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Methodenartikel

Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

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DOI:

10.3791/66350

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7. Juni 2024

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1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entnahme einer Bauchspeicheldrüse des Schweins für die Isolierung und Reinigung von Inselzellen.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine aufstrebende Behandlung von Typ-I-Diabetes. Sie ist jedoch durch die Zuordnung und Verfügbarkeit von Spendern begrenzt. Die Xenotransplantation von Schweineinseln bietet eine vielversprechende Alternative zur Allotransplantation mit dem Potenzial für die großtechnische Produktion von funktionellen Inselzellen auf Abruf. Die Ausbeute und Lebensfähigkeit isolierter Inselzellen hängt stark von der Qualität der Spender-Bauchspeicheldrüse und der Art der Gewinnung ab, insbesondere von der Dauer der Warm-Ischämie-Zeit. Um die Organkonservierung und die anschließende Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselzellen zu verbessern, haben wir ein Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins entwickelt. Dieses Protokoll verwendet eine direkte infrarenale Aortenkanüle und Organperfusion, um sowohl die Zeit der warmen Ischämie zu minimieren als auch das Verfahren für Bediener zu vereinfachen, die nicht über umfangreiche chirurgische Erfahrung verfügen. Durch die anschließende arterielle Perfusion der Bauchspeicheldrüse über die Aorta wird stagnierendes Blut aus den Mikrogefäßen gespült, wodurch Thrombosen und oxidative Schäden am Gewebe reduziert werden. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen.

Einleitung

Typ-1-Diabetes wird durch die autoimmune Zerstörung von Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht1. Folglich sind die Patienten auf exogenes Insulin angewiesen, was sie einem hohen Risiko für glykämische Schwankungen mit Episoden von Hyper- und Hypoglykämie aussetzt2. Die Insel-Allotransplantation ist ein potenzielles Heilmittel für Typ-I-Diabetes. Die begrenzte Verfügbarkeit von Organspendern für die Bauchspeicheldrüse ist jedoch nach wie vor ein großes Hindernis für die breite Einführung des Verfahrens 2,3. Die Insel-Xenotransplantation von Schweinespendern ist eine vielversprechende Alternative, da diese Tiere leicht verfügbar sind. Die Optimierung und Skalierung der Isolierung von Pankreasinseln von Schweinen wird für den Fortschritt der Insel-Xenotransplantation von entscheidender Bedeutung sein.

Obwohl bereits mehrere Techniken zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse von Schweinen veröffentlicht wurden, beschreiben viele dieser Verfahren die Pankreeatomie nach Induktion des Herztodes oder der Exsanguination 4,5,6,7,8,9,10. Ein großer Nachteil dieser Techniken ist die variable warme ischämische Zeit (WIT), die zwischen dem Zeitpunkt des Herztodes und dem Beginn der intraarteriellen und/oder intraduktalen Infusion der Konservierungslösung auftritt. Bereits 10 Minuten WIT wirken sich negativ auf den Ertrag und die Rentabilität der Inselzellenaus 5. Die Minimierung der WIT erfordert eine sofortige Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit einer Konservierungslösung. Bei der Entnahme von Bauchorganen ist die Kanülierung der Aorta mit anschließender intrakorporaler Perfusion mit der Lösung der University of Wisconsin (UW) von entscheidender Bedeutung für die Blutentfernung, die Vorbeugung intravaskulärer Thrombosen, den Schutz vor ischämischen Schäden und die Minimierung von Zellschäden11,12.

Frühere Studien haben gezeigt, dass bei der Entnahme der Bauchspeicheldrüse des Schweins die Niederdruckspülung des Truncus coeliacus und der Arteria mesenterica superior mit UW-Lösung die Ausbeute und Reinheit der Inselzellen verbessert4. Zu den bisher veröffentlichten Methoden zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse von Schweinen gehört jedoch die Kanülierung der offenen Aorta, die insbesondere bei kleineren Schweinen eine technische Herausforderung darstellen kann 13,14,15. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll mit begleitenden visuellen Hilfsmitteln für die chirurgische Perfusion und Entnahme der Bauchspeicheldrüse des Schweins vor, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen. Diese neue Technik der Aortenkanülierung während der Pankreasisolierung wurde speziell entwickelt, um den WIT zu minimieren und die Pankreasbeschaffung in einem blutleeren Feld durchzuführen, um die Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselisolierung zu maximieren.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Washington University School of Medicine Division of Comparative Medicine genehmigt. Erwachsene Yorkshire-Schweine mit einem Gewicht von 35 bis 35 kg sind ideal für dieses Verfahren. Das Protokoll kann jedoch je nach Versuchskontext für Schweine unterschiedlicher Größe angepasst werden. Der gesamte Eingriff sollte steril in einem Operationssaal durchgeführt werden.

1. Präoperative Vorbereitung und Anästhesie

  1. Das Schwein wird mit einem Cocktail aus 4 mg/kg Tiletamin und Zolazepam, 20 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Xylazin, intramuskulär injiziert, sediert.
  2. Richten Sie einen peripheren venösen Zugang über die Vena auricularis ein.
  3. Einleitung einer Vollnarkose mit inhalativem 1%-3% Isofluran in 100% Sauerstoff und endotracheale Intubation des Schweins.
    HINWEIS: Es kann bevorzugt werden, Propofol oder ein anderes intravenöses Induktionsmittel anstelle eines Inhalationsmittels zur Induktion zu verwenden, um ein reibungsloseres Induktions- und Intubationsverfahren zu gewährleisten. Die Vitalparameter, das endtidale CO2, die Sauerstoffsättigung und die Herzwellenform werden kontinuierlich überwacht, um die Narkosetiefe zu beurteilen und aufrechtzuerhalten. Die abdominale Operationsebene wird mit Ultraschall am Krankenbett bestätigt.
  4. Rasieren und bereiten Sie das Schwein mit Chlorhexidingluconat von der sternalen Kerbe bis zu den beidseitigen Leisten vor.
  5. Drapieren Sie das Operationsfeld mit freier Sicht auf den gesamten Bauch (Abbildung 1A).

2. Operativer Aufbau und Freilegung des Retroperitoneums

  1. Führen Sie einen Laparotomieschnitt in der Mittellinie durch (Abbildung 1B).
    1. Verwenden Sie ein Skalpell mit 10 Klingen und Elektrokauter, um eine Mittellinien-Laparotomie vom Xiphoid-Prozess bis zum Schambein durchzuführen. Achten Sie darauf, den Schnitt um die untere Bauchöffnung herum zu krümmen.
  2. Führen Sie eine viszerale Drehung nach rechts aus.
    1. Externalisieren Sie den rechten Dickdarm und den Dünndarm und wickeln Sie sie in ein steriles Handtuch.
    2. Ziehen Sie den Dickdarm und den Darm vorsichtig nach links zurück, um das rechte Retroperitoneum freizulegen und gleichzeitig eine Darmdrehung oder Fehlrotation zu vermeiden.
  3. Entleeren Sie die Blase (optional).
    1. Wenn die Blase voll ist und die Exposition beeinträchtigt, greifen Sie die Blase zwischen zwei DeBakey-Pinzetten und verwenden Sie ein 11-Klingen-Skalpell, um die ventrale Blasenwand zu schneiden.
    2. Stecken Sie eine Yankauer-Saugspitze in die Blase, um den Urin abzuleiten und die Blase zu dekomprimieren.
  4. Richten Sie ein Bauchretraktor-Set ein, um eine optimale Freilegung des rechten Retroperitoneums zu ermöglichen (Abbildung 1C).

3. Retroperitoneale Dissektion

  1. Beginnen Sie mit der retroperitonealen Dissektion (Abbildung 2A).
    1. Schneiden Sie das Peritoneum rechts von der Mittellinie von der rechten Niere bis zur Aortengabelung mit Elektrokauter ein.
    2. Legen Sie die infrarenale Aorta, die untere Hohlvene (IVC) sowie die rechte Nierenarterie und -vene scharf frei
  2. Erhalten Sie eine zirkumferentielle Kontrolle der distalen infrarenalen Aorta mit einer großen Gefäßschlinge.
  3. Ligate den IVC (Abbildung 2B).
    1. Erhalten Sie eine zirkumferentielle Kontrolle der mittleren infrarenalen IVC.
    2. Lizieren Sie den IVC mit einer 2-0 Seidenkrawatte.
  4. Ligate die Nierengefäße (Abbildung 2C).
    1. Erlangen Sie eine zirkumferentielle Kontrolle der rechten und linken Nierenarterien und -venen.
    2. Lizieren Sie diese Strukturen mit 2-0 Seidenkrawatten.
    3. Wenn es mehrere Nierenarterien gibt, isolieren und ligieren Sie auf ähnliche Weise jedes dieser Gefäße.

4. Intrathorakale Dissektion

  1. Das rechte Hemidiaphragma einschneiden (Abbildung 3A).
    1. Ziehen Sie die Leber vorsichtig nach unten zurück, um das rechte Hemidiaphragma freizulegen. Legen Sie zwei Allis-Klemmen auf den membranösen Teil des rechten Hemidiaphragmas und schneiden Sie das Zwerchfell zwischen den beiden Klemmen mit Elektrokauter ein.
    2. Verlängern Sie die Zwerchfellmyotomie auf ca. 7 cm horizontal.
  2. Erhalten Sie eine umlaufende Kontrolle der intrathorakalen IVC (Abbildung 3B).
    1. Legen Sie eine 2-0 Seidenkrawatte um die intrathorakale IVC. Schnappen Sie die Enden der Naht mit einem kleinen Blutstillungsmittel ein, ohne die IVC zu verschließen.
  3. Verlängern Sie die Zwerchfellomie bis zum linken Hemidiaphragma (Abbildung 3C).
    1. Verwenden Sie zwei Allis-Klemmen, um den Rand der Zwerchfellomie nach unten zurückzuziehen und zum linken Hemidiaphragma zu verlängern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Eindringen in das Perikard während der Zwerchragmotomie.
  4. Legen Sie die absteigende thorakale Aorta in der linken posteromedialen Brustregion frei.

5. Kanülierung der infrarenalen Aorta, viszerale Isolierung und Perfusion

  1. Antikoagulation des Schweins systemisch.
    1. Verabreichen Sie systemisches Heparin (100 U/kg) über einen peripheren venösen Zugang. Warten Sie 3 Minuten, bevor Sie mit der Aortenkanüle fortfahren.
  2. Der Zugang zur infrarenalen Aorta erfolgt mit einer 18-G-Mikropunktionsnadel (Abbildung 4A).
  3. Führen Sie einen J-Draht durch die Nadel in die Aorta ein und entfernen Sie die Nadel über den Draht.
  4. Legen Sie eine 10Fr-Hülle über den Draht in die Aorta und entfernen Sie den Draht (Abbildung 4B).
  5. Verbinden Sie den Infusionsschlauch mit der 10Fr-Schleuse und infundieren Sie die UW-Lösung auf sterile Weise durch die Schleuse. Infizieren Sie die UW-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 40-60 Tropfen/min.
    HINWEIS: Der Fluss beginnt erst, wenn die thorakale Aorta geklemmt ist. Stellen Sie sicher, dass der intravenöse Schlauch nicht unter Spannung steht, um eine Verschiebung der intraaortalen Schleuse zu vermeiden.
  6. Führen Sie viszerale Isolierung und Perfusion in schneller Folge durch.
    1. Klemmen Sie die infrarenale Aorta mit einer Aortenklemme.
    2. Klemmen Sie die absteigende thorakale Aorta mit einer Aortenklemme.
    3. Binden Sie die intrathorakale IVC mit dem zuvor platzierten 2:0-Unentschieden ab.
    4. 100 mg/kg KCl zur Euthanasie über den peripheren venösen Zugang verabreichen.
      HINWEIS: Der Herztod beginnt mit der Verabreichung von KCl.
    5. Führen Sie eine Venotomie in der infrarenalen IVC durch, die der 2-0-Bindung überlegen ist, und führen Sie eine Pool-Absaugung durch die Venotomie ein (Abbildung 4C).
    6. Perfundierten Sie die Eingeweide mit 2-3 l kalter UW-Lösung.
    7. Fahren Sie mit der Dissektion für die totale Pankreatektomie während der Perfusion fort.
      HINWEIS: Die Eingeweide und insbesondere die Bauchspeicheldrüse sollten blass werden, wenn die UW-Lösung in die feste Organregion perfundiert wird (Abbildung 5A).

6. Totale Pankreatektomie

  1. Befreien Sie den Dünndarm von der Retraktion, während die UW-Lösung perfusiert.
  2. Beginnen Sie mit der Dissektion des Zwölffingerdarm-, Verbindungs- und Milzlappens der Bauchspeicheldrüse während der viszeralen Perfusion. Ziehen Sie den Magen nach oben zurück, um die Bauchspeicheldrüse freizulegen. Mit einer Kombination aus stumpfer Dissektion und Elektrokauter wird die Bauchspeicheldrüse von ihren omentalen Ansätzen getrennt.
    HINWEIS: Der Körper der Bauchspeicheldrüse legt sich effektiv um die Pfortader. Achten Sie darauf, dass die Pfortader nicht nach hinten zum Zwölffingerdarmlappen und dann nach vorne zur Brücke und den Verbindungslappen verläuft.
  3. Isolieren Sie den Pankreasgang (Abbildung 5B). Lokalisieren Sie den Pankreasgang, wo er in den Zwölffingerdarm eintritt. Verfugen Sie den Kanal mit zwei 3-0 Seidenbindern und durchschneiden Sie den Kanal zwischen den Kabelbindern.
  4. Vollständige Pankreatektomie (Abbildung 5C).
    1. Präparieren Sie den Rest des Zwölffingerdarmlappens von der C-Schlaufe des Zwölffingerdarms, bis er frei beweglich ist.
    2. Trennen Sie die Bauchspeicheldrüse von ihren restlichen Ansätzen. Ligatieren und teilen Sie die kleinen Gefäße von der Arteria mesenterica superior bis zur Bauchspeicheldrüse vorsichtig.
    3. Trennen Sie die Bauchspeicheldrüse von der Pfortader. Präparieren Sie den Körper der Bauchspeicheldrüse und den Verbindungslappen aus der Pfortader. Lilizieren Sie alle venösen Äste von der Pfortader zur Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Milzvene.
      1. Die Brücke der Bauchspeicheldrüse zwischen dem Verbindungslappen und dem Milzlappen durchschneiden, um eine freie Mobilisierung aus der Pfortader zu ermöglichen.
        HINWEIS: Achten Sie darauf, den Zwölffingerdarmlappen der Bauchspeicheldrüse nicht vom Milzlappen aus zu stören.
  5. Tauchen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse in kalte, sterile UW-Lösung und stellen Sie den Behälter sofort auf Eis. Transportieren Sie die Bauchspeicheldrüse zur Isolierung der Insel in eine sterile Haube. Fahren Sie mit der Isolierung der Pankreasinsel fort (Abbildung 6).

7. Kanülierung des Pankreasgangs

  1. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse auf ein steriles Tablett auf Eis in der Biosicherheitswerkbank.
  2. Präparieren Sie überschüssiges fibröses Gewebe und Blut von der Bauchspeicheldrüse weg.
  3. Schneiden Sie den Kanal bei Bedarf quer ab, um das Lumen besser sichtbar zu machen. Lokalisieren Sie die Kanüle und schieben Sie sie mit einem Katheter geeigneter Größe (16 G) in den Kanal.
  4. Befestigen Sie den Katheter mit einem 2.0-Seidenband, aber vermeiden Sie es, das Lumen zu verschließen.
  5. Bereiten Sie drei Dekontaminationslösungen vor und tauchen Sie die kanülierte Bauchspeicheldrüse 60 s lang in jede Dekontaminationslösung.

8. Durchblutung und Dehnung der Bauchspeicheldrüse

  1. Bereiten Sie die Enzymaufschlusslösung vor (Abbildung 6).
    1. Mischen Sie 100 mg handelsübliche Kollagenase 1 und 2 Lösungen (siehe Materialtabelle für weitere Details) mit der gewünschten Menge von 1x HBSS und 10.000 U Heparinlösung. Wenn das isolierte Pankreasgewebe zwischen 100 g und 200 g liegt, mischen Sie das Enzym mit insgesamt 200 mL 1x HBSS und Heparinlösung.
  2. Infusion der Bauchspeicheldrüse mit der Enzymlösung.
    1. Mit kontrollierter mäßiger Kraft die Enzymlösung in 60 ml Boli in den Pankreasgang infundieren. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die gesamte Enzymlösung in die Bauchspeicheldrüse infundiert ist.
      HINWEIS: Eine wirksame Infusion sollte dazu führen, dass sich das Bauchspeicheldrüsengewebe ausdehnt.
    2. Wenn eine Enzymlösung aus dem Bauchspeicheldrüsengewebe in die sterile Schale austritt, injizieren Sie diese restliche Lösung in Schritt 8.3 erneut in die Bauchspeicheldrüse oder geben Sie sie in Schritt 9.2 in die Ricordi-Kammer.
  3. Injizieren Sie die restliche Enzymlösung mit einer 22-G-Nadel direkt in schlecht aufgeblähte Pankreasparenchymsegmente.

9. Verdauung der Bauchspeicheldrüse

  1. Stellen Sie den Kreislaufbehälter mit 500 mL 1x HBSS in ein auf 47 °C eingestelltes Wasserbad, um die Speicherlösung vorzuwärmen.
    HINWEIS: Die Enzymlösung funktioniert optimal bei 36-38 °C und diese Temperatur muss innerhalb von 5 Minuten nach dem Starten der Schlauchpumpe erreicht werden. Die Temperatur des Inhalts des Ricordi, einschließlich der mit Enzymen angereicherten Bauchspeicheldrüse, beträgt zunächst 4 °C. Durch das Vorheizen des Kreislaufbehälters auf 47 °C vermischen sich der Inhalt des Behälters und der Ricordi-Kammer, wodurch die Temperatur des gesamten Kreislaufs innerhalb von 5 Minuten nach dem Starten der Schlauchpumpe auf 36-38 °C ansteigt.
  2. Entfernen und entsorgen Sie den Katheter aus dem Pankreasgang und schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse in ~1-3 cm große Stücke.
  3. Bereiten Sie den Aufschlusskreislauf vor. Die Peristaltikpumpe zirkuliert die Lösung aus dem Reservoir des Aufschlusskreislaufs durch die Heizspirale in die Ricordi-Kammer (Abbildung 6).
  4. Legen Sie die Pankreasstücke mit neun 1,5 cm großen Siliziumnitrid-Murmeln in die Ricordi-Kammer und füllen Sie sie bis zur Filterebene mit der restlichen Enzymlösung.
  5. Um die Ricordi-Kammer abzudichten, setzen Sie den Netzfilter und die Gummidichtung und anschließend den Deckel auf die Ricordi-Kammer. Sichern Sie den Deckel der Ricordi-Kammer, indem Sie die Schrauben festziehen und sicherstellen, dass die Kammer gut abgedichtet ist, bevor Sie fortfahren.
  6. Stellen Sie die Heizspirale in ein 47 °C heißes Wasserbad.
  7. Legen Sie die Zu- und Abflusskanülen in das Reservoir des Aufschlusskreislaufs mit 500 mL 1x HBSS.
  8. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 450 mL/min, bis die gesamte Kammer mit der Aufschlusslösung gefüllt ist. Verringern Sie die Durchflussrate auf 100 ml/min, während die Flüssigkeit im Kreislauf zirkuliert.
  9. Schütteln Sie die Verdauungskammer manuell, um das Gewebe mit den Siliziumnitrid-Murmeln zu bewegen.
  10. Beginnen Sie mit einem 8-minütigen Aufschluss, entnehmen Sie eine 1-ml-Probe aus dem Kreislaufreservoir für die Dithizon (DTZ)-Färbung, um den Aufschlussfortschritt zu überwachen.
    1. Um die DTZ-Färbung vorzubereiten, lösen Sie 10 mg DTZ in 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. 10 μl des vorbereiteten DTZ-Farbstoffs werden zu 1 ml der Aufschlussprobe gegeben. Untersuchen Sie die Probe unter 4-facher Vergrößerung. Die Inselzellen erscheinen dunkelrot bis schwarz mit DTZ-Färbung.
      HINWEIS: Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die meisten oder alle beobachteten Inseln "frei" und intakt sind, wobei das Azinusgewebe in kleinere Cluster zerstreut ist.
  11. Wenn der Aufschluss abgeschlossen ist, überführen Sie die Spirale in das Eisbad, entfernen Sie die Zuflusskanüle aus dem Reservoir und erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 210-250 ml/min. Lassen Sie das verdaute Gewebe aus der Ricordi-Kammer in das Kreislaufreservoir abfließen.
    HINWEIS: Es ist typisch, dass nach der Verdauung nur sehr wenig Gewebe in der Ricordi-Kammer verbleibt. In der Regel verbleiben <10 % unverdautes Pankreasgewebe, obwohl dies aufgrund probenspezifischer Faktoren variieren kann.
  12. Wiegen Sie das verbleibende Gewebe, um die Effizienz der Verdauung zu bestimmen. Übertragen Sie das verdaute Gewebe aus dem Kreislaufreservoir in konische 250-ml-Röhrchen, die auf Eis kühl gehalten werden.

10. Entnahme von Bauchspeicheldrüsengewebe

  1. Das verdaute Pankreasgewebe wird in konischen 250-ml-Röhrchen bei 250 × g für 1 min bei 4 °C ohne Bremse zentrifugiert.
  2. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und saugen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette ab, wobei ein Zerbrechen des Pellets vermieden wird.
  3. Resuspendieren Sie die Pellets vorsichtig in jedem konischen Röhrchen und kombinieren Sie sie zu einem konischen 250-ml-Röhrchen. Wenn ≤50 ml Gewebe vorhanden sind, resuspendieren Sie das Pellet auf ein Gesamtvolumen von 100 ml in der Inselauffanglösung. Wenn >50 ml Gewebe vorhanden sind, resuspendieren Sie das Pellet auf ein Gesamtvolumen von 200 mL in der Inselauffanglösung. Für den Fall, dass mehr als 100 ml Gewebe entnommen werden, führen Sie zwei Aufreinigungszyklen mit dem Zellprozessor durch.
  4. Resuspendieren Sie das Gewebe in RPMI-Medium, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten (unter der Annahme, dass 50 ml Gewebe entnommen wurden) und laden Sie es in den Zellprozessor.

11. Reinigung von Inselzellen mit der Methode des kontinuierlichen Gradienten

  1. Grundieren Sie den Zellprozessor gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Laden Sie 125 mL High Density Gradientenlösung in den kontinuierlichen Gradientenformer und laden Sie dann die High Density Gradientenlösung mit einem Pumpenset bei 200 mL/min in den Zellprozessor.
  3. Starten Sie die Zentrifugenfunktion des Zellprozessors bei 1.000 U/min.
  4. Lassen Sie die Luft aus dem System und entlüften Sie sie mit High-Density Gradient Solution.
  5. Geben Sie 125 mL Gradientenlösung mit hoher Dichte und 130 mL Lösung mit niedriger Dichte in den Gradientenbildner.
  6. Laden Sie die 100 ml der verdauten Gewebesuspension.
  7. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit des Zellenprozessors 3 Minuten lang auf 2.000 U/min.
  8. Bereiten Sie 16 konische 50-ml-Röhrchen für die Sammlung der gereinigten Inselfraktionen vor. Geben Sie 25 mL RPMI-Medium in jedes Röhrchen und ordnen Sie alle Röhrchen in aufsteigender Reihenfolge an.
  9. Sammeln Sie die gereinigten Inselfraktionen in den vorbereiteten konischen Sammelröhrchen.

12. Inselbewertung und Färbung

  1. Sammeln Sie 100-200 μl Aliquots aus jeder der gereinigten Inselfraktionen und legen Sie sie für die DTZ-Färbung zur Beurteilung des Inselgehalts und aus jeder Aufreinigungsfraktion in eine 24-Well-Gewebekulturplatte. Untersuchen Sie jede Fraktion mit Lichtmikroskopie mit 4-facher Vergrößerung. Die Inselzellen erscheinen dunkelrot bis schwarz mit DTZ-Färbung.
  2. Sobald die Inselzellen identifiziert sind, wählen Sie die Fraktionen mit dem höchsten Gehalt an Inselzellen aus. Die gereinigte Fraktion wird bei 250 × g 1 min lang bei 4 °C ohne Bremse zentrifugiert.
  3. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie das Inselpellet in einem Inselwachstumsmedium. Die gereinigten Inselzellen werden in 1-4 T-125-Kulturflaschen überführt.
  4. Bewerten Sie die Inselzellen nach der Reinigung auf Menge, Lebensfähigkeit und Funktion.
    1. Verwenden Sie einen Zähler für Inselzellen, um die Anzahl und Größenverteilung der Inselzellen auszuwerten (Abbildung 7A). Eine ganze Bauchspeicheldrüse liefert in der Regel 1-2 Millionen Inseläquivalente.
    2. Für die Viabilitätsfärbung mischen Sie 2 μl Calcein AM und 2 μl Ethidium-Homodimer-1 (CaAM/EthD-1) mit 1.000 μl PBS (Abbildung 7B). Lassen Sie die Inselzellen 30 Minuten lang färben und bewerten Sie sie dann mit unter 4- oder 10-facher Vergrößerung. Lebensfähige Inseln färben sich grün, während nicht lebensfähige Inseln rot werden.

13. Zellkultur von Pankreasinseln

  1. Während der ersten 48 Stunden werden die Inselzellen in einem Rückgewinnungsmedium bei 37 °C kultiviert, um ausreichend Nährstoffe bereitzustellen (~1.000 Inseln/ml Rückgewinnungsmedium).
  2. Von Tag 2 bis 21 werden die Inselzellen in Standard-Wachstumsmedium bei 37 °C kultiviert.

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Ergebnisse

Der operative Aufbau und die Mittellinien-Laparotomie sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Laparotomieschnitt sollte gekrümmt sein, um die urogenitale Öffnung zu vermeiden (Abbildung 1B). Befestigen Sie beim Aufstellen des Retraktors den Pfosten für den Omni- oder Bookwalter-Retraktor an der linken, unteren Ecke des Tisches. Die ideale Retraktion umfasst zwei Retraktorklingen für die rechte Bauchdecke, zwei für die linke Bauchdecke und 1-2 für den rechten Dickda...

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Diskussion

Die Xenotransplantation von Pankreasinseln mit Schweinespendern ist eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Typ-I-Diabetes. Die Isolierung von Inselzellen ist eine Herausforderung, und die Lebensfähigkeit und Ausbeute der endgültigen Inselzellen sind sehr anfällig für Hypotonie und Gewebeischämie, die bei der Organentnahme auftreten16,17. Um die Beschaffung und den Erhalt der Bauchspeicheldrüse zu optimieren, stellt d...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

Dieses Manuskript wurde durch ein klinisches Innovationsstipendium der Mid-America Transplant Foundation unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 M NaOH, 100 mLMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 bis 30 &de; C)Thermo Fisher14065056
1x D-PBS, 500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS, 1 LThermo Fisher14025076
250 mL Konische RöhrchenMillipore SigmaCLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
Antiseptikum Povidon Jod 10%Millipore Sigma25655-41-8
BioRad Gradient FormerBioRad395
Calciumchlorid-DihydratThermo Fisher10035-04-8
COBE ZellprozessorEbay317690 
Behälter für Aufschlusskreislauf, Gibco-Flasche, 1 lThermo Fisher10341001
Dimethylsulfoxid (DMSO)Thermo Fisher85190
DithizoneThermo Fisher60-10-6
Gradientenformer AnschlusskitBioRad1652008
Heparin [1000 U/ml]Notfallmedizinische Produkte0409-2720-01
HEPES-Puffer (1 m), 100 mLThermo Fisher15630080
Humanserumalbumin 25%, 100 mLCelprogenHSA2001-25-1
IsofluranCovetrusArtikel#:11695067772
KetaminPattersonArtikel #:07-894-8462
Liberase (100 mg)Millipore Sigma5401020001
LEBEND/TOT Viabilitäts-/Zytotoxizitäts-KitThermo FisherL3224
Lympholyt 1.1 Medium 500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 SchlauchMasterfle96419-16
Masterflex SchlauchpumpeMasterflex07522-30
PenStrep (2 mg/ml)CelprogenPS-30-002
Pulmozym (1 mg/ml, 2,5 ml/Fläschchen))Dornase Alfa8931278
Rückgewinnungsmedium, PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
Standard-Nährmedium, PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™ (Tiletamin und Zolazepam) Injektion CPattersonArtikel #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Lösung, 3 LGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
WasserbadSigma AlderichCLS6783-1EA
XylazinPattersonArtikel #:07-891-6165

Referenzen

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
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