AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Summary

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

Abstract

AQRNA-seq bietet eine direkte lineare Beziehung zwischen den Lesezahlen der Sequenzierung und der Anzahl kleiner RNA-Kopien in einer biologischen Probe und ermöglicht so eine genaue Quantifizierung des Pools kleiner RNAs. Das hier beschriebene Verfahren zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek beinhaltet die Verwendung von kundenspezifisch entwickelten Sequenzierungslinkern und einen Schritt zur Reduzierung von Methylierungs-RNA-Modifikationen, die die Prozessivität der reversen Transkription blockieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an cDNAs in voller Länge führt. Darüber hinaus wird eine detaillierte Implementierung der begleitenden Bioinformatik-Pipeline vorgestellt. Diese Demonstration von AQRNA-seq wurde durch eine quantitative Analyse der 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG durchgeführt, die an 5 ausgewählten Tagen über einen Zeitraum von 20 Tagen mit Nährstoffentzug und 6 Tagen Wiederbelebung entnommen wurden. Die laufenden Bemühungen zur Verbesserung der Effizienz und Strenge von AQRNA-seq werden hier ebenfalls erörtert. Dazu gehört die Erforschung von Methoden zur Vermeidung der Gelaufreinigung, zur Minderung von Primer-Dimer-Problemen nach der PCR-Amplifikation und zur Erhöhung des Anteils von Reads in voller Länge, um ein genaueres Read-Mapping zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen von AQRNA-seq werden sich auf die Erleichterung der Automatisierung und Hochdurchsatzimplementierung dieser Technologie zur Quantifizierung aller kleinen RNA-Spezies in Zell- und Gewebeproben verschiedener Organismen konzentrieren.

Introduction

Next-Generation-Sequencing (NGS), auch bekannt als massiv parallele Sequenzierung, ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die DNA-Fragmentierung, Ligation von Adapter-Oligonukleotiden, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Amplifikation, Sequenzierung der DNA und Reassemblierung der Fragmentsequenzen zu einem Genom umfasst. Die Anpassung von NGS an Sequenz-RNA (RNA-seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung und Quantifizierung von RNA-Transkripten und deren Varianten¹. Innovative Entwicklungen bei Arbeitsabläufen zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken und bioinformatischen Analysepipelines, gepaart mit Fortschritten bei Laborinstrumenten, haben das Repertoire an RNA-Seq-Anwendungen erweitert und sind über die Exomsequenzierung hinaus zu fortschrittlichen funktionellen Omics-Anwendungen wie nicht-kodierendem RNA-Profiling², Einzelzellanalyse³, räumlicher Transkriptomik ^4,5 und alternativer Spleißanalyse⁶ vorangeschrittenunter anderem. Diese fortschrittlichen RNA-seq-Methoden decken komplexe RNA-Funktionen durch quantitative Analyse des Transkriptoms in normalen und erkrankten Zellen und Geweben auf.

Trotz dieser Fortschritte in der RNA-seq schränken mehrere wichtige technische Merkmale die quantitative Leistungsfähigkeit der Methode ein. Während die meisten RNA-seq-Methoden eine präzise und genaue Quantifizierung von Änderungen der RNA-Spiegel zwischen experimentellen Variablen (d. h. biologischen Proben und/oder physiologischen Zuständen) ermöglichen, können sie keine quantitativen Vergleiche der Konzentrationen von RNA-Molekülen in einer Probe liefern. Zum Beispiel können die meisten RNA-seq-Methoden die relative Anzahl der Kopien einzelner tRNA-Isoakzeptormoleküle in einem zellulären Pool exprimierter tRNAs nicht genau quantifizieren. Wie in der Begleitpublikation⁷ hervorgehoben, ergibt sich diese Einschränkung des RNA-seq aus mehreren Merkmalen der RNA-Struktur und der Biochemie der Bibliotheksvorbereitung. Zum Beispiel wird die Aktivität der Ligationsenzyme, die zum Anhängen der 3'- und 5'-End-Sequenzierungslinker an RNA-Moleküle verwendet werden, stark von der Identität der terminalen Nukleotide der RNA und der Sequenzierungslinker beeinflusst. Dies führt zu großen Schwankungen in der Effizienz von Linker-Ligationen und zu tiefgreifenden künstlichen Steigerungen der Sequenzierungs-Reads ^8,9,10.

Eine zweite Reihe von Einschränkungen ergibt sich aus den inhärenten strukturellen Eigenschaften von RNA-Molekülen. Insbesondere die Bildung der RNA-Sekundärstruktur und dynamische Veränderungen in den Dutzenden von posttranskriptionellen RNA-Modifikationen des Epitranskriptoms können zu einem Polymeraseabfall oder einer Mutation während der reversen Transkription führen. Diese Fehler führen zu einer unvollständigen oder verkürzten cDNA-Synthese oder einer veränderten RNA-Sequenz. Während diese beiden Phänomene ausgenutzt werden können, um Sekundärstrukturen oder einige Modifikationen zu kartieren, verschlechtern sie die quantitative Genauigkeit von RNA-seq, wenn nachfolgende Bibliotheksvorbereitungsschritte keine verkürzten cDNAs erfassen oder wenn die Datenverarbeitung mutierte Sequenzen auswirft, die nicht mit einem Referenzdatensatz übereinstimmen^11,12. Darüber hinaus verringert die immense chemische, längen- und strukturelle Vielfalt von RNA-Transkripten sowie der Mangel an Werkzeugen zur gleichmäßigen Fragmentierung langer RNAs die Anwendbarkeit der meisten RNA-seq-Methoden auf alle RNA-Spezies¹³.

Die AQRNA-seq-Methode (absolute Quantifizierung RNA-Sequenzierung) wurde entwickelt, um mehrere dieser technischen und biologischen Einschränkungen zu beseitigen, die die quantitative Genauigkeit einschränken⁷. Durch die Minimierung sequenzabhängiger Verzerrungen bei der Erfassung, Ligation und Amplifikation während der Vorbereitung der RNA-Sequenzierungsbibliotheken erreicht AQRNA-seq eine überlegene Linearität im Vergleich zu anderen Methoden und quantifiziert 75 % einer Referenzbibliothek von 963 miRNAs mit 2-facher Genauigkeit. Diese lineare Korrelation von Sequenzierung, Lesezahl und RNA-Abundanz wird auch bei der Analyse eines Pools variabler Länge von RNA-Oligonukleotidstandards und in Bezug auf orthogonale Methoden wie Northern Blot beobachtet. Die Etablierung der Linearität zwischen der Anzahl der Sequenzierungs-Reads und der RNA-Abundanz ermöglicht AQRNA-seq eine genaue, absolute Quantifizierung aller RNA-Spezies innerhalb einer Probe.

Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung des Protokolls für den Workflow zur Vorbereitung von AQRNA-seq-Bibliotheken und der zugehörigen nachgelagerten Datenanalyse-Pipeline. Die Methode wurde angewendet, um die Dynamik der tRNA-Abundanz während der hungerinduzierten Ruhephase und der anschließenden Wiederbelebung im Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) Modell der Tuberkulose aufzuklären. Die Ergebnisse wurden für die explorative Visualisierung der Sequenzierungsdaten vorgestellt, zusammen mit anschließenden Clustering- und differentiellen Expressionsanalysen, die erkennbare Muster in der tRNA-Abundanz aufdeckten, die mit verschiedenen Phänotypen assoziiert sind.

Protocol

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung der Verfahren, die bei der Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek erforderlich sind. Detaillierte Informationen zu den Reagenzien, Chemikalien und Säulen/Kits, die in dem Verfahren verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, eine umfassende Bewertung der Reinheit, Integrität und Menge der Eingabe-RNA-Proben mit (i) 3%iger Agarose-Gelelektrophorese, (ii) automatisierten Elektrophoresewerkzeugen zur Probenqualitätskontrolle von Biomolekülen (siehe Materialtabelle) und (iii) UV-sichtbarer Spektrophotometrie und/oder fluorometrischer Quantifizierung durchzuführen. Es ist zwingend erforderlich, alle Reaktionen und Mastermixe auf Eis zu halten, sofern nicht anders angegeben. Transportieren Sie Reagenzien (z. B. Enzyme) in Kühlboxen zur und von -20 °C Lagerung, um ihre Haltbarkeit zu erhalten und mehrere Gefrier-Tau-Zyklen von Bibliothekszwischenprodukten zu vermeiden.

1. Dephosphorylierung von RNAs

HINWEIS: Die Entfernung des 5'-Phosphats (P; Donor) verhindert die Selbstligation an das 3'-Hydroxyl (OH; Akzeptor) von RNAs. Linker ligieren sich nicht selbst, da ihr 3'-Ende so modifiziert wird, dass es entweder ein Didesoxycytidin (Linker 1) oder einen Spacer (Linker 2) enthält. Linker können nur ligiert werden, indem ihr 5'-P an das 3'-OH der RNAs oder cDNAs gebunden wird.

1. Bereiten Sie die Dephosphorylierungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen (z. B. 200 μl oder 500 μl Röhrchen) vor, indem Sie bis zu 2 μl der RNA-Probe, 0,5 μl 40 μl RNase-Inhibitor, 1 μl 0,5 μM internen Standard (Tabelle 1), 0,5 μl 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, 1 μl 1 μl alkalische Garnelenphosphatase, und ausreichend RNase-freies Wasser, um das Gesamtvolumen auf 5 μL zu bringen.
   HINWEIS: Für typische Proben werden 75 ng RNA (oder ca. 2 pmol für eine 80 nt RNA) als ausreichend für die Quantifizierung kleiner RNAs unter Verwendung dieses Protokolls angesehen.
2. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um RNAs zu dephosphorylieren, und dann 5 Minuten lang bei 65 °C, um das Enzym zu inaktivieren und die RNAs zu denaturieren. Bewahren Sie die Proben mindestens 10 Minuten lang bei 4 °C auf, um eine Renaturierung zu verhindern.

2. Ligation von Linker 1 bis zum 3'-Ende von RNAs

1. Bereiten Sie die Linker-1-Ligationsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 5 μl der dephosphorylierten RNAs (Produkte aus Schritt 1), 0,5 μl 40 μl/μl RNase-Inhibitor, 1 μl 100 μM Linker 1 (Tabelle 1), 3 μl 10 mM ATP, 2,5 μl 10x T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer, 15 μl PEG8000 (50%ige Lösung) hinzufügen. 2 μl 30 U/μl T4-RNA-Ligase 1 und 1 μl RNase-freies Wasser.
   HINWEIS: Reagenzien können zu Mastermixen verarbeitet werden, um die Verarbeitung der Proben zu erleichtern. Nehmen Sie keine PEG8000 und T4-RNA-Ligase 1 in den Mastermix auf.
2. Inkubieren Sie 2 h lang bei 25 °C und dann 16 h lang bei 16 °C, um Linker 1 an die RNAs zu ligieren.
3. Säulenreinigung der Linker-1-ligierten RNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Dieses Säulenaufreinigungsprotokoll gilt für alle nachfolgenden Säulenaufreinigungen mit demselben Kit. Kits, die eine Gelfiltrationstechnologie verwenden, um Farbstoffterminatoren aus Sequenzierungsreaktionen zu entfernen (siehe Materialtabelle), können hier nicht verwendet werden, da PEG8000 nicht mit den Gelfiltern solcher Kits kompatibel ist. Es wird empfohlen, nach der Aufreinigung ein Aliquot (1,2 μl) jeder Probe aufzubewahren. Falls erforderlich, können diese Aliquots zur Überprüfung der Ligationseffizienz verwendet werden, indem ein kommerzieller Nukleinsäureanalysator betrieben wird. Bewahren Sie die restlichen gereinigten Proben bis zu weiteren Schritten auf Eis oder bei -20 °C auf.
   1. Für ein Probenvolumen < 50 μl fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um es auf 50 μl zu bringen. Fügen Sie 2 Volumen des Oligo-Bindungspuffers (im Kit enthalten) zu 1 Volumen der Probe hinzu. Geben Sie 8 Volumen 100 % Ethanol zu 1 Volumen der Probe.
   2. Laden Sie die Probe (bis zu 750 μl auf einmal) in eine Säule, die sich in einem 2-ml-Entnahmeröhrchen (im Kit enthalten) befindet. Um RNAs an die Säule zu binden, zentrifugieren Sie 30 s lang bei 10.000 x g und verwerfen Sie den Durchfluss (d. h. die Flüssigkeit im Sammelröhrchen). Setzen Sie die Säule wieder in das Auffangröhrchen ein.
   3. Um die Verunreinigungen von der Säule zu waschen, geben Sie 750 μl des DNA-Waschpuffers (im Kit enthalten) in die Säule. Bei 10.000 x g für 30 s zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen. Setzen Sie die Säule wieder in das Auffangröhrchen ein.
   4. Zentrifugieren Sie bei maximaler Drehzahl (z. B. 16.000 x g für eine Tisch-Mikrozentrifuge) für weitere 1 Minute, um den verbleibenden DNA-Waschpuffer zu entfernen.
   5. Um die RNAs zu eluieren, bringen Sie die Säule vorsichtig in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und geben Sie RNase-freies Wasser in die Säule. Verwenden Sie bei der Eluierung der RNAs ein größeres Volumen als erforderlich, um einen möglichen Volumenverlust während des Elutionsprozesses zu berücksichtigen. Wenn beispielsweise 15 μl für den folgenden Schritt benötigt werden, fügen Sie 17 μl RNase-freies Wasser für die Elution hinzu. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 30 s.

3. Entfernung von posttranskriptionellen Methylierungen durch AlkB-Demethylase

HINWEIS: AlkB ist ein bakterielles Enzym, das Methylgruppen von einigen, aber nicht allen methylierten Nukleotiden in DNA und RNA entfernt. Die Entfernung verschiedener Arten von methylierten Ribonukleotiden in RNA verhindert den Abfall der reversen Transkriptase, um mehr Reads in voller Länge und die Identifizierung von Modifikationsstellen zu ermöglichen. Dieser Schritt muss bei einem niedrigen pH-Wert gesteuert werden, um einen unerwarteten Abbau der RNAs zu verhindern.

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M 2-Ketoglutarat vor, indem Sie 1,4611 g 2-Ketoglutarat (146,11 g pro M) in 10 ml RNase-freiem Wasser auflösen. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,5 M L-Ascorbinsäure vor, indem Sie 0,88 g L-Ascorbinsäure (176,12 g pro M) in 10 mL RNase-freiem Wasser lösen. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,25 M Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat vor, indem Sie 0,9835 g Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat (392,14 g pro M) in 10 ml RNase-freiem Wasser lösen. Filter: Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
4. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M HEPES vor, indem Sie 2,383 g HEPES (238,30 g pro M) in 10 ml RNase-freiem Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 8 ein und sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter. Die Stammlösung wird in sterile 2-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
5. Bereiten Sie einen 2x AlkB-Reaktionspuffer vor. Um 10 ml des Puffers herzustellen, kombinieren Sie 1,5 μl 1 M 2-Ketoglutarat (hergestellt in Schritt 3.1), 80 μl 0,5 M l Ascorbinsäure (hergestellt in Schritt 3.2), 6 μl 0,25 M Ammoniumeisensulfat-Hexahydrat (hergestellt in Schritt 3.3), 100 μl 10 mg/ml BSA, 1000 μl 1 M HEPES (hergestellt in Schritt 3.4; zuletzt hinzufügen), und 8812,5 μl RNase-freies Wasser. Der Filter sterilisiert den Puffer durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter.
   HINWEIS: Der 2x AlkB-Reaktionspuffer muss aufgrund der chemischen Labilität der Komponenten unmittelbar vor jedem Versuch frisch hergestellt werden.
6. Bereiten Sie die AlkB-Verdauungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 20 μl der Linker-1-ligierten RNAs (Produkte aus Schritt 2), 50 μl des 2x AlkB-Reaktionspuffers (hergestellt in Schritt 3.5), 2 μl AlkB-Demethylase, 1 μl RNase-Inhibitor und 27 μl RNase-freies Wasser hinzufügen.
7. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren, um posttranskriptionelle Methylierungen von den RNAs zu entfernen.
8. Um AlkB aus der Reaktion zu entfernen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Für eine saubere Phasentrennung geben Sie 50 μl RNase-freies Wasser in die AlkB-Reaktion und fügen Sie dann 100 μl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1 (pH = 5,2) hinzu.
   2. Mit der Hand 10 s schütteln und dann bei 16.000 x g 10 min zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass der Rotor der Tischzentrifuge mit den PCR-Röhrchen kompatibel ist. Verwenden Sie bei Bedarf Adapter.
   3. Übertragen Sie die RNAs (d. h. die wässrige Schicht oben; ca. 140 μl) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Wenn Chloroform (d. h. die untere Schicht) in die wässrige Schicht gemischt wird, wird erneut mit den gleichen Einstellungen zentrifugiert.
   4. Fügen Sie den extrahierten RNAs 100 μl Chloroform hinzu, um das restliche Phenol zu entfernen. Mit der Hand 10 s schütteln und dann bei 16.000 x g 10 min zentrifugieren.
   5. Übertragen Sie die RNAs (d. h. die wässrige Schicht oben; ca. 120 μl) in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen.
9. Säulenreinigung der extrahierten RNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie das in Schritt 2.3 beschriebene Protokoll, um die Säulenreinigung durchzuführen.

4. Entfernen von überschüssigem Linker 1

HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Aliquot (1,2 μl) jeder Probe nach der Aufreinigung aufzubewahren. Bei Bedarf können diese Aliquoten zur Überprüfung der Effizienz des RecJf-Aufschlusses verwendet werden, indem ein kommerzieller Nukleinsäureanalysator betrieben wird. Fahren Sie mit den gereinigten Proben sofort fort, um die Transkription zu reversen.

1. Bereiten Sie die Totenylierungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 15 μl Linker-1-ligierte RNAs (Produkte aus Schritt 3), 1 μl 40 U/μl RNase-Inhibitor, 2 μl 10x Kit-Puffer 2 (siehe Materialtabelle) und 2 μl 50 μl 5'-Totenylase hinzufügen.
2. 1 h bei 30 °C inkubieren, um das Adenin am 5'-Ende von Linker 1 zu entfernen. 2 μl 30 U/μl RecJf in die Totenylierungsreaktion geben.
3. 30 min bei 37 °C inkubieren, um überschüssigen Linker 1 zu verdauen. Geben Sie weitere 2 μl 30 U/μl RecJf in die Reaktion.
4. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um den Verdau des überschüssigen Linkers 1 fortzusetzen, und dann 20 Minuten lang bei 65 °C, um das Enzym zu denaturieren.
5. Säulenreinigung der Linker-1-ligierten RNAs. Verwenden Sie ein Kit, das die Gelfiltrationstechnologie verwendet, um Farbstoffterminatoren aus Sequenzierungsreaktionen zu entfernen (siehe Materialtabelle), da es bei der Entfernung kurzer Reste (z. B. Oligonukleotide mit einer Länge von 2 bis 10 bp) wirksam ist. Befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte zur Reinigung.
   1. Bereiten Sie die Gelfiltersäulen gemäß dem Protokoll des Herstellers vor. Setzen Sie eine Säule in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen ein und beladen Sie die Säule mit 24 μl der Probe.
   2. Um die RNAs zu reinigen, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 800 x g und verwerfen Sie die Säule. Die gereinigten RNAs befinden sich im Eluenten.

5. Reverse Transkriptionsreaktion (RT)

HINWEIS: Der folgende RT-Reaktionsaufbau (siehe Materialtabelle) folgt dem Protokoll des Herstellers, mit geringfügigen Änderungen, um die AQRNA-seq-Kompatibilität zu ermöglichen.

1. Bereiten Sie die RT-Primer-Annealing-Reaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 24 μl Template-RNAs (Produkte aus Schritt 4), 1 μl 2 μM RT-Primer (Tabelle 1) und 1 μl dNTP (10 mM jeder Art von Nukleotiden) hinzufügen.
2. Inkubieren Sie 2 Minuten lang bei 80 °C, um RT-Primer an den Template-RNAs zu glühen, und kühlen Sie dann sofort 2 Minuten lang auf Eis ab.
3. Bereiten Sie die RT-Reaktion vor, indem Sie 6 μl 5x RT-Reaktionspuffer, 1 μl 40 U/μl RNase-Inhibitor und 1 μl reverse Transkriptase in das Annealing-Reaktionsröhrchen geben.
4. Inkubieren Sie 2 Stunden lang bei 50 °C, um die RNA-Templates umzuschreiben, und dann 15 Minuten lang bei 70 °C, um das Enzym zu inaktivieren. Die RT-Produkte (d. h. RNA-cDNA-Hybride) können über Nacht bei 4 °C oder -20 °C gelagert werden.

6. RNA-Hydrolyse

1. Geben Sie 1 μl 5 M NaOH in den RNA-cDNA-Hybrid (Produkte aus Schritt 5). 3 Minuten lang bei 93 °C inkubieren, um den RNA-Strang des RNA-cDNA-Hybrids zu hydrolysieren.
2. Fügen Sie 0,77 μl 5 M HCl hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Nachdem Sie HCl hinzugefügt haben, schnippen Sie zum Mischen und drehen Sie die Röhre nach unten. Die Neutralisation erfolgt sofort.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die genaue Menge von 5 M HCl, die für die Neutralisation von 1 μl NaOH erforderlich ist (z. B. mit pH-Streifen), unter gepufferten Bedingungen zu testen.
3. Säulenreinigung der einzelsträngigen cDNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie das in Schritt 2.3 beschriebene Protokoll, um die Säulenreinigung durchzuführen.
   HINWEIS: Kits, die eine Gelfiltrationstechnologie verwenden, um Farbstoffterminatoren aus Sequenzierungsreaktionen zu entfernen (siehe Materialtabelle), können hier aufgrund der pH-Variation in den vorherigen Schritten nicht verwendet werden.
4. Beschleunigen Sie die gereinigten cDNAs auf < 5 μl und fügen Sie dann RNasefreies Wasser hinzu, um das Volumen wieder auf 5 μl zu bringen. Achten Sie darauf, die cDNAs nicht bis zur vollständigen Trockenheit zu völliger Trockenheit zu völlig zu verfassen
5. Übertragen Sie die aufgereinigten cDNAs in ein steriles PCR-Röhrchen. Die aufgereinigten cDNAs können bis zu 1 Woche bei -20 °C gelagert werden.

7. Ligation von Linker 2 bis zum 3'-Ende von cDNAs

1. Bereiten Sie die Linker-2-Ligationsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 5 μl cDNAs (Produkte aus Schritt 6), 1 μl 50 μM Linker 2 (Tabelle 1), 2 μl 10x T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer, 1 μl 10 mM ATP, 9 μl PEG8000 (50%ige Lösung) und 2 μl 400 μl T4-DNA-Ligase hinzufügen.
   HINWEIS: Reagenzien können zu Mastermixen verarbeitet werden, um die Verarbeitung der Proben zu erleichtern. Nehmen Sie keine PEG8000 und T4-DNA-Ligase in den Mastermix auf.
2. Inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 16 °C, um Linker 2 an die cDNAs zu ligieren.
3. Säulenreinigung der Linker-2-ligierten cDNAs. Verwenden Sie ein Kit für die DNA/RNA-Rückgewinnung und -Reinigung (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie das in Schritt 2.3 beschriebene Protokoll, um die Säulenreinigung durchzuführen.

8. Entfernen von überschüssigem Linker 2

1. Bereiten Sie die Deadenylierungsreaktion in einem sterilen PCR-Röhrchen vor, indem Sie 16 μl Linker-2-ligierte cDNAs, 2 μl 10x Kit-Puffer 2 und 2 μl 50 U/μl 5'-Deadenylase hinzufügen. Inkubieren Sie 1 h lang bei 30 °C, um das Adenin am 5'-Ende von Linker 2 zu entfernen.
2. 2 μl 30 U/μl RecJf in die Totenylierungsreaktion geben. 30 min bei 37 °C inkubieren, um überschüssigen Linker 2 zu verdauen. Geben Sie weitere 2 μl 30 U/μl RecJf in die Reaktion.
3. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C, um den Verdau des überschüssigen Linkers 2 fortzusetzen, und dann 20 Minuten lang bei 65 °C, um das Enzym zu denaturieren.

9. PCR-Amplifikation der cDNAs mit Sequenzierungsprimern

1. Weisen Sie den Proben PCR-Primer zu. Jede Probe benötigt eine einzigartige Kombination aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern (Tabelle 1) für ein effektives Multiplexing.
2. Fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um das Probenvolumen auf 25 μl zu bringen. Speichern Sie 5 μl jeder Probe in einem sterilen PCR-Röhrchen als Backup für den Fall, dass die PCR wiederholt werden muss.
3. Bereiten Sie die PCR-Reaktion vor (siehe Materialtabelle für das PCR-Kit), indem Sie 20 μl cDNAs (Produkte aus Schritt 8), 1 μl 2,5 μM Forward-Primer, 1 μl 2,5 μM Reverse-Primer, 25 μl 2x DNA-Polymerase-Puffer, 2 μl RNase-freies Wasser und 1 μl DNA-Polymerase hinzufügen.
   HINWEIS: Reagenzien können zu Mastermixen verarbeitet werden, um die Verarbeitung der Proben zu erleichtern. Fügen Sie dem Mastermix keine DNA-Polymerase hinzu.
4. PCR mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 °C für 1 min, gefolgt von 18 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 20 s - Glühen bei 58 °C für 20 s - Verlängerung bei 68 °C für 1 min.
   HINWEIS: Amplifizieren Sie nicht über den linearen Bereich hinaus. Insgesamt 18 Zyklen sind für die meisten Experimente optimal, dies kann jedoch kontextabhängig sein.
5. Erhitzen Sie die PCR-Produkte auf weniger als 25 μl und fügen Sie dann RNase-freies Wasser hinzu, um das Volumen wieder auf 25 μl zu bringen. Übertragen Sie 5 μl der PCR-Produkte in ein steriles 0,5-ml-Röhrchen, um die Größenverteilung zu überprüfen (siehe Schritt 9.6). Lagern Sie die restlichen 20 μL der PCR-Produkte bis zu weiteren Schritten bei -20 °C.
6. Überprüfen Sie die Größenverteilung der PCR-Produkte wie unten beschrieben.
   1. Bereiten Sie 3% Agarose-Gel in TAE-Puffer vor.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird Ethidiumbromid (EtBr) für die Färbung von Gelen nach der Elektrophorese verwendet (siehe Schritt 9.6.5). Geeignete DNA-Färbungen können in diesem Schritt in die Gellösung gegeben oder später für die Gelfärbung verwendet werden.
   2. Mischen Sie 1 μl 6x Ladefarbstoff in 5 μl PCR-Produkte (aus Schritt 9.5) und beladen Sie das Gel mit der Mischung.
   3. Laden Sie 5 μl DNA-Leitern in die Vertiefung vor der ersten Probe und in die Vertiefung nach der letzten Probe. Verwenden Sie 50 bp oder 100 bp DNA-Leitern, um eine verbesserte Größenunterscheidung von PCR-Produkten zwischen 150 bp und 300 bp zu ermöglichen.
   4. Führen Sie eine Gelelektrophorese durch, um die PCR-Produkte zu lokalisieren. Die geeignete Ausführungsbedingung kann kontextabhängig sein. Hier wird eine Gelplatte mit 17,78 cm (Breite) x 10,16 cm (Höhe) x 1 cm (Dicke) mit 120 V, 400 mA 75 min lang betrieben.
   5. Legen Sie das Gel in eine Schachtel und füllen Sie die Schachtel mit deionisiertem (DI) Wasser, bis das Gel vollständig eingetaucht ist. Geben Sie 10 μl EtBr in das DI-Wasser und tränken Sie das Gel. Wickeln Sie die Schachtel mit Folie ein und stellen Sie sie auf einen Shaker. Färben Sie das Gel 30 Minuten lang unter Schütteln.
   6. Entsorgen Sie den EtBr-haltigen Abfall in eine Abfallflasche, die sich in einem Abzug befindet. Spülen Sie das Gel einmal mit DI-Wasser ab und entsorgen Sie das EtBr-haltige Wasser in die Abfallflasche.
   7. Füllen Sie die Schachtel mit DI-Wasser, bis das Gel vollständig eingetaucht ist. Wickeln Sie die Schachtel mit Folie ein und stellen Sie sie auf einen Shaker. Waschen Sie das Gel 10 Minuten lang unter Schütteln.
   8. Entsorgen Sie das EtBr-haltige Wasser in der Abfallflasche im Abzug. Verwenden Sie einen Gel-Imager, um die Bänder zu visualisieren. Nehmen Sie ein hochauflösendes Bild des Gels auf.

10. Gel-Reinigung

1. Bereiten Sie 3% Agarose-Gel in TAE-Puffer vor. Stellen Sie mit breiten Kämmen (1 mm Dicke; 5 mm Breite; 15 mm Tiefe) ein Gel mit einer Dicke von 1 cm her, so dass jede Vertiefung mindestens 25 μl der Probenlade-Farbstoffmischung enthalten kann.
2. Mischen Sie 4 μL 6x Ladefarbstoff mit 20 μl PCR-Produkten (aus Schritt 9.5) und beladen Sie das Gel mit der Mischung. Lassen Sie leere Fahrspuren zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen während der Gelexzision zu minimieren.
3. Laden Sie DNA-Leitern, führen Sie eine Gelelektrophorese durch, färben und waschen Sie das Gel und nehmen Sie Gelbilder auf, wie in Schritt 9.6 beschrieben.
4. Excise die Gelblöcke, die PCR-Produkte innerhalb des Zielgrößenbereichs enthalten. Um die Kontamination mit Primer-Dimeren (175 bp-Linker ohne Inserts) zu minimieren, extrahieren Sie PCR-Produkte mit einer Größe über 195 bp (175 bp-Linker + 20 bp miRNAs).
5. Reinigen Sie die PCR-Produkte durch Gelextraktion. Verwenden Sie ein Gel-Extraktionskit (siehe Materialtabelle). Das Aufreinigungsprotokoll basiert auf dem Protokoll des Herstellers, mit geringfügigen Änderungen für die AQRNA-seq-Kompatibilität. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 17.900 x g für 1 min mit einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Messen Sie das Gewicht der Gelblöcke in den Tuben. Fügen Sie 6 Volumen Buffer QG (im Kit enthalten) zu 1 Volumen des Gelblocks hinzu (1 mg Gel entspricht ca. 1 μl).
   2. Inkubieren Sie bei 50 °C für 10 min oder bis zur vollständigen Auflösung der Gelblöcke. Vortex-Röhrchen alle 2 Minuten, um die Auflösung des Gels zu erleichtern. Nach dem Auflösen des Gels sollte die Mischung der Farbe des Buffer QG ohne das gelöste Gel ähneln. Wenn die Farbe orange oder violett ist, 10 μl 3 M Natriumacetat (pH = 5,0) hinzufügen und gründlich mischen.
   3. Geben Sie 1 Gelvolumen Isopropanol in die Mischung und mischen Sie sie gründlich. Legen Sie eine Spin-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen (im Kit enthalten).
   4. Um DNA zu binden, geben Sie die Probe (jeweils bis zu 750 μl) auf die Säule und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Die maximale Menge an Gel pro Spin-Säule beträgt 400 mg.
   5. Geben Sie 500 μl Puffer QG in die Säule und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein.
   6. Um die Verunreinigungen zu waschen, geben Sie 750 μl Buffer PE (im Kit enthalten) in die Säule, lassen Sie die Säule 5 Minuten stehen und zentrifugieren Sie. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Zentrifugieren Sie erneut, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen.
   7. Legen Sie die Säule in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Um DNA zu eluieren, geben Sie 30 μl Puffer EB (im Kit enthalten) in die Mitte der Säulenmembran, lassen Sie die Säule 4 Minuten stehen und zentrifugieren Sie.
   8. Die gelgereinigten PCR-Produkte werden in 12 μl Puffer EB beschleunigt und resuspendiert.
6. Messen Sie die Konzentration der konstruierten Bibliotheken durch UV-sichtbare Spektrophotometrie und/oder fluorometrische Quantifizierung.

11. Sequenzierung von Bibliotheken

1. Senden Sie die konstruierten Bibliotheken an ein externes Sequenzierungszentrum zur Qualitätsbewertung und Illumina-Sequenzierung. Um eine ausreichende Empfindlichkeit bei der quantitativen Kartierung kleiner RNA-Landschaften zu gewährleisten, entscheiden Sie sich für eine Paired-End-Sequenzierung mit 75-bp-Reads aus jeder Richtung (d. h. PE75) mit dem Ziel von mindestens 1,5 Mio. Rohsequenz-Reads in jede Richtung für jede Probe. Verwenden Sie benutzerdefinierte Primer (Tabelle 1) für die NextSeq-Sequenzierung, dies ist jedoch optional für die Sequenzierung auf MiSeq.
   HINWEIS: Die Sequenzierung kann mit den Plattformen MiSeq oder NextSeq500 durchgeführt werden. Die Wahl der Plattform kann von der Art der Proben und der Gesamtzahl der Proben abhängen.

12. Pipeline für Datenanalysen

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt eine grafische Darstellung vereinfachter Verfahren in der Datenanalyse-Pipeline, die Rohsequenz-Lesevorgänge (im FASTQ-Format) als Eingabe verwendet und eine Abundanzmatrix mit Zeilen generiert, die Mitglieder kleiner RNA-Spezies von Interesse darstellen, und Spalten, die Proben darstellen. Bei der Paired-End-Sequenzierung entspricht jede Probe zwei FASTQ-Dateien, eine für die Forward-Reads und die andere für die Reverse-Reads. Die komplette Data Analytics Pipeline mit allen zugehörigen Skripten und einem Handbuch mit umfangreichen Anmerkungen zu jedem Schritt ist auf GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) verfügbar.

1. Rufen Sie Rohsequenz-Reads aus dem externen Sequenzierungszentrum ab und bewerten Sie die Sequenzierungsqualität mit Open-Source-Programmen wie FastQC¹⁴ oder fastp¹⁵.
2. Erstellen Sie eine Referenzsequenzbibliothek im FASTA-Format.
   HINWEIS: Der Schlüssel zur Anpassungsfähigkeit der Pipeline an verschiedene kleine RNA-Klassen ist eine geeignete Referenzsequenzbibliothek. Um genaue Abundanzschätzungen von Mitgliedern bestimmter RNA-Klassen von Interesse (z. B. miRNA) zu erreichen, wird von den Benutzern erwartet, dass sie eine Referenzsequenzbibliothek für die Verwendung mit der Pipeline sorgfältig kuratieren. Alle anderen Anweisungen für die Pipeline-Ausführung bleiben über verschiedene kleine RNA-Klassen hinweg konsistent.
3. Erstellen Sie ein Verzeichnis mit dem Namen AQRNA-seq für die Implementierung der Datenanalysepipeline, und platzieren Sie alle Skripts, qualitätsgefilterten Sequenzlesevorgänge und die Referenzsequenzbibliothek in diesem Verzeichnis. Befolgen Sie die detaillierten Anweisungen auf GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), um Unterverzeichnisse vorzubereiten und wesentliche Änderungen an den Dateien vorzunehmen, die auf verschiedene Organismen und/oder kleine RNA-Spezies abzielen, sowie die Kompatibilität des Betriebssystems und/oder des Job-Schedulers.
4. Implementieren Sie die Datenanalyse-Pipeline gemäß den Schritten, die im Handbuch auf GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) beschrieben sind, das Beschreibungen, Eingabe- und Ausgabedateien sowie Befehlszeilen für jeden Schritt enthält. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Pipeline (i) das Trimmen von Linkersequenzen und zufälligen Nukleotiden aus den Reads, (ii) das Filtern von Reads basierend auf ihrer Länge, (iii) das Mapping der Reads auf die Referenzsequenzen, (iv) das Auflösen mehrdeutiger Mappings und (v) das Generieren der Häufigkeitsmatrix umfasst.

Results

Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) Stamm 1173P2, die exponentiell wuchsen, wurden einer Zeitreihe (0, 4, 10 und 20 Tage) von Nährstoffmangel unterzogen, gefolgt von einer 6-tägigen Wiederbelebung in nährstoffreichem Medium, wie zuvor in Hu et ^al.7 beschrieben. Kleine RNAs wurden aus Bakterienkulturen mit drei biologischen Replikaten zu jedem der fünf festgelegten Zeitpunkte isoliert. Die Illumina-Bibliotheken wurden unter Verwendung des oben beschriebenen AQRNA-seq-Verfahrens zur Vorbereitung der Bibliothek (Abbildung 1) erstellt, gefolgt von der Sequenzierung auf einem Sequenzierer am BioMicro Center des Massachusetts Institute of Technology. Die Sequenzierungsdaten wurden dann mit der AQRNA-seq-Datenanalyse-Pipeline (Abbildung 2) verarbeitet, die für die Quantifizierung der tRNA-Abundanz angepasst wurde.

Nach der PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek mit den Sequenzierungsprimern wurde in allen Proben das Vorhandensein von PCR-Produkten mit einer Größe von 175 Basenpaaren (bp) beobachtet (Abbildung 3A), was auf die Bildung von Primerdimeren hindeutet. Um die Verschleppung von Primer-Dimeren zu verringern, wurden PCR-Produkte mit einer Größe von mehr als 195 bp aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt (Abbildung 3B).

Qualitätsgefilterte und getrimmte Sequenz-Reads wurden einer benutzerdefinierten Referenzsequenzbibliothek zugeordnet, die die 45 tRNA-Isoakzeptoren, den internen Standard und die Kontrollsequenzen (d. h. 23S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA, rnpB und ssr) umfasst. tRNA-Isoakzeptoren machten 10,5 % bis 40,2 % der gesamten kartierten Reads einer bestimmten Probe aus und zeigten eine viel höhere Abundanz als die Kontrollsequenzen (Abbildung 4). Wichtig ist, dass die relativ niedrigen Leseanteile von tRNA-Isoakzeptoren auf die höhere relative Häufigkeit der internen Standards zurückzuführen sind. Daher können die Leseanteile der tRNA-Isoakzeptoren im Verhältnis zu den internen Standards (Abbildung 4, rosa vs. grüne Farbblöcke) vom Bediener kontrolliert werden, indem die Menge des internen Standards, der in die Reaktion eingespießt wird, fein abgestimmt wird.

Die rohen tRNA-Abundanzdaten wurden unter Verwendung der Methode des Medians der Verhältnisse normalisiert, die mit der DESeq2-Paketversion (im Folgenden als v) 1.36.0¹⁶ in R Statistical Programming Environment (im Folgenden als R bezeichnet) v 4.2.1¹⁷ implementiert wurde. Nach der Normalisierung wird eine quantitative Landschaft von tRNA-Isoakzeptoren in Mycobacterium bovis BCG während eines Zeitverlaufs von Nährstoffmangel und Wiederbelebung erreicht (Abbildung 5).

Um unterschiedliche Cluster von Proben mit unterschiedlichen Phänotypen basierend auf Mustern in der tRNA-Isoakzeptorhäufigkeit aufzudecken, wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA) an den normalisierten tRNA-Abundanzdaten unter Verwendung des stats-Pakets v 4.2.1¹⁷ in R durchgeführt (Abbildung 6). Die Analyse unterschied Proben von Hungertag 0 und Wiederbelebungstag 6 von Proben von Hungertagen 4, 10 und 20, was auf einen erheblichen Unterschied in der tRNA-Landschaft von Mycobacterium bovis BCG hindeutet, das in nährstoffarmen Medien und nährstoffreichen Medien angebaut wurde.

Um die Dynamik der Abundanz jedes tRNA-Isoakzeptors über die fünf festgelegten Zeitpunkte zu profilieren, wurde eine differentielle Expressionsanalyse an den normalisierten tRNA-Abundanzdaten unter Verwendung des DESeq2-Pakets v 1.36.0 in R durchgeführt (Abbildung 7). Die Analyse ergab, dass 17 der 20 Isoakzeptorfamilien Isoakzeptoren enthielten, die zu mindestens einem der Zeitpunkte differentiell exprimiert (d.h. signifikant hoch- oder herunterreguliert) wurden, was auf eine mögliche Rolle der Regulation des tRNA-Pools im persistenten Zustand von Mycobacterium bovis BCG während der Tuberkulose hindeutet.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs für die Vorbereitung von AQRNA-seq-Bibliotheken. Die wichtigsten Schritte, die im Workflow skizziert sind, werden in der Mitte des Schaltplans aufgelistet und sind durch gestrichelte Linien mit den jeweiligen grafischen Darstellungen verbunden. Eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte finden Sie im Abschnitt Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der AQRNA-seq-Datenanalyse-Pipeline. Die wichtigsten Schritte, die in der Pipeline skizziert sind, werden in der Mitte des Schaltplans aufgelistet und durch gestrichelte Linien mit den jeweiligen grafischen Darstellungen verbunden. Die detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte finden Sie unter GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Agarose-Gelelektrophorese der cDNA-Fragmente nach PCR-Amplifikation mit Sequenzierungsprimern. (A) Bild des Gels vor der Gelextraktion und -reinigung. Die Spuren 7 und 14 von der linken Seite enthalten 5 μl der 50 bp-DNA-Leiter, während die anderen Spuren 20 μl von jeder der 15 Proben enthalten. Die Größenlokalisierung der PCR-Produkte zeigt ihre höchste Konzentration im Bereich von 175 bp (Primer-Dimere) bis 300 bp (zwei Primer + 120 bp 5S rRNA). (B) Bild des Gels nach der Gelextraktion und -reinigung. Für jede Probe wurde der Gelblock zwischen 200 bp und 400 bp exzidiert, um die Kontamination von Primer-Dimeren in der Sequenzierungsbibliothek zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Anzahl der Sequenzlesevorgänge, die erfolgreich der Referenzsequenzbibliothek zugeordnet wurden. Die x-Achse zeigt die Namen der Proben (z. B. D18-69XX), gruppiert nach Zeitpunkt (z. B. Hungertag 0). Für jede Stichprobe wird die Leseanzahl, die den verschiedenen Zielthemenkategorien zugeordnet ist, durch übereinander gestapelte Farbblöcke dargestellt. Zahlen, die sich in der Mitte der Farbblöcke befinden, stellen die Anteile der Reads dar, die den jeweiligen Zielpersonen innerhalb einer bestimmten Stichprobe entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Quantitative Landschaft der tRNA-Isoakzeptoren von Mycobacterium bovis BCG zu verschiedenen Zeitpunkten entlang des Hunger- und Wiederbelebungszeitverlaufs. Die rohen tRNA-Abundanzdaten wurden mit der Methode des Medians der Verhältnisse normalisiert. Hier zeigt jede Zeile die normalisierten tRNA-Häufigkeiten (y-Achse) als Mittelwert ± Standardfehler für 3 biologische Replikate zu jedem Zeitpunkt. Auf der x-Achse wurden Isoakzeptoren aus der gleichen Familie gruppiert und mit der entsprechenden Aminosäure markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Quadrat-Kosinus-Diagramm von Proben, die aus der Hauptkomponentenanalyse (PCA) abgeleitet wurden. Die PCA wurde auf der Grundlage der normalisierten tRNA-Abundanz durchgeführt. Der quadrierte Kosinus gibt die Bedeutung der Hauptkomponenten für die Stichproben an, und die Stichproben wurden in Bezug auf den quadrierten Kosinus der ersten beiden Hauptkomponenten aufgetragen. Die Proben wurden mit Hilfe von Proben-IDs beschriftet und nach Zeitpunkt farbcodiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Differentielle Expression von tRNA-Isoakzeptoren über verschiedene Zeitpunkte hinweg. Normalisierte tRNA-Häufigkeiten wurden als Mittelwerte (Linienknoten) ± Standardfehler (Fehlerbalken) über 3 biologische Replikate zusammengefasst. Aus Platzgründen wurden die Bedingungen wie folgt abgekürzt: S0-S20 = Hungertage 0-20; R6 = Wiederbelebung Tag 6. Für jeden tRNA-Isoakzeptor wurde eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt, bei der verschiedene Zeitpunkte paarweise mit dem Likelihood-Ratio-Test und dem Wald-Test verglichen wurden. Kompakte Buchstaben wurden verwendet, um die statistische Signifikanz darzustellen, wobei sich die Häufigkeiten eines gegebenen tRNA-Isoakzeptors zu Zeitpunkten, die mindestens einen gemeinsamen Buchstaben teilen, nicht signifikant voneinander unterschieden. Zum Beispiel war die Häufigkeit von tRNA-Lys-CTT-1-1 (im Lysin-Panel) signifikant von S0 auf S4 und von S4 auf S10 herunterreguliert, aber nicht von S10 auf S20. Es wurde dann deutlich von S20 auf R6 hochreguliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Oligonukleotide, die an der Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek beteiligt sind. Der interne Standard ist RNA, während alle anderen Oligonukleotide DNA sind. Die aufgeführten PCR-Primer und benutzerdefinierten Sequenzierungsprimer sind spezifisch für die Sequenzierungsplattformen. Zusätzliche PCR-Primer können mit neuartigen Indexsequenzen gestaltet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Der Arbeitsablauf zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek wurde entwickelt, um die Erfassung von RNAs in einer Probe zu maximieren und den Polymeraseabfall während der reversen Transkription^{zu minimieren 7}. Durch eine zweistufige Linker-Ligation werden neuartige DNA-Oligos (Linker 1 und Linker 2) im Überschuss ligiert, um die RNA in der Probe vollständig zu ergänzen. Überschüssige Linker können effizient mit RecJf, einer 5'- bis 3'-Exonuklease, die für einzelsträngige DNAs spezifisch ist, entfernt werden, wobei die ligierten Produkte intakt bleiben. Darüber hinaus reduziert die AlkB-Behandlung Methylmodifikationen an RNAs¹⁸, die während der reversen Transkription zu einem Polymeraseabfall führen können, und verringert somit das Problem künstlich verkürzter cDNA-Produkte. AQRNA-seq stellt die erste beschriebene Methode zur systematischen Optimierung der Ligations- und Amplifikationseffizienz dar. AQRNA-seq wurde für seine quantitative Genauigkeit und das Fehlen von Bias-Artefakten validiert und hat sich als die genaueste Anwendung für miRNA-Profiling-Studien erwiesen.

AQRNA-seq ist bemerkenswert umfangreich, und für temperatur- und/oder zeitkritische Schritte während der Bibliotheksvorbereitung wird eine operative Sorgfalt empfohlen. Insbesondere sollten die Schritte vor der cDNA-Synthese (Abbildung 1; Schritte 1-4), bei denen Proben inhärent instabile einzelsträngige RNA (ssRNA) oder DNA-Linker-ligierte ssRNA enthalten, ohne unnötige Unterbrechungen durchgeführt werden. Die RNA-Hydrolyse (Abbildung 1; Schritt 6) unter Verwendung einer starken Base bei hoher Temperatur ist hocheffizient bei der Verdauung von RNA-Templates nach reverser Transkription¹⁹. Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass die Probe nicht länger der starken Base ausgesetzt ist und die Neutralisation mit starker Säure verzögert wird, insbesondere bei einer großen Probenzahl. Generell wird dringend empfohlen, alle Reaktionen auf Eis vorzubereiten und wiederholte Frost-Tau-Zyklen für Bibliothekszwischenprodukte zu vermeiden.

Die Probenahme von Bibliothekszwischenprodukten an Schlüsselpunkten entlang des Arbeitsablaufs wird für Qualitätsprüfungen und eine rechtzeitige Fehlerbehebung des Prozesses empfohlen. Die Analyse von Proben mit automatisierten Elektrophorese-Tools kann den Erfolg und die Effizienz der Linker-Ligation bestimmen (Abbildung 1; Schritte 2 und 7). Die Visualisierung der Lokalisierung von indizierten cDNA-Produkten nach PCR-Zugabe von Sequenzierungsprimern (Abbildung 1; Schritt 9) mittels Agarose-Gelelektrophorese kann bei der Beurteilung der Angemessenheit von PCR-Zyklen sowie bei der Identifizierung eines möglichen Abbaus von Proben und/oder des Vorhandenseins von Primerdimeren helfen. Die PCR- und Sequenzierungsprimer können so umgestaltet werden, dass sie mit der gewünschten Sequenzierungsplattform des Bedieners kompatibel sind.

Aufgrund der unterschiedlichen Designs, die bei der Bibliotheksvorbereitung erforderlich sind, wurde die AQRNA-seq-Datenanalyse-Pipeline in erster Linie aus benutzerdefinierten Skripten erstellt, die nur eine Handvoll vorhandener Bioinformatikprogramme umfassten. Für den Abgleich von Sequenz-Reads mit der Referenzsequenzbibliothek wurde jedoch das Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)²⁰ eingesetzt, da es verschiedene Stärken aufweist, die auf die spezifischen Anforderungen der AQRNA-seq-Datenanalyse zugeschnitten sind. Dazu gehören (i) die Fähigkeit, Lesevorgänge mit einer Genauigkeit von weniger als 20 bp auszurichten und Teilstring-Alignments durchzuführen, (ii) der sinnvolle Umgang mit mehrdeutigen Basen (N), (iii) die etwas höhere Ausrichtungsgenauigkeit und (iv) die informative Ausgabe, die wesentliche Details wie Diskrepanzen und Lücken liefert, was für verschiedene nachgelagerte Analysen förderlich ist.

Insbesondere gibt es noch einige Designherausforderungen sowohl im Workflow für die Bibliotheksvorbereitung als auch in der Datenanalyse-Pipeline von AQRNA-seq, die weitere Optimierungen rechtfertigen und den Schwerpunkt der aktuellen Arbeiten darstellen. Erstens wurde die überlegene quantitative Genauigkeit von AQRNA-seq im Vergleich zu herkömmlichen RNA-seq-Methoden mit 50-75 ng kleiner RNA-Input erreicht, während der Arbeitsablauf derzeit mit reduzierten Mengen an Input-RNAs getestet wird, um seine Sensitivität zu erhöhen, und mit längeren RNAs, um seinen Nutzen zu erweitern. Zweitens, obwohl die posttranskriptionelle Methylierung enzymatisch mit AlkB entfernt wird, gibt es andere RNA-Modifikationen, die während der reversen Transkription zu einem Polymeraseabfall führen können¹⁰. Dies kann zu künstlich verkürzten cDNA-Produkten führen, die nicht effektiv von einem biologisch bedeutsamen 5'-Abbau von tRNAs in voller Länge unterschieden werden konnten. Daher werden derzeit mehrere Möglichkeiten zur weiteren Verbesserung der Prozessivität der reversen Transkriptase auf ihre Wirksamkeit und Kompatibilität mit AQRNA-seq untersucht. Drittens ist die Entfernung von Primer-Dimeren durch Gelextraktion und -reinigung ineffizient und führt unweigerlich zu einem Verlust der Zielfragmente und einer erhöhten Variabilität zwischen den Bibliotheken. Daher stellt die Minderung einer potenziellen Verschleppung von Primer-Dimeren ohne Verlust von Zielfragmenten eine Möglichkeit dar, die Sensitivität und quantitative Genauigkeit von AQRNA-seq weiter zu verbessern. Wichtig ist, dass sowohl die AlkB-Behandlung als auch die Gelextraktion und -reinigung arbeitsintensiv sind, was sie für die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben suboptimal macht. Mit den erreichten Verbesserungen in den oben genannten Bereichen wird in Zukunft eine Automatisierung und Hochdurchsatzverarbeitung der AQRNA-seq-Methode ermöglicht. Bei der kontinuierlichen Verfeinerung der Datenanalyse-Pipeline stehen Verbesserungen in Bezug auf Effizienz, quantitative Genauigkeit und Flexibilität im Vordergrund. Während die aktuelle Pipeline effektiv 3'-Adapter aus den Sequenz-Reads abschneidet, besitzt eine Untergruppe von Reads auch 5'-Adaptersequenzen, wahrscheinlich aufgrund einer unzureichenden Blockierung des 3'-Endes der Linker während der Ligation. Das Vorhandensein von 5'-Adaptersequenzen kann die quantitative Genauigkeit beeinträchtigen, indem es die Ausrichtung der Sequenzlesevorgänge beeinträchtigt. Daher wird eine adäquate Entfernung sowohl der 3'- als auch der 5'-Adaptersequenzen durch den Einsatz zusätzlicher Adapter-Trimmwerkzeuge wie Cutadapt²¹ gewährleistet. Um die Effizienz zu steigern, wird die überarbeitete Pipeline rationale Strategien zur Reduzierung der Rechenzeit integrieren. Dies beinhaltet einen gepaarten End-Read-Assemblierungsschritt, um Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge zusammenzuführen, indem eine signifikante Überlappung identifiziert wird, und die Extraktion eindeutiger Sequenzen zusammen mit ihren Vorkommen in jeder Bibliothek. Es wird erwartet, dass solche Strategien die nachgelagerte Rechenzeit erheblich reduzieren, indem sie redundante Analysen von (i) Lesevorgängen aus beiden Richtungen und (ii) duplizierten Sequenzen, die den Sequenzlesepool von AQRNA-seq-Bibliotheken dominieren können, vermeiden. In Zukunft wird die synergetische Optimierung sowohl des Arbeitsablaufs für die Bibliotheksvorbereitung als auch der Datenanalyse-Pipeline von AQRNA-seq wahrscheinlich vielfältige Möglichkeiten bei der rigorosen quantitativen Untersuchung aller Formen von RNA (z. B. Transkriptom, tRNA-Fragmente und seltene RNA-Spezies wie zirkulierende Tumor-RNAs), der Kartierung von tRNA-Modifikationen und anderen zentralen Bereichen der Biomarker- und Entdeckungsbiologie eröffnen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Ketoglutarat	Sigma-Aldrich	75890	Bereiten Sie eine Arbeitslösung (1 M) vor und lagern Sie sie bei -20° ordm; C
2100 Bioanalysator Messgerät	Agilent	G2938C
Adenosin 5'-Triphosphat (ATP)	New England Biolabs	M0437M (Komponente #: N0437AVIAL)	NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM); Bereiten Sie eine Arbeitslösung (10 mM) vor und lagern Sie sie bei -20 μ ordm; C
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Bei Raumtemperatur lagern
Ammonium-Eisen(II)-sulfat-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	F2262	Arbeitslösung (0,25 M) herstellen und bei -20 μg lagern; C
Bioanalysator für die Analyse kleiner RNAs	Agilent	5067-1548	Die Small-RNA-Analyse dient zur Überprüfung der Qualität von Input-RNAs und der Effizienz enzymatischer Reaktionen (z.B. Linker-1-Ligation)
Rinderserumalbumin (BSA; 10 mg/ml)	New England Biolabs	B9000	Dieses Produkt wurde am 15.12.2022 eingestellt und durch Rekombinantes Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200) ersetzt.
Chloroform	Macron Feinchemikalien	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase wird mit der rtStar tRNA Vorbehandlung & Erststrang-cDNA-Synthesekit (AS-FS-004)
Desoxynukleotid (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (Komponente #: N0447LVIAL)	Dieser dNTP-Lösungsmix enthält äquimolare Konzentrationen von dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 10 mM)
Digitaler Dual-Heizblock	VWR Scientific Products	13259-052	Der Heizblock wird mit dem QIAquick  Gel-Extraktions-Kit
DyeEx  2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Wirksam bei der Entfernung kurzer Reste (z. B. Oligos mit einer Länge von weniger als 10 bp)
Elektrophorese-Netzteil	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Röhrchen (0,5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen (0,5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen (1,5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethylalkohol (Ethanol), reines	Sigma-Aldrich	E7023	Das reine Ethanol wird mit dem Oligo Clean and Concentrator Kit von Zymo Research verwendet
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), kein SDS	New England Biolabs	N0556S (Komponente #: B7025SVIAL)	NEB N0556S enthält Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder und Gel Loading Dye, Purple (6X), kein SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	Das Spektralphotometer wird zur Messung der Oligokonzentrationen nach dem Beerschen Gesetz
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	. Bereiten Sie eine Arbeitslösung (1 M; pH = 8 mit NaOH) vor und lagern Sie sie bei -20 & deg; C
Salzsäure (HCl) & nbsp;	VWR Scientific Produkte	BDH3028	Bereiten Sie eine Arbeitslösung (5 M) vor und lagern Sie sie bei Umgebungstemperatur
Isopropylalkohol (Isopropanol), reines	Macron Feinchemikalien	3032-16	Isopropanol wird mit dem QIAquick verwendet  Gel-Extraktions-Kit
L-Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A5960	Arbeitslösung (0,5 M) herstellen und bei -20 μm lagern; C
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (Komponente #: B7002SVIAL)	NEB M0264L enthält RecJf (30 U/μ L) und NEBuffer 2 (10X); Lagerung bei -20 °; C
Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Konzentrator-Kit	Zymo Research	D4061	Bei Raumtemperatur lagern
PEG 8000 (50%ige Lösung)	New England Biolabs	M0437M (Komponente #: B1004SVIAL)	NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM); Bereiten Sie eine Arbeitslösung (10 mM) vor und lagern Sie sie bei -20 μ ordm; C
Peltier Thermocycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl  Alkohol 25:24:1 pH = 5,2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Puffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transkriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick  Gel-Extraktions-Kit	Qiagen	28704	Dieses Kit benötigt einen Heizblock und Isopropanol, um mit
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England	Biolabs N0551S (Komponente #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (Komponente #: N0556SVIAL)	NEB N0556S enthält Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder und Gel Loading Dye, Purple (6X), kein SDS
RecJf  (30 U/μ L)	New England Biolabs	M0264L (Komponente #: M0264LVIAL)	NEB M0264L enthält RecJf (30 U/μ L) und NEBuffer 2 (10X); Lagerung bei -20 °; C
RNase Inhibitor (murin; 40 U/μ L)	New England Biolabs	M0314L ( Komponente #: M0314LVIAL)	Bei -20 Grad lagern; C
SeqAMP  DNA-Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 enthält SeqAMP  DNA-Polymerase  und SeqAMP  PCR-Puffer (2X)
SeqAMP  PCR-Puffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 enthält SeqAMP  DNA-Polymerase  und SeqAMP  PCR-Puffer (2X)
Garnelen-Alkalische Phosphatase (1 U/μ L)	New England Biolabs	M0371L ( Komponente #: M0371LVIAL)
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Arbeitslösung (5 M) herstellen und bei Raumtemperatur
lagern T4 DNA-Ligase (400 U/μ L)	New England Biolabs	M0202L ( Komponente #: M0202LVIAL)	NEB M0202L enthält T4-DNA-Ligase (400 U/μ L) und T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X)
T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X)	New England Biolabs	M0202L ( Komponente #: B0202SVIAL)	NEB M0202L enthält T4 DNA Ligase (400 U/μ L) und T4 DNA Ligase Reaktionspuffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L)	New England Biolabs	M0437M (Komponente #: M0437MVIAL)	NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM)
T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (Komponente #: B0216SVIAL)	NEB M0437M enthält T4 RNA Ligase 1 (30 U/μ L), T4-RNA-Ligase-Reaktionspuffer (10X), PEG 8000 (1X) und ATP (100 mM)