesenchymalen Zelltypen, die sowohl für die Migration als auch für das Wachstum unerlässlich sind. Obwohl es Fortschritte bei der Entwicklung von 3D-Modellen für die Lebermigration gegeben hat, die das unterstützende Mesenchym integrieren, konzentrieren sich diese Modelle in erster Linie auf die Komigration, anstatt die verschiedenen Arten der kollektiven Migration zu erforschen.

Die Fähigkeit, Gewebe aus Sphäroiden durch verschiedene Selbstorganisation und morphogenetische Prozesse zu erzeugen, erleichtert die wissenschaftliche Erforschung synthetischer Gewebe. Diese Gewebe haben breite Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und im Screening, in der Krankheitsmodellierung, in der Therapie und in anderen biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen. Es werden die methodischen Details mehrerer 3D-In-vitro-Kultivierungssysteme vorgestellt, die so entwickelt wurden, dass sie unterschiedliche Modi der kollektiven 3D-Migration der Leber aufweisen. Diese Systeme umfassen (1) Co-Sphäroid-Kultur mit HEP- und MES-Sphäroiden in einer Matrix, (2) HEP-Sphäroid-Matrix-Tröpfchen, die mit M-CM kultiviert wurden, (3) HEP-MES-gemischte Sphäroide und (4) HEP-Sphäroid-Matrix, die mit einer hohen Dichte an MES-Zellen kultiviert wurde. Diese Systeme ermöglichen eine robuste Modellierung der kollektiven Migration der Leber in einer 3D-Umgebung und verbessern so unser Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die der Leberorganogenese, Krebs und Therapie zugrunde liegen.

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Protokoll

Die Details der Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die in diesem Artikel verwendeten Abkürzungen sind in der Zusatzdatei 1 definiert.

1. Herstellung von 1%iger Agaroselösung mit niedrigem Elektroendosmosegehalt (EEO)

  1. 2,5 g Agarosepulver mit niedrigem EEO-Gehalt abwiegen und in ein Becherglas umfüllen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Becherglas mindestens doppelt so groß ist wie das gewünschte Volumen, um die Blasenbildung während der Lösungsvorbereitung zu ermöglichen.
  2. Verwenden Sie einen Messzylinder, um 250 mL destilliertes Wasser abzumessen, und gießen Sie es in das Becherglas, wobei eine Endkonzentration (w/v) von 1 % angestrebt wird.
  3. Decken Sie die Öffnung des Becherglases mit Plastikfolie ab und lassen Sie ein kleines Loch zur Belüftung. Den Becher in der Mikrowelle 30 s erhitzen.
  4. Nehmen Sie den Becher vorsichtig heraus und schwenken Sie den Inhalt. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 30 s bis zur vollständigen Auflösung.
    ACHTUNG: Gehen Sie vorsichtig mit Mikrowellenglas um und verwenden Sie geeignete Handschuhe. Überwachen Sie die Lösung genau, um ein Überhitzen oder Überkochen zu vermeiden.
  5. Sobald eine homogene Lösung erreicht ist, nehmen Sie das Becherglas aus der Mikrowelle. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, bevor Sie sie in eine vorsterilisierte Flasche umfüllen. Autoklavieren Sie die Lösung und lagern Sie die Agaroselösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur (RT).

2. Beschichtung einer 96-Well-Platte

HINWEIS: 384-Well-Mikrotiterplatten mit extrem niedrig gebundenen Sphäroiden können in diesen und weiteren Experimenten verwendet werden.

  1. Lösen Sie den Verschluss der Flasche mit der sterilen 1%igen Agaroselösung. Erwärmen Sie die Lösung in der Mikrowelle in Abständen von 30 s, bis sie in die flüssige Phase übergeht. Ziehen Sie dann die Kappe fest.
    ACHTUNG: Gehen Sie vorsichtig mit Mikrowellenglas um und verwenden Sie geeignete Handschuhe. Überwachen Sie die Lösung genau, um ein Überhitzen oder Überkochen zu vermeiden.
    HINWEIS: Führen Sie diese Schritte unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube aus Gewebekultur durch.
  2. Übertragen Sie 55-65 μl der 1%igen Agaroselösung pro Well, um die 96-Well-Gewebekulturplatte zu beschichten, und drehen Sie die Platte sofort.
  3. Sobald die 1%ige Agaroselösung in die gewünschte Anzahl von Vertiefungen umgefüllt wurde, stellen Sie die Platten für 20-30 Minuten in einen 4 °C Kühlschrank, damit sich die Agarose verfestigen kann. Bringen Sie die Platte vor Gebrauch auf Raumtemperatur (Abbildung 1A).

3. Herstellung von HEP-Sphäroiden

  1. Kultivieren Sie HepG2-WT-Zellen in einem T-75-Kolben unter Verwendung eines abgeschlossenen Wachstumsmediums (cDMEM), das aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) besteht, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin). Halten Sie die Zellkultur bei 37 °C und 5 % CO2 und wechseln Sie das Wachstumsmedium täglich.
  2. Bei Erreichen einer Konfluenz von 80 % spülen Sie die Zellen mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und verwerfen Sie die Spülung. 5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in den Kolben geben und bei 37 °C und 5 % CO2 5-10 min inkubieren.
  3. Geben Sie die gleichen Mengen cDMEM hinzu und waschen Sie die Zellen aus dem Kolben. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, überführen Sie die Mischung in ein steriles konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei RT.
    HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Zentrifugationsschritte wurden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Diese Zentrifugationsverfahren können aber auch bei kalten Temperaturen durchgeführt werden.
  4. Suspendieren Sie die Zellsuspension erneut in frischem cDMEM und zählen Sie die Zellen, um die endgültige Konzentration in Zellen/ml zu bestimmen (Abbildung 1B).
  5. Farbstoffmarkierung der Zellen
    HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt.
    1. Übertragen Sie die gewünschte Menge der Zellsuspension in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mL und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
    2. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem serumfreien Wachstumsmedium, um eine Endkonzentration von 1,0 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Geben Sie 5 μl fluoreszierende Zellmarkierungslösung pro ml Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 °C und 5 % CO2 in der Rotation für 20 min.
      HINWEIS: Das serumfreie Wachstumsmedium ist DMEM und wird nur mit 1% Pen-Streptokokken ergänzt. Passen Sie die Inkubationszeit für eine gleichmäßige Färbung basierend auf der Dichte der Zellsuspension an.
    3. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 450 x g und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in frischem cDMEM. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei weitere Male (Abbildung 1C).
  6. Bildung von Sphäroiden
    1. Suspendieren Sie die Zellen in frischem cDMEM, um eine Endkonzentration von 5,0 x 104 Zellen/ml basierend auf der Zellzahl zu erreichen. Mischen Sie die Zellsuspensionsvertiefung und übertragen Sie 100 μl Zellsuspension pro Vertiefung auf die Agarose-beschichtete 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Die Dichte der Zellsuspension ist auf 5.000 Zellen pro Well in der Agarose-beschichteten 96-Well-Platte eingestellt. Für die Verwendung von 384-Well-Platten werden die Zellen in einer Endkonzentration von 2,0 x 105 Zellen/ml suspendiert, und 50 μl Zellsuspension werden pro Vertiefung übertragen, um eine Konzentration von 10.000 Zellen pro Vertiefung zu erreichen.
    2. Die Platte 10 min lang bei 340 x g zentrifugieren und bei 37 °C und 5 % CO2 5-9 Tage inkubieren (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Wechseln Sie das Wachstumsmedium nach dem Plattieren alle zwei Tage, indem Sie vorsichtig 50 % des cDMEM entfernen und ersetzen. HEP-Sphäroide sind für das HEP-MES-Assembloid-Modell oder das M-CM-Modell geeignet.

4. Vorbereitung von MES-Sphäroiden

  1. Kultivieren Sie HFF/MRC-5-Zellen in einem T-175-Kolben unter Verwendung von cDMEM, das aus DMEM besteht, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Pen-Strepto. Halten Sie die Zellkultur bei 37 °C und 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
  2. Bei Erreichen einer Konfluenz von 80 % führen Sie eine Spülung der Zellen mit 1x PBS durch und verwerfen Sie die Spülung. 5 ml 0,25 % Trypsin-EDTA in den Kolben geben und bei 37 °C und 5 % CO2 5-10 min inkubieren.
  3. Geben Sie die gleichen Mengen cDMEM hinzu und waschen Sie die Zellen aus dem Kolben. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, geben Sie die Mischung in ein steriles konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 300 x g.
  4. Suspendieren Sie die Zellsuspension erneut in frischem cDMEM und zählen Sie die Zellen, um die endgültige Konzentration in Zellen/ml zu bestimmen (Abbildung 1B).
  5. Farbstoffmarkierung von Zellen
    HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt.
    1. Übertragen Sie die gewünschte Menge der Zellsuspension in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mL und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
    2. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem serumfreien Wachstumsmedium, um eine Endkonzentration von 1,0 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Geben Sie 5 μl fluoreszierende Zellmarkierungslösung pro ml Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 °C und 5 % CO2 in der Rotation für 20 min.
      HINWEIS: Das serumfreie Wachstumsmedium ist DMEM und wird nur mit 1% Pen-Streptokokken ergänzt. Passen Sie die Inkubationszeit für eine gleichmäßige Färbung basierend auf der Dichte der Zellsuspension an.
    3. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 450 x g und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in frischem cDMEM. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zwei weitere Male (Abbildung 1C).
  6. Bildung von Sphäroiden
    1. Suspendieren Sie die Zellen in frischem cDMEM, um eine Endkonzentration von 1,0 x 105 Zellen/ml basierend auf der Zellzahl zu erreichen. Mischen Sie die Zellsuspensionsvertiefung und übertragen Sie 100 μl Zellsuspension pro Vertiefung auf die Agarose-beschichtete 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Die Dichte der Zellsuspension ist so eingestellt, dass sie eine Dichte von 10.000 Zellen pro Well in der Agarose-beschichteten 96-Well-Platte erreicht.
    2. Die Platte 10 min lang bei 340 x g zentrifugieren und bei 37 °C und 5 % CO2 5-9 Tage inkubieren (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Wechseln Sie das Wachstumsmedium nach dem Plattieren alle zwei Tage, indem Sie vorsichtig 50 % des cDMEM entfernen und ersetzen. MES-Sphäroide sind für das HEP-MES-Assembloidmodell geeignet.

5. HEP-MES-Assembloid-Bildung

HINWEIS: In Schritt 3 und Schritt 4 finden Sie Informationen zur Bildung von HEP (Abbildung 2A) und MES-Sphäroiden (Abbildung 2B).

  1. Sammeln Sie HFF/MRC-5-Sphäroide einzeln mit einer Pipette von der 96-Well-Platte. Übertragen Sie sie in ein steriles konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit frischem cDMEM. Lassen Sie die Sphäroide 5 Minuten lang in der Tube einwirken und spülen Sie sie dann vorsichtig mit warmem cDMEM aus.
    HINWEIS: Führen Sie den Spülvorgang vorsichtig und vorsichtig durch.
  2. Übertragen Sie ein einzelnes HFF/MRC-5-Sphäroid vorsichtig mit einer Pipette in eine Vertiefung, die ein HepG2-WT-Sphäroid enthält. Geben Sie eiskaltes Wachstumsfaktor-reduziertes (GFR) Matrigel (MG) oder Rattenschwanzkollagen (CG) in einer Verdünnung von 1:1 und 1:5 hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C bei 5% CO2 für 3 h (Abbildung 2C).
    HINWEIS: MG über Nacht auf Eis in einem Kühlschrank von 2 °C bis 8 °C auftauen. Stellen Sie sicher, dass beim Umgang mit MG vorgekühlte Pipetten, Spitzen und Röhrchen verwendet werden, da es über 10 °C ein Gel bildet.
  3. Nach der Inkubation 75 μl frisches cDMEM in jede Vertiefung geben und 2-3 Tage lang bei 37 °C bei 5 % CO2 inkubieren.
    HINWEIS: Wechseln Sie das Wachstumsmedium nach dem Plattieren alle zwei Tage, indem Sie vorsichtig 50 % des cDMEM entfernen und ersetzen. Assembloide bilden sich ohne Medienwechsel noch bis zu 3-4 Tage. Die Bildung von HEP-MES-Assembloiden kann ohne Verwendung der Matrix erfolgen.

6. Bildung von HEP-Sphäroid-Tröpfchen

HINWEIS: Siehe Schritt 3 für die Bildung von HEP-Sphäroiden (Abbildung 3A). Für die Suspendierung der HEP-Sphäroide in Tröpfchen können zwei verschiedene Materialien verwendet werden. Die beiden Methoden werden im Folgenden beschrieben.

  1. GFR MG Tröpfchen
    1. Sammeln Sie HepG2-WT-Sphäroide einzeln mit einer Pipette von der 96-Well-Platte, damit sie sich in einer sterilen konischen 15-ml-Zentrifuge auf Eis absetzen können.
    2. Mischen Sie in einem separaten sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit 15 ml 1 ml eiskaltem GFR MG und eiskaltem Kontrollwachstumsmedium in einer Verdünnung von 1:1. Das Medium wird mit einer Pipette aus dem 15-ml-Röhrchen mit den HepG2-WT-Sphäroiden aspiriert und auf Eis gelegt.
      HINWEIS: MG über Nacht auf Eis im Kühlschrank von 2 °C bis 8 °C auftauen. Achten Sie beim Umgang mit MG auf vorgekühlte Pipetten, Spitzen und Röhrchen, da es über 10 °C ein Gel bildet.
    3. Fügen Sie die MG-Lösung zu HepG2-WT-Sphäroiden hinzu und sorgen Sie so für eine gleichmäßige Sphäroidverteilung in der MG-Lösung.
    4. Sammeln Sie mit einer 200-μl-Pipette ein Volumen von 15 μl eines einzelnen Sphäroids in der MG-Lösung und säen Sie es langsam auf eine 60-mm-Petrischale (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Wenn mehr als ein Sphäroid pro Tröpfchen ausgesät wird, entfernen Sie es ordnungsgemäß und säen Sie es erneut. Sphäroide werden bei Bedarf neu positioniert, um sicherzustellen, dass sie sich in der Mitte des Tröpfchens befinden. Für eine optimale Sphäroidaussaat sollten Sie das Rückwärtspipettieren in Betracht ziehen, um die Bildung von Luftblasen zu minimieren.
  2. Rattenschwanz CG Tröpfchen
    HINWEIS: Alle CG-Vorbereitungen sollten auf Eis erfolgen.
    1. Sammeln Sie HepG2-WT-Sphäroide einzeln mit einer Pipette aus der 96-Well-Platte, damit sie sich in einem sterilen konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis absetzen können (Abbildung 3B).
    2. Geben Sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen 358,8 μl deionisiertes Wasser, 100 μl 10x PBS, 12,1 μl 1 N NaOH und 529,1 μl Rattenschwanz-CG für ein Gesamtvolumen von 1 mL.
      HINWEIS: Der serienmäßige Rattenschwanz-Schwerpunkt muss immer am Ende hinzugefügt werden.
    3. Fügen Sie die CG-Lösung zu HepG2-WT-Sphäroiden hinzu und sorgen Sie so für eine gleichmäßige Sphäroidverteilung in der CG-Lösung.
    4. Sammeln Sie mit einer 200-μl-Pipette ein Volumen von 15 μl eines einzelnen Sphäroids in der CG-Lösung und säen Sie es langsam auf eine 60-mm-Petrischale.
      HINWEIS: Wenn mehr als ein Sphäroid pro Tröpfchen ausgesät wird, entfernen Sie es ordnungsgemäß und säen Sie es erneut. Die Sphäroide werden neu positioniert, um sicherzustellen, dass sie sich in der Mitte des Tröpfchens befinden. Für eine optimale Sphäroidaussaat sollten Sie das Rückwärtspipettieren in Betracht ziehen, um die Bildung von Luftblasen zu minimieren.
  3. Inkubieren Sie die Tröpfchen bei 37 °C und 5 % CO2 für 60 Minuten, bevor Sie das Wachstumsmedium hinzufügen.
  4. Geben Sie langsam 5 ml des gewünschten Wachstumsmediums in die Petrischale und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO2, wobei das Wachstumsmedium alle drei Tage gewechselt wird (Abbildung 3C).
    HINWEIS: M-CM wurde im HEP-Tröpfchenbildungsassay verwendet.

7. Vorbereitung von M-CM

  1. Ernten Sie HFF/MRC-5-Zellen und säen Sie sie in einen mit T-75-Gewebekulturen behandelten Kolben mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen/cm2 und inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C und 5 % CO2 für 72 h in 15 mL cDMEM.
    HINWEIS: Überwachen Sie den Kolben während dieses Zeitraums, um eine optimale Zellgesundheit zu gewährleisten.
  2. Nach der 72-stündigen Inkubation sammeln Sie den M-CM in einem sterilen konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den M-CM 5 Minuten lang bei 290 x g zur Schmutzentfernung und filtrieren Sie ihn mit einem 0,2-μm-Filter zur Sterilisation (Abbildung 4A).
  3. Verdünnen Sie das M-CM mit vollständigem Wachstumsmedium in einem Verdünnungsverhältnis von 1:1 bis 1:7 und fügen Sie es dem gewünschten Experiment hinzu (Abbildung 4B).
    HINWEIS: Verwenden Sie M-CM im HEP-Tröpfchenbildungsassay.

8. HEP-MES gemischte Sphäroidbildung

HINWEIS: Siehe Schritte 3.1-3.5. für die Vorbereitung der HepG2-WT-Zellsuspension und die Schritte 4.1-4.5 für die Vorbereitung der HFF/MRC-5-Zellsuspension.

  1. Suspendieren Sie die HepG2-WT-Zellen in frischem cDMEM, um eine Endkonzentration von 1,0 x 105 Zellen/ml für jede Zellsuspension zu erreichen.
  2. Suspendieren Sie die HFF/MRC-5-Zellen in frischem cDMEM, um eine Endkonzentration von 1,0 x 105 Zellen/ml für jede Zellsuspension zu erreichen.
  3. HepG2-WT- und HFF/MRC-5-Zellsuspensionen werden in ein steriles konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen im Verhältnis 1:1 überführt, um eine Endkonzentration von 2,0 x 105 Zellen/ml zu erhalten. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich und übertragen Sie 100 μl Zellsuspension pro Vertiefung auf die Agarose-beschichtete 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Die Dichte der Zellsuspension ist auf 20.000 Zellen pro Well in der Agarose-beschichteten 96-Well-Platte eingestellt.
  4. Die Platte 10 min lang bei 340 x g zentrifugieren und 1-2 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren (Abbildung 5C).
  5. Zugabe von Fibrin-Hydrogelen
    HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, der innerhalb von 72 Stunden nach dem Plattieren von HEP-MES-gemischten Sphäroiden durchgeführt wird.
    1. Mischen Sie in einem sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit 15 mL Fibrinogen (3,25 mg/ml) und Thrombin (12,5 Einheiten/ml) im Verhältnis 4:1 für die Bildung von Fibrin und legen Sie das Röhrchen auf Eis.
  6. Übertragen Sie das Fibrin in jede Vertiefung mit einem bereits vorhandenen gemischten Sphäroid in einer 1:1-Verdünnung mit dem aktuellen cDMEM in der Vertiefung. Die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 30 min inkubieren.
  7. Nach der Inkubation 75 μl frisches cDMEM in jede Vertiefung geben und 1-2 Tage lang bei 37 °C bei 5 % CO2 inkubieren.
    HINWEIS: Wechseln Sie das Wachstumsmedium nach dem Plattieren alle zwei Tage, indem Sie vorsichtig 50 % des cDMEM entfernen und ersetzen.

9. MES-Migrationsmodell mit hoher Dichte

HINWEIS: Siehe Schritt 3 für die Sphäroidvorbereitung von HepG2-WT (Abbildung 6A) und die Schritte 4.1-4.5 für die Vorbereitung von HFF/MRC-5-Zellsuspensionen (Abbildung 6B).

  1. Suspendieren Sie die HFF/MRC-5-Zellen in frischem cDMEM, um eine Endkonzentration von 6,0 x 105 Zellen/ml zu erreichen, und legen Sie sie auf Eis.
  2. Mischen Sie die HFF/MRC-5-Zellsuspension und das eiskalte MG/CG in einer Verdünnung von 1:1 (Abbildung 6C).
    HINWEIS: Die Zellsuspensionsdichte ist so eingestellt, dass 30.000 Zellen pro Well in der Agarose-beschichteten 96-Well-Platte erhalten werden. MG über Nacht auf Eis im Kühlschrank von 2 °C bis 8 °C auftauen. Achten Sie beim Umgang mit MG auf vorgekühlte Pipetten, Spitzen und Röhrchen, da es über 10 °C ein Gel bildet.
  3. 100 μl HFF/MRC-5- und MG-Lösung mit einer Pipette in eine Vertiefung mit einem HepG2-WT-Sphäroid übertragen. Die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 30 min inkubieren.
  4. Nach der Inkubation 75 μl frisches cDMEM in jede Vertiefung geben und bis zu 12 Tage lang bei 37 °C bei 5 % CO2 inkubieren.

10. Statistische Analyse

  1. Überprüfen und analysieren Sie die Daten, die mit Microsoft Excel oder einer anderen Statistik-/Grafiksoftware gesammelt wurden.
    HINWEIS: Für die statistische Bewertung zwischen zwei Gruppen wurde der Student's t-Test durchgeführt (Typ II mit zwei Schwänzen), und p-Werte von 0,05 oder weniger wurden als statistisch signifikant angesehen und sind im Text und in den Abbildungen/Abbildungslegenden definiert.

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Ergebnisse

Das Interesse an synthetischen Geweben für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen wie die Krankheitsmodellierung, die Arzneimittelforschung und das Gewebeengineering (Abbildung 7) nimmt zu. In diesem Bereich werden aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSZ) abgeleitete Organoiden, Sphäroide und Zellen in immer synthetischere, komplexere und größere Gewebe umgewandelt. Diese Umwandlung umfasst die Anwendung von Prinzipien der Morphogenese, den Einsatz von Werkzeugen wie der Mikrofertigu...

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Diskussion

Das vorliegende Protokoll umfasst mehrere Verfahren zur Kultivierung sowohl einfacher als auch komplexer Assembloide sowie Techniken zur Induktion der kollektiven 3D-Zellmigration in der frühen Leberorganogenese 24,25. Die skizzierten Protokolle heben mehrere kritische Schritte hervor, wobei die Sphäroidbildung ein zentraler Aspekt aller Methoden ist. Mikrovertiefungen (96 oder 384 Vertiefungen) werden entweder mit nicht-adhärenten oder mit Agarose beschichteten ...

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Offenlegungen

NP ist der Gründer von Khufu Therapeutics, einem Unternehmen für Organoid-Engineering, das Behandlungen für akute und chronische Lebererkrankungen entwickelt.

Danksagungen

Die Autoren möchten Ogechi Ogoke und Osama Yousef aufrichtig danken für ihre unschätzbaren Beiträge zu den in diesem Artikel verwendeten Daten. NP wurde unterstützt von den UB CBE Startup-Fonds, einem Mark Diamond Fellowship, dem New York State Stem Cell Science C024316, dem UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM) Center und dem University at Buffalo Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
384-Well Schwarz/Klarer Boden mit ultra-niedrigem Aufsatz Sphäroid-MikroplatteCorning3830
96-wl Zellkulturplatte flach, TC,STRL,1/pk,100/CSVertrieb von Laborprodukten 701001
AgaroseSigma-AldrichA0576Low EEO
Axiovision SoftwareZEISSVersion 4
Zellkulturschale, 60 mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CSLaborprodukte Verkauf705001
Zellkulturflasche,175cm², Vent,TC,STRL,5/pk,40/CSLaborprodukte Verkauf709003
Zellkulturkolben,75cm², Vent,TC,STRL,5/pk,100/CSLaborprodukte Verkauf 708003
Zentrifugenröhrchen, 15mL,PP,STRL,Grad,50/bg,500/CSLaborprodukte Verkauf L226010
Kollagen I, Rattenschwanz, 100 mgCorning354236
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, PyruvatThermoFisher Scientific10569010
EVOS Fluoreszierendes PhasenkontrastmikroskopEVOSAMEFC4300R1.360 x 1.024 Pixel Dichte
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USAThermoFisher Scientific26140079
Fibrinogen aus humanem PlasmaSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran Matrix, LDEV-frei, 10 mLCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT Human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKitLonzaPT-3001
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)ThermoFisher Scientific15140122
Thrombin aus menschlichem PlasmaSigma-AldrichT6884-100UN100 Einheiten
Trypsin-EDTA (0,05%), PhenolrotThermoFisher Scientific25300062
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD-ZellmarkierungslösungThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI-ZellmarkierungslösungThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO-Zellmarkierung LösungThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio FluoreszenzmikroskopZEISSSE64, 1.344 > 1.024 Pixel Dichte

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Leber Assembloidehepatische Sph roidemesenchymale Sph roideverzweigte Morphogenesekollektive Migrationmesenchymales konditioniertes Medium
In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien
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