Methodenartikel

Ein Schweinebrandmodell zur Untersuchung des Heilungsprozesses bei mehrfachtiefen Brandwunden

DOI:

10.3791/66362

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23. Februar 2024

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1Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children’s Boston, 3Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Rennes University, 4SITI Laboratory, UMR, INSERM, Université de Rennes, 5Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 6Innovative Therapies in Haemostasis, INSERM UMR-S, University of Paris

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein reproduzierbares Modell einer mehrfachtiefen Brandwunde bei einem Yucatán-Minischwein.

Zusammenfassung

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Die Heilung von Brandwunden ist ein komplexer und langwieriger Prozess. Trotz umfangreicher Erfahrung stehen plastische Chirurgen und spezialisierte Teams in Verbrennungszentren immer noch vor großen Herausforderungen. Zu diesen Herausforderungen gehört, dass sich das Ausmaß des verbrannten Weichgewebes in der Frühphase entwickeln kann, wodurch ein empfindliches Gleichgewicht zwischen konservativen Behandlungen und der Entfernung von nekrosierendem Gewebe entsteht. Thermische Verbrennungen sind die häufigste Art, und die Brenntiefe hängt von mehreren Parametern ab, wie z. B. Temperatur und Expositionszeit. Die Brenntiefe variiert auch im Laufe der Zeit, und die sekundäre Verschlimmerung der "Schattenzone" ist nach wie vor ein wenig verstandenes Phänomen. Als Reaktion auf diese Herausforderungen wurden mehrere innovative Behandlungen untersucht, und weitere befinden sich in der frühen Entwicklungsphase. Nanopartikel in modernen Wundauflagen und künstlicher Haut sind Beispiele für diese modernen Therapien, die sich noch in der Evaluierung befinden. Zusammengenommen müssen sowohl die Verbrennungsdiagnose als auch die Behandlung von Verbrennungen erheblich verbessert werden, und Forschungsteams benötigen ein zuverlässiges und relevantes Modell, um neue Instrumente und Therapien zu testen. Unter den Tiermodellen sind Schweine aufgrund ihrer starken Ähnlichkeit in der Hautstruktur mit dem Menschen am relevantesten. Genauer gesagt zeigen Yucatan-Minischweine interessante Merkmale wie Melaninpigmentierung und langsames Wachstum, was die Untersuchung hoher Phototypen und eine langfristige Heilung ermöglicht. Ziel dieses Artikels ist es, ein zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll zur Untersuchung von mehrtiefen Brandwunden bei Yucatan-Minischweinen zu beschreiben, das eine langfristige Nachbeobachtung ermöglicht und ein relevantes Modell für Diagnosen und therapeutische Studien bereitstellt.

Einleitung

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Verbrennungen sind ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit und betreffen jedes Jahr mehr als 480.000 Patienten in den USA, so das National Burn Repository 1,2. Dies führt zu mehr als 50.000 jährlichen Krankenhauseinweisungen wegen nicht tödlicher komplexer Fälle, die eine eingehende Behandlung erfordern2. Darüber hinaus sind Verbrennungen eine der Hauptursachen für die Mortalität und Morbidität bei Militärangehörigen und für 10 % bis 30 % der militärischen Verluste verantwortlich 3,4. Die Behandlung von Verbrennungen ist trotz ihrer immensen und vielfältigen Auswirkungen auf die Patienten, die von physisch über psychisch bis hin zu emotional reichen, lange Zeit nahezu unverändert geblieben5.

Die Erstdiagnose und Beurteilung von Brandverletzungen führt zu einer grundlegenden Klassifizierung nach der Art der Verbrennungen (erste, zweite und dritte) oder der Tiefe des betroffenen Gewebes (oberflächliche, partielle Dicke und tiefe Verbrennungen)6,7,8. Teildickenverbrennungen (ersten und zweiten Grades) betreffen die Epidermis und unterschiedliche Tiefen der Dermis (oberflächliche oder tiefe Dermis, d. h. oberflächliche und tiefe Verbrennungen zweiten Grades)9. Insbesondere schließt eine Schädigung der Gliedmaßen in der tiefen Dermis die Möglichkeit einer Re-Epithelisierung aus dem Adnexepithel10 aus. Definitionsgemäß erreichen Verbrennungen in voller Dicke das Unterhautfett, die Faszien und/oder den darunter liegenden Muskel (Verbrennungen dritten Grades) und manchmal auch den Knochen (auch als Verbrennungen vierten Grades bezeichnet)11,12.

Nach dem Krankenhausaufenthalt erhalten Patienten mit Verbrennungen eine besondere Betreuung, die eine Strategie verfolgt, die aus einem empfindlichen Gleichgewicht zwischen Gewebedebridement und -erhaltung besteht. Das geschädigte und/oder sekundär infizierte Weichgewebe muss schrittweise entfernt werden, bis gesundes Gewebe freigelegt ist, was die Verwendung spezifischer Verbände und Hauttransplantate zur Verbesserung des Heilungsprozesses ermöglicht 13,14,15,16. Während der Operation ist jedoch Vorsicht geboten, um eine unbeabsichtigte Entfernung von heilendem Gewebe zu vermeiden und Komplikationen für eine optimale Genesung zu reduzieren. Biologisch gesehen weisen Verbrennungen einen zentralen nekrotischen Bereich auf, der von einer "Schatten"- oder "Stasis"-Zone umgeben ist, was auf eine potenziell reversible Ischämie hinweist. Dieser Bereich kann sich entweder verschlechtern, was zu einer ausgedehnten Nekrosezone führt, oder durch Umkehrung des apoptotischen Prozesses heilen17,18. Diese unterschiedliche Schwere von Verbrennungen stellt für Chirurgen eine Herausforderung dar, eine genaue Beurteilung vorzunehmen, was das Gleichgewicht zwischen konservativen Behandlungen und chirurgischer Exzision erschwert19. Bisher gibt es kein effizientes Werkzeug, um diese "Schattenzone" vor der Brandumwandlung zu charakterisieren. Die Entwicklung solcher Werkzeuge ist entscheidend, um dieses empfindliche Gleichgewicht zu optimieren.

Es wurden mehrere Behandlungen getestet, um die Umwandlung von sekundären Verbrennungen zu verringern. In der Klinik gibt es derzeit jedoch keine spezifische Therapie18. Weitere Beispiele für Fortschritte bei der Behandlung von Verbrennungen sind die Entwicklung moderner Wundauflagen und Nanomaterialien20,21, Tissue-Engineering-Haut22,23 und neuartiger epidermaler Kulturansätze24,25. Auch die moderne rekonstruktive Chirurgie und die fasziokutanen Lappen haben die Behandlung von Langzeitnachwirkungen, insbesondere von Verbrennungskontrakturen nach pathologischer Heilung von Faltenbereichen, verbessert26,27. Diese Fortschritte bieten vielversprechende Aussichten für Verbrennungspatienten, indem sie ihre Behandlungsstrategien und ihre Lebensqualität verbessern, aber die jüngsten Ergebnisse zeigen, dass die funktionellen Auswirkungen sowohl im physischen als auch im psychischen Bereich nach wie vor erheblich sind28. Zusammengenommen ist die Nachfrage nach innovativen Fortschritten sowohl bei der Diagnose als auch bei der Behandlung von Verbrennungen erheblich.

Insgesamt zielen viele Ansätze darauf ab, die Diagnose, das Management und die Behandlung komplexer Verbrennungsfälle zu verbessern, und die Forscher benötigen ein reproduzierbares und relevantes Modell, um diese neuen Ansätze zu testen. Aufgrund seiner biologischen Komplexität, an der mehrere Organe und systemische Reaktionen beteiligt sind, erwies sich kein In-vitro-Modell als relevant für die Untersuchung des Verbrennungswundenprozesses29. Nagetiermodelle haben große Diskrepanzen mit dem Menschen gezeigt, die auf große Unterschiede in der Biologie, der Hautarchitektur, der Elastizität und der mangelnden Einhaltung der zugrunde liegenden Strukturen zurückzuführensind 29. Im Gegensatz dazu hat sich das Schweinemodell aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von Schweinehaut und menschlicher Haut als relevant erwiesen 30,31,32. Es weist eine ähnliche Vaskularisierung, elastische Faserzusammensetzung und einen ähnlichen Erneuerungszeitpunkt auf. Darüber hinaus ermöglichen der Haarfollikel und die apokrinen Anhänge eine isolierte Reepithelisierung, wie sie bei klinischen oberflächlichen Verbrennungen beobachtet werden kann33,34. Genauer gesagt bieten Yucatán-Minischweinemodelle interessante Merkmale, die sie für die Untersuchung pigmentierter Haut35 und langfristiger Ergebnisse mit minimalen körperlichen Veränderungen36 relevant machen.

Der Zweck dieses Artikels ist es, ein zuverlässiges Modell für mehrgradige Verbrennungen bei Yucatán-Schweinen zu beschreiben, das die Untersuchung mehrerer Verbrennungen zweiten und dritten Grades am selben Subjekt ermöglicht. Damit steht ein relevantes und reproduzierbares Modell für die Untersuchung diagnostischer und therapeutischer Innovationen für das Management von Verbrennungen zur Verfügung. Darüber hinaus zeichnet sich dieses Modell durch unterschiedliche Arten und Schweregrade von Verbrennungen, eine Langzeitbeobachtung, die die Untersuchung von Verbrennungskontrakturen und pathologischer Heilung ermöglicht, sowie ein differentielles Verhalten der pigmentierten Haut aus, von dem bekannt ist, dass es spezifische Merkmale aufweist.

Protokoll

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Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit der ARRIVE-Checkliste37 (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) durchgeführt und waren konform mit dem Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) gemäß Protokoll #2021N000271. Die Tiere wurden artgerecht versorgt, wobei dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren38 gefolgt wurde. Für diese Experimente wurden fünf 30 kg schwere weibliche Yucatán-Minischweine verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Präoperative Betreuung und Anästhesie

  1. Fasten Sie die Tiere 12 Stunden lang, bevor Sie eine Vollnarkose durchführen.
  2. Beginnen Sie die Anästhesie durch eine intramuskuläre Injektion von 2-4 mg/kg Tiletaminhydrochlorid und Zolazepamhydrochlorid und 1-2 mg/kg Xylazin, gefolgt von der Inhalation von Isofluran (2-3% Sauerstoff) (siehe Materialtabelle), um die Anästhesie während des Eingriffs aufrechtzuerhalten.

2. Design und Randomisierung von Brandwunden

  1. Um sowohl partielle als auch vollständige Verbrennungen mit Negativkontrollen am selben Tier (keine interindividuellen Variationen) zu untersuchen, legen Sie acht Wunden am Rücken jedes Schweins im paravertebralen Bereich an. Führen Sie drei Wunden in voller Dicke, drei Wunden mit teilweiser Dicke und zwei Kontrollwunden durch.
  2. Nummerieren Sie die Wunden von 1 bis 8 und führen Sie eine Randomisierung durch, um verschiedene Verbrennungsgrade (partielle Dicke, volle Dicke, Kontrolle) verschiedenen anatomischen Stellen auf dem Rücken zuzuweisen.
    HINWEIS: Die Randomisierung jeder Wunde (Tiefe und Lage) wird durchgeführt, um die Signifikanz zu verbessern: Es ist bekannt, dass die Schweinedermis in Bezug auf Dicke und Kollagenzusammensetzung variiert39. Daher wird die Randomisierung jedes Tieres verwendet, um potenzielle Verzerrungen zu verringern.

3. Abgrenzung der Tätowierungswunde

HINWEIS: Das erste Verfahren besteht darin, kreisförmige Tätowierungen auf dem Rücken des Schweins zu erstellen, um die randomisierten Wunden zu lokalisieren und zu nummerieren (Abbildung 1). Dies wird zwei Tage vor der ersten Verbrennung durchgeführt, um eine bessere Akklimatisation zu ermöglichen, kann aber auch am Tag der Verbrennung durchgeführt werden.

  1. Nach der Anästhesie (siehe Schritt 1) und der orotrachealen Intubation in Rückenlage40 bringen Sie das Schwein in die Bauchlage und legen Sie weiche Keile (Bettlaken) unter das Tier, um es bequem zu halten und zu stabilisieren (unter den Vordergliedmaßen, dem Nabelbereich und den Hintergliedmaßen)41. Legen Sie eine Umluft-Wärmedecke auf Kopf und Hals des Tieres, um eine angemessene Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
  2. Platzieren Sie eine gerade Linie mittig auf dem Rücken des Schweins, um die Symmetrie der Zeichnungen zu ermöglichen.
  3. Zeichnen Sie mit einem dermographischen Stift (siehe Materialtabelle) zwei vertikale Linien auf beiden Seiten der Mittellinie, die 6,5 cm seitlich von ihr platziert sind. Die beiden Seitenlinien werden verwendet, um den Mittelpunkt der Kreise zu platzieren.
  4. Zeichnen Sie jedes Paar Kreise mit einem Durchmesser von 4,5 cm symmetrisch und halten Sie dabei einen Mindestabstand von 4 cm zwischen zwei unterschiedlichen Kreisen ein (Abbildung 1A).
  5. Sobald die Zeichnungen fertig sind, führen Sie eine einstufige Hautvorbereitung (Povidon-Jod 7,5%) durch, um die Bakterienflora der Haut zu verringern.
  6. Führen Sie die Tätowierungsprozedur42 von acht 4,5 cm großen Kreisen mit einer Nadel-Tätowiermaschine, steriler schwarzer Tinte und einer sterilisierten 5-Punkt-Nadel durch (siehe Materialtabelle). Das Endergebnis ist in Abbildung 1B dargestellt.
  7. Im Falle einer verzögerten Brandentstehung tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe auf die Tätowierungen auf und bedecken Sie sie mit transparenten Klebeverbänden.

4. Entstehung von Brandwunden und fortschrittliche Wundauflage

HINWEIS: Verbrennungen werden erzeugt, indem der Messingblock in Kontakt mit der Haut für 30 s (unveränderlich) an der dafür vorgesehenen Stelle platziert wird (Randomisierung). Die Temperatur bestimmt die Brenntiefe.

  1. Am Tag der Verbrennung, sobald das Tier betäubt und in die Bauchlage gebracht wurde, wie in Schritt 1 beschrieben, legen Sie zylindrische Messingblöcke in Edelstahlbehälter, die mit Aluminiumperlen gefüllt sind (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Behälter auf eine temperierte Kochplatte. Stellen Sie eine Heizplatte auf 65 °C (für die Teildickenverbrennungen) und die zweite auf 93 °C (für die Volldickenverbrennungen, Abbildung 2) ein.
    HINWEIS: Der Behälter kann trocken gehalten werden, um Verbrühungen zu vermeiden (2-3 Stunden werden benötigt, um das Temperaturgleichgewicht zu erreichen) oder kann zur Hälfte mit Wasser gefüllt werden (30 Minuten, um das Temperaturgleichgewicht zu erreichen). Bei Verwendung von Wasser müssen die Messingblöcke vor Schritt 4.5 gründlich getrocknet werden, um spätere Verbrennungen durch Verbrühungen zu vermeiden.
  2. Führen Sie ein Thermometer über die zentrale Öffnung in den Messingzylinder ein, um die Kerntemperatur zu überwachen, und bestätigen Sie die Oberflächentemperatur mit einer Temperaturpistole. Erhöhen Sie bei Bedarf die Temperatur der Heizplatte im Zylinder trotz geringer Wärmeabgabe auf 65 °C bzw. 93 °C.
    HINWEIS: Aluminiumfolie kann verwendet werden, um den Behälter abzudecken und die Wärmeableitung weiter zu minimieren, wodurch die gewünschte Temperatur schneller erreicht wird.
  3. Parallel dazu bringen Sie das Tier für die Verbrennung in Bauchlage, ähnlich wie bei der Tätowierung (Schritt 3.1).
  4. Sobald das Tier in Bauchlage bereit ist, bereiten Sie die Haut in drei Schritten vor (Povidon-Jod 7,5%, Kochsalzlösung 0,9%, Trocknen).
  5. Fassen Sie den Messingblock mit hitzebeständigen Handschuhen an und platzieren Sie ihn je nach Randomisierung auf der entsprechenden Tattoo-Stelle. Starten Sie den Timer, sobald der Messingblock die Haut berührt. Achten Sie darauf, nicht mehr Druck auf die Haut auszuüben als das Eigengewicht des Messingblocks.
  6. Entfernen Sie nach 30 s den Messingblock von der Haut und legen Sie ihn wieder in den dafür vorgesehenen Heizbehälter. Überwachen Sie die Temperatur, bis sie das Ziel erreicht, und wiederholen Sie den Vorgang für alle Wunden.
  7. Führen Sie einen fortschrittlichen mehrschichtigen Verband durch, um die Stabilität des Verbandes zu gewährleisten, nachdem sich das Tier erholt hat.
    1. Legen Sie eine mit Erdöl imprägnierte Gaze auf jede Brandstelle, einschließlich der Bedienelemente, und decken Sie sie mit einer trockenen Vliesgaze und einem großen transparenten Klebeverband ab.
    2. Sprühen Sie eine Tinktur aus Benzoelösung auf die umgebende Haut, damit die transparenten Verbände besser auf der Haut haften.
    3. Wickeln Sie das Tier in einen selbstklebenden Klebewickelverband und achten Sie darauf, ihn nicht zu fest anzuziehen (Einschränkung des Lungenvolumens).
    4. Vervollständigen Sie das Dressing, indem Sie eine letzte Schicht röhrenförmiges Stockinette (Größe dem Tier angepasst) hinzufügen (siehe Materialtabelle). Alternativ können individuell angepasste Schweinejacken verwendet werden, wenn das Tier nicht in der Lage ist, den Verband für die Dauer der Studie sauber zu halten
    5. Stellen Sie eine korrekte Analgesie sicher, indem Sie ein transdermales Opioid (Fentanyl)-Pflaster auf den Hals des Tieres legen, nachdem Sie eine Einzeldosis Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg, IM) und eine Einzeldosis Carprofen (2-4 mg/kg, IM) injiziert haben.
    6. Nach jeder Anästhesie ist die Tiere bis zu 2 Stunden nach der Genesung engmaschig zu überwachen. Verwenden Sie bei Bedarf ein warmes Polster und geben Sie nach Erreichen einer vollständigen Standposition frei Futter.

5. Verbrennungen-Escharotomie in voller Dicke

HINWEIS: Zwischen 1 und 3 Tagen nach der Operation erhalten die Tiere nach den Verbrennungen dritten Grades eine chirurgische Entfernung des Schorfs in voller Dicke.

  1. Nach einer ähnlichen Vorbereitung des Tieres, einschließlich Anästhesie, Intubation und Versetzen des Tieres in Rückenlage, bereiten Sie die Haut über die dreistufige Hautvorbereitung vor und führen Sie eine sterile Drapierung des Rückens des Tieres durch.
  2. Führen Sie 4-mm-Stanzbiopsien (siehe Materialtabelle) an der Wunde durch, um die Art der Verletzung zu bestätigen.
  3. Die Scharorotomie43,44 wird durch einen kreisförmigen Schnitt des Schorfs mit einer sterilen Skalpellklinge (Nr. 15) bis zur tiefen Dermis durchgeführt.
  4. Fassen Sie eine Seite des Schorfs mit einer sterilen Adson-Gewebezange (mit 2/1 Zähnen) fest an (siehe Materialtabelle) und koppeln Sie sie nach oben, um die tiefe Grenze des Schorfs freizulegen.
  5. Setzen Sie die Öscharotomie mit der Skalpellklinge fort, während Sie in der gleichen Ebene innerhalb der tiefen Dermis/darunter liegenden Faszie bleiben. Eine blutende Dermis gilt als Zeichen für die Lebensfähigkeit des Gewebes.
    1. Wenn während des Prozesses eine Arteriole durchtrennt wird, führen Sie eine minimale Kauterisation mit einer bipolaren Gerinnungszange durch (siehe Materialtabelle). ACHTUNG: Eine großflächige Verätzung des angelegten Wundbettes kann eine verzögerte Heilung zur Folge haben und sollte strikt vermieden werden.
  6. Legen Sie einen ersten Satz trockenen Guaze für 5 Minuten auf das Wundbett, um die lokale Blutstillung zu verbessern, bevor Sie den endgültigen Verband legen.
  7. Verbinden Sie die Wunden ähnlich wie zuvor (Schritt 4.7), indem Sie mehrere trockene Gazen hinzufügen, um die Höhle zu füllen. Tragen Sie die gleichen Schichten wie zuvor erwähnt auf: Tinktur-Benzoe-Spray, selbstklebender transparenter Verband, selbstklebende Folie, röhrenförmige glatt mir.
  8. Stellen Sie eine Analgesie bereit, indem Sie das transdermale Opioidpflaster wechseln und Caprofen (2-4 mg/kg, IM) injizieren.

6. Nachsorge von Wundauflagen

HINWEIS: Nachfolgende Verbände werden alle 2 bis 7 Tage durchgeführt, abhängig vom Versuchsschema der Behandlung und der Verträglichkeit des Tieres. Wundauflagen können nach 21 Tagen abgesetzt werden, um eine erneute Epithelisierung in einer trockenen Umgebung zu ermöglichen und die Toleranz des Tieres zu verbessern. Wenn die Behandlungsgruppe eine feuchte oder feuchte Umgebung erfordert, können die Verbände alternativ bis zum Ende der Studie verlängert werden. Die Nachbeobachtungszeit wurde um bis zu 10 Wochen verlängert, um sowohl die akuten als auch die anhaltenden Heilungsprozesse zu untersuchen.

  1. Betäuben Sie das Tier für kurze Zeit und bringen Sie es mit einem Nasenkonus in Rückenlage (Isofluran 2-5 L/min).
  2. Entfernen Sie die vorherigen Verbände und reinigen Sie die Wunden mit steriler 0,9%iger Kochsalzlösung und steriler Gaze.
  3. Wenden Sie gegebenenfalls die experimentelle Behandlung an.
  4. Führen Sie während dieses Verfahrens in ähnlicher Weise nachfolgende Biopsien durch, falls dies für die Studie erforderlich ist. Das Tier sollte dann Schmerzmittel wie Carprofen (2-4 mg/kg, IM, 24 h Wirkung) erhalten.
  5. Decken Sie alle Wundstellen, einschließlich Kontrollwunden, mit erdölimprägnierter oder gleichwertiger Gaze, trockener Vliesgaze und transparentem Klebeverband ab.

Ergebnisse

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Abbildung 2A,B zeigt die Ergebnisse mehrerer Verbrennungen am Rücken eines Yucatàn-Minischweins. Die Wunden (I) und (VII) sind Kontrollwunden (37 °C). Wunden zweiten Grades (II; III und VIII) zeigen sich mit starken Rötungen und Bläschen. Im Gegensatz dazu sind Wunden dritten Grades (IV; V; und VI) sind blaß und bis zum Abtasten verhärtet. Es ist zu beachten, dass Wunde VIII zwischen dem zweiten und dritten Grad liegt: Für die Zwecke einer laufenden Studie haben wir die Kontaktzeit auf 45 s bei 65 Grad erhöht. Abbildung 2C zeigt das Aussehen der Wunden nach der Öscharotomie am postoperativen Tag 3. An den Wunden zweiten Grades wurde eine Blasenektomie durchgeführt, und an den Wunden dritten Grades wurde eine "En-bloc"-Exzision des verhärteten verbrannten Gewebes durchgeführt, um ein lebensfähiges Wundbett für die Sekundärheilung zu schaffen. Eine minimale Kauterisation des Plexus dermalis wurde durchgeführt, wenn die Blutung nicht spontan aufhörte. Die Abbildungen 2D-F zeigen das Aussehen der Wunden zu den nachfolgenden Zeitpunkten (Woche 2, Woche 3 bzw. Woche 7).

Die histologischen Befunde sind in Abbildung 3 dargestellt (H&E, 5,5x und 20x). Die Kontrollhaut (Abbildung 3A,B) zeigt eine intakte Epidermis (blaues Bracket), einschließlich eines Stratum corneum (blauer Pfeil), das am restlichen Hautgewebe anhaftet. Die Dermis zeigt eine homogene blassrosa Eosinophilie (Kollagen und elastische Fasern - rotes Sternchen). Verbrennungen zweiten Grades (Abbildung 3D,E) zeigen einen Verlust des Stratum corneum im Vergleich zu den Kontrollen (Spaltebene, entsprechend den Blasen). Die oberflächliche Dermis zeigt eine stärkere Eosinophilie und Fissuren/Frakturen innerhalb der dermalen Strukturen (blaue Pfeile). Tiefe Blutgefäße bleiben erhalten (roter Pfeil). Die Verbrennungen dritten Grades (Abbildung 3G,H) zeigen ausgedehnte Verletzungen mit erhöhter Eosinophilie der Dermis bis hin zu schweren Hautfrakturen (blaue Pfeile), die von der tiefen Dermis bis zur Unterhaut reichen (Adipozytenleere, grünes Sternchen). Schließlich ermöglicht die Trichrom-Färbung (Abbildung 3C,F,I) eine bessere Beurteilung des Bindegewebes. Es nutzt die Unterschiede in der Färbbarkeit von hitzevergälltem Kollagen, um die Brenntiefe anzuzeigen. Abbildung 3C zeigt deutlich die blauen Merkmale in der intakten Dermis der Kontrollwundbiopsie mit der oberen Epidermisschicht. Dies steht im Gegensatz zur Verbrennung zweiten Grades (Abbildung 3F), bei der der Epithelverlust mit einer Kollagendenaturierung in der oberen Dermisschicht einhergeht (weißes Sternchen). Die Wunde dritten Grades (Abbildung 3I) schließlich zeigt den Verlust der Epidermisschicht mit einer ausgedehnten roten Färbung (gelber Pfeil) der Hautschicht, was auf eine vollständige Kollagendenaturierung in dieser Hautschicht hinweist.

Modellversuchsdiagramm für Verbrennungsverletzungen; Beheizter Messingblock für kontrollierte Induktion thermischer Verletzungen.
Abbildung 1: Operative Raumpositionierung, Einrichtung des Verbrennungsgeräts und Studiendesign. Das Tier wird betäubt, intubiert, beatmet und in Rückenlage gelegt. Der Messingblock wird in den vorgeheizten Behälter gelegt, der mit Aluminiumperlen +/- Wasser gefüllt ist. Ein Thermometer ist zentral im Messingblock platziert, um die Überwachung der Kerntemperatur zu ermöglichen. Die angestrebte Temperatur hängt von der angestrebten Brenntiefe gemäß dem Studiendesign ab. Um Teilverbrennungen zu provozieren, wird ein Kontakt von 30 s bei 65 °C ohne zusätzlichen Druck empfohlen. Bei Verbrennungen dritten Grades wird ein Kontakt von 30 s bei 93 °C ohne zusätzlichen Druck empfohlen. Verbrennungen zweiten und dritten Grades sollten randomisiert werden, um Verzerrungen aufgrund unterschiedlicher Hautdicke zu vermeiden. Die vortätowierte Wundlokalisation ermöglicht eine einfache Überwachung jeder randomisierten Wunde während der Nachsorge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Verlaufsdiagramm der Wundheilung, Diagramm der kreisförmigen Hautbiopsien bei unterschiedlichen Hauttönen im Laufe der Zeit.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der Wundaspekte nach randomisierten mehrtiefigen Verbrennungen bei einem Yucatán-Minischwein. (A) Die Tätowierung wird durchgeführt, indem sie an der Stelle aller 8 Wundpunkte platziert wird. Jeder Standort ist nummeriert, um die Überwachung zu erleichtern. (B) Aspekt der Wunden nach der Entstehung der Verbrennung. Die Wunden I und VII sind Kontrollen, und die Wunden II, III und VIII sind Wunden mit partieller Dicke. Die Wunden IV, V und VI sind Wunden dritten Grades. (C) Aussehen der Wunden nach Öscharotomie der Wunden dritten Grades auf POD3. Eine Blasenektomie wurde auch an den teildicken Wunden durchgeführt. (D) Aspekt der Wundheilung auf POD14, der ein sauberes Wundbett der Wunden dritten Grades (II und V) und Re-Epithelisierungsinseln aus den Hautanhängseln auf den Wunden mit partieller Dicke (III, IV, VI, VII, VIII) zeigt. (E) Aspekt des Wundheilungsprozesses auf POD21, der eine Kontraktur der Wundbetten dritten Grades und eine weitere Reepithelisierung an den Wunden zweiten Grades zeigt. (F) Aspekt der Wunden auf POD49, der eine fortgeschrittene Wundkontraktur an den Wunden dritten Grades und eine subtotale Epithelisierung der partiellen Wunden mit wichtiger postinflammatorischer Hyperpigmentierung zeigt. Bitte beachten Sie, dass die angezeigten Wunden Narben an der Biopsiestelle aufweisen können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Histologie der Wundheilung von Verbrennungen: Kontrolle, Verbrennungen 2., 3. Grades. Gefärbte Gewebeproben, Analyse.
Abbildung 3: Histologische Befunde. Repräsentative Ergebnisse des histologischen Aspekts der Wunden [Lichtmikroskopie 10x (A,C,D,F,G,I) und 20x (B,E,H); Hämatoxylin und Eosin (A, B, D, E, G, H); Massons Trichromie (C,F,I)]. Die Kontrollhaut (A,B) zeigt eine intakte Epidermis (schwarze Klammer), einschließlich eines Stratum corneum (schwarzer Pfeil), das am restlichen Hautgewebe anhaftet. Die Dermis zeigt eine homogene blassrosa Eosinophilie (Kollagen und elastische Fasern - rotes Sternchen). Die Trichrom-Färbung (C) zeigt das normale Aussehen der Epidermisschicht und des Bindegewebes und der dermalen Kollagenfasern. Verbrennungen zweiten Grades (D,E) zeigen einen Verlust des Stratum corneum im Vergleich zu den Kontrollen (Spaltebene, die während der Blasenektomie entfernt wurde). Die oberflächliche Dermis zeigt eine stärkere Eosinophilie und Fissuren/Frakturen innerhalb der dermalen Strukturen (blaue Pfeile). Tiefe Blutgefäße bleiben erhalten (roter Pfeil). Trichrom (F) zeigt einen Verlust des Epithels, begleitet von einer Kollagendenaturierung in der oberen Dermisschicht (gelber Pfeil). Die Verbrennungen dritten Grades (E,F) zeigen ausgedehnte Verletzungen mit erhöhter Eosinophilie der Dermis bis hin zu schweren Hautfrakturen (blaue Pfeile), die von der tiefen Dermis bis zur Unterhaut reichen (Adipozytenleere, grünes Sternchen) und ausgedehnte rote Färbung (I, gelber Pfeil) der Hautschicht mit Trichrom, was auf eine vollständige Kollagendenaturierung hinweist. Maßstabsleisten: A,D,G, 500 μm; B,E,H, 100 μm; C,F,I, 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Statisches Gleichgewicht; Durchdringung des Thermometers; Diagramm, Aufbau, Ergebnis; Experiment zur thermischen Ausdehnung.
Abbildung 4: Technische Zeichnung des Messingblocks, der für die Herstellung von Brandwunden verwendet wurde. (A) Abbildung mit den Abmessungen des Messingblocks, der für den Bau des Blocks verwendet wurde. Ein Durchmesser von 40 mm ermöglicht es, Wunden optimal zu vergrößern und gleichzeitig 8 Wunden an einem 20-30 kg schweren Yucatan-Minischwein zu gestalten. (B) Diagramm, das den endgültigen Aspekt des Messingblocks mit einem zentralen Tunnel zeigt, der es dem Thermometer ermöglicht, die Kerntemperatur des Blocks zu messen. (C) Abbildung mit Hervorhebung des auf 65 °C erhitzten Messingblocks, wie er vom Quecksilberthermometer angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Die Wundheilung nach Brandverletzungen ist ein langwieriger Prozess, der bis zu mehreren Monaten dauern kann, mit verschiedenen Behandlungsoptionen und Überlegungen zur Patientenversorgung 2,13. Um es zu untersuchen, wird ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell benötigt. Es wurden mehrere Tiermodelle beschrieben, darunter hauptsächlich Nagetiere 29,45,46 und Schweine29,47. Das Schweinemodell ist aufgrund seiner Ähnlichkeiten mit der menschlichen Hautstruktur relevanter34,48. Die Größe eines erwachsenen Schweins bedeutet, dass mehrere Wunden an demselben Tier durchgeführt werden können, was die statistische Signifikanz erhöht und die interindividuelle Variabilität zwischen experimentellen Behandlungen und deren Kontrollen eliminiert7. Wir empfehlen, die Probanden nach Gewicht und nicht unbedingt nach Alter auszuwählen. Das aktuelle Modellmodell ermöglicht die Durchführung von bis zu 8 Wunden bei einer Ausdehnung von unter 10% der gesamten Körperoberfläche. Dies ermöglicht es, hämodynamische Folgen sowie beherrschbare Schmerzen zu vermeiden.

Ein kritischer Punkt hängt mit der Rasse zusammen. Während die meisten der bestehenden Schweineprotokolle Yorkshire-Schweine 29,31,47,48 verwenden, haben wir das Yucatan Minipig-Modell aus mehreren Gründen entwickelt. Erstens zeigt diese Minischweinrasse in den Nachmonaten nur ein geringes Wachstum 36,49. Dies ermöglicht es, die wachstumsbedingte Variation der Wundgröße zu minimieren und somit einen besseren intraindividuellen Vergleich zu ermöglichen. Die geringere Gewichtsvariation im Vergleich zu Yorkshire-Schweinen sorgt auch für eine bessere Optimierung und Dosierung der Anästhesiemedikamente. Zweitens ist die hohe Menge an Melanin relevant für die Untersuchung pigmentierter Hautreaktionen auf Verbrennungsverletzungen und die Heilung, was auf eine bessere Anwendbarkeit auf die menschlichen Phototypen 3bis 6 hindeutet 35,50,51. Rice et al. fanden erhebliche Heilungsunterschiede zwischen Yucatán und domestizierten weißen Schweinen nach Dermabrasionen zur Behandlung von Verätzungen52. Darüber hinaus zeigten höhere Phototypen klinisch höhere Raten an pathologischen Narben, wie z. B. hypertrophe und Keloide 53,54,55, obwohl die Rasse Red Duroc für die Beurteilung hypertropher Narben am genauesten zu sein scheint34,56. Darüber hinaus erleichtert die pigmentierte heilende Epidermis auch die Messung des Reepithelisierungsprozesses sowohl von den äußeren Rändern als auch von den Nebengebäuden. Schließlich zeigt dieses Modell deutliche Anzeichen einer postinflammatorischen Hyperpigmentierung (Abbildung 2D-F), die auch für weitere Forschungen von Interesse ist. Andere Autoren verwendeten dieses Minipig-Modell, um die pharmakologische dermale Toxizität und Phototoxizität zu untersuchen, und fanden beeindruckende prädiktive Werte für Sicherheit und Wirksamkeit beim Menschen von 89 % bzw. 100 %57. Auch wenn diese Merkmale die Relevanz des Yucatan-Minischweinchenmodells für die Untersuchung der Wundheilung unterstreichen, bleibt die Literatur auf dem speziellen Gebiet der Verbrennungen dürftig. Daher erschien es notwendig, ein reproduzierbares Modell zu beschreiben, um die Untersuchung der Brandwundenheilung und der verschiedenen diagnostischen und therapeutischen Interventionen zu ermöglichen.

Frühere Protokolle wurden beschrieben, um Verbrennungen im Schweinemodell zu untersuchen. Branski et al.58 veröffentlichten 2008 ein Modell für thermische Kontaktverbrennungen in voller Dicke unter Verwendung eines auf 200 °C erhitzten Aluminiumstabs. Ihre Technik, die von mehreren früheren Veröffentlichungen inspiriert war, implementierte einen kontrollierten Druck mit Hilfe einer 50-ml-Spritze, die an der Aluminiumstange befestigt war. Obwohl dieses Merkmal relevant erscheint, da der Druck das Ausmaß der Brandverletzungen beeinflusst, könnte die Präzision ihrer Vorrichtung ungenau sein (der Druck des Bedieners auf die Spritze selbst wird nicht berücksichtigt, und das Druckniveau basiert auf Änderungen der Kolbenposition). In jüngerer Zeit demonstrierten Kim et al.59 und Seswandhana et al.60 reproduzierbare Brandwunden unter Verwendung eines speziellen Geräts mit einem elektrisch beheizten Gerät und einer Temperaturregelung. Beide Geräte verfügten über eine Drucküberwachung, die Abwärtskräfte misst. Die Rückkopplungsschleife, wie sie von Kim beschrieben wird, ermöglicht es, sowohl die Kern- als auch die Oberflächentemperatur während des Kontakts zu halten. Beide Autoren zeigten eine gute Korrelation zwischen Brenntiefe und Druck, was die Bedeutung der Druckkontrolle unterstreicht. Wir haben uns entschieden, keinen zusätzlichen Druck auf den Messingblock auszuüben, außer seinem Gewicht, und die Aktion des Bedieners ist einfach stabilisierend. Ziel war es, das Modell zu vereinfachen und die Anzahl der Variablen zu minimieren. Fan et al.61 beschrieben ein ähnliches Modell mit einem modifizierten Lötkolben, der mit Glycerin gefüllt ist, was den Nachteil hat, dass er einen zusätzlichen Grenzflächenwärmewiderstand erzeugt. Die Blöcke wurden aus Messing mit einer spezifischen Wärmekapazität (c) von 395 W/m*K und einer Wärmeleitfähigkeit (k) von 134 J/kg*K1 hergestellt. Im Vergleich zu anderen gängigen Metallen wie Eisen (c = 490 W/m*K, k = 66 J/kg*K) und Aluminium (c = 949 W/m*K, k = 240 J/kg*K) ermöglichen diese Eigenschaften ein schnelleres Erreichen der gewünschten Temperatur und ermöglichen es auch, die maximale Wärme schnell auf die Haut zu übertragen, um die Verbrennungen zu erzeugen. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, zeigt Abbildung 4 die Merkmale des Messingblocks, der für die Brennherstellung verwendet wurde. Abbildung 4A zeigt die technische Zeichnung des Messingblocks mit allen Abmessungen in mm. Wie abgebildet, beträgt der Außendurchmesser des Blocks 40 mm x Höhe 151 mm. Die gestrichelte Linie zeigt ein koaxiales Loch durch den Block zum Einführen eines Thermometers mit einem Lochdurchmesser von 9 mm und einer Tiefe von 128 mm. Abbildung 4B,C zeigt das Thermometer, das zur Messung der Kerntemperatur in den Messingblock eingesetzt ist.

Eine Grenze des aktuellen Modells ist die Persistenz von nicht verbrannten Zonen aufgrund der Rippenfreiräume, die vor allem bei Teildickenverbrennungen problematisch ist (Abbildung 2). Dies könnte den Re-Epithelisierungsprozess beeinflussen, indem es eine zentrale Quelle für die Keratinozytenmigration darstellt. Es scheint jedoch schwierig zu sein, dieses Problem zu vermeiden, wenn harte Materialien verwendet werden, um die Verbrennungen zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Gesamtoberfläche der unverbrannten Bereiche gering, und der Durchmesser der Messingblöcke von 4 cm bietet genügend Wundfläche, um trotz wiederholter Stanzbiopsien Studien mit langen Nachbeobachtungen durchzuführen.

Eine weitere wichtige Variable ist der Zeitpunkt der Öscharotomie bei Verbrennungen in voller Dicke, die in diesem Protokoll für POD3 geplant ist. Dieser verzögerte Zeitpunkt wurde gewählt, um die Schattenzone mit verzögerten Gewebeverletzungen ins Visier zu nehmen, die in der klinischen Praxis auch als Brandwundenkonversion bezeichnet wird62,63. Ziel war es, das gesamte verletzte Gewebe zu entfernen, was durch die Kohäsion des Schorfs zu diesem Zeitpunkt erleichtert wurde. Dieser Zeitpunkt ermöglicht es auch, frühe Interventionen zu untersuchen, die darauf abzielen, verzögerte Verletzungen der "Schattenzone" zu verringern, wie z. B. entzündungshemmende Mittel 64,65,66, Stammzelltherapie 18,67,68, Kältetherapie 69 oder Antikoagulation 65,70,71 für bis zu 3 Tage. Während die meisten Autoren kurze Nachbeobachtungszeiträume von 2 bis 4 Wochen beschrieben29,47, wurde hier eine verlängerte Nachbeobachtungszeit von 8 bis 10 Wochen gewählt, so dass nicht nur die akute Phase, sondern auch die sekundären Heilungsschritte untersucht werden konnten.

Während dieser ausgedehnten Nachsorge sind die postoperative Versorgung und der Wundverband von entscheidender Bedeutung: Das Team muss geschult werden, um das Tier angemessen zu versorgen. Die Rasse Yucatán hat oft trockene Haut und muss mehrmals pro Woche mit Feuchtigkeit eincremet werden, um den Juckreiz zu verringern, der ein Zeichen von Unwohlsein ist und zu nachfolgenden Selbstverletzungen der Wunden führen kann. Der in dieser Handschrift vorgestellte mehrschichtige Verband ist das Ergebnis mehrjähriger Erfahrungen mit ähnlichen Modellen in unserem Zentrum 7,72. Die Tiere zeigen keine Anzeichen von Unwohlsein oder Schmerzen. In der Studie wurde keine Infektion gefunden, aber eine tägliche Überwachung in den ersten zwei Wochen ist dennoch erforderlich, um diese potenziellen Komplikationen frühzeitig zu erkennen. Dies betont die Einhaltung von Sicherheit und Tierschutz, die in der modernen Forschung von größter Bedeutung sind. Wir entschieden uns, die Verbände nach 3 Wochen abzusetzen, um eine Luftexposition und eine trockene Reepithelisierung zu ermöglichen73,74. In der modernen Ära der auf Nanopartikelnbasierenden 20 und vernetzten Gele35 zur Verbesserung der Wundheilung von Verbrennungen können jedoch fortlaufende okklusive Verbände in dieses Protokoll integriert werden.

Schließlich ist ein wesentliches Merkmal dieses Modells, dass es die Untersuchung verschiedener Wundtiefen im selben Fach ermöglicht. Die histologischen Ergebnisse bestätigen die Relevanz des Protokolls in dieser Hinsicht. Dieses Merkmal ist für Diagnosezwecke von Interesse, z. B. für neue Technologien zur Messung der Verbrennungstiefe, der Verschlechterung in der Anfangsphase oder der Verbesserung während des Heilungsprozesses, aber auch für die Bewertung neuer Therapien und ihrer unterschiedlichen Wirkung bei Verbrennungen ersten, zweiten und dritten Grades. Da der Heilungsprozess in Abhängigkeit von der anfänglichen Brandtiefe wesentlich unterschiedlich ist, ermöglicht dieses Modell die Messung der unterschiedlichen Effekte potenzieller Therapien unter Vermeidung interindividueller Variationen. Eine Einschränkung besteht jedoch darin, dass das Mischen mehrerer Verbrennungsarten an ein und demselben Tier es unmöglich macht, systemische Biomarker wie Metalloproteinasen, entzündungsfördernde und entzündungshemmende Zytokine zu bestimmen, von denen bekannt ist, dass sie mit der Wundtiefe und der Gesamtverbrennungsoberfläche variieren75.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Yucatán Minipig-Verbrennungsmodell sich durch seine Fähigkeit auszeichnet, eine zuverlässige Plattform zur Untersuchung der Wundheilung nach Brandverletzungen zu bieten. Durch die Ausnutzung der physiologischen Nähe zwischen Schweinehaut und menschlicher Haut bietet dieses Schweinemodell deutliche Vorteile, darunter kontrollierte intraindividuelle Vergleiche und die Möglichkeit, mehrere Arten von Wunden an einem einzigen Tier aufzunehmen. Reproduzierbare Techniken zur Induktion von Verbrennungen, das Timing von Interventionen und eine verlängerte Nachbeobachtungsdauer sind kritische Punkte, die die klinische Relevanz und Zuverlässigkeit dieses Modells erhöhen. Die Haut von Yucatán ermöglicht die Untersuchung von Phänomenen, die für pigmentierte Haut spezifisch sind, wie z. B. hypertrophe Narbenbildung und postinflammatorische Hyperpigmentierung. Neuartige Diagnosewerkzeuge, die darauf abzielen, den Arzt bei der Umwandlung von Verbrennungen in der "Schattenzone" zu orientieren, und moderne Behandlungen wie Nanopartikel oder 3D-gedruckte Hauttransplantate sind Beispiele für die Notwendigkeit eines so wertvollen präklinischen Modells zur Untersuchung akuter, verzögerter und langfristiger Verbrennungsphasen.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde mit großzügigen Mitteln aus dem Shriners Children's Research Grant an S.N.T. Y.B. wurde vom Shriners Hospital for Children unterstützt. Wir danken auch für die Finanzierung von S.N.T. durch das US National Institute of Health (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R01DK134590, R24OD034189), American Heart Association (18CDA34110049), Harvard Medical School Eleanor and Miles Shore Fellowship, Polsky Family Foundation und der Claflin Distinguished Scholar Award im Namen der MGH Department of Surgery und/oder des MGH Executive Committee on Research. Darüber hinaus danken wir dem Massachusetts General Hospital Executive Committee of Research für die Verleihung des Fund for Medical Discovery (FMD)-Preises an R.J. Schließlich wird die Unterstützung von Y.B. durch die "Fondation des Gueules Cassées" (Frankreich), die Universität Rennes (Frankreich), das CHU de Rennes (Frankreich) und die Französische Gesellschaft für Plastische Chirurgie sehr geschätzt. Die Autoren danken dem Knight Surgery Research Laboratory für seinen Beitrag und seine Hilfe bei der Anästhesie der Tiere.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adson GewebezangeJarit130-234
AluminiumperlenLab Armor42370-002Lab Armor Perlen 
BuprenorphinhydrochloridRanbaxy PharmaceuticalsNDC:12469-0757-01Buprenex injizierbares
CarprofenPfizerNADA 141-199Rymadyl 50mg/ml injizierbar 
Zylindrischer MessingblockHandgefertigteN/ATechnische Zeichnung im Manuskript enthalten
Dermografischer StiftMcKessonChirurgischer Hautmarker Steril
Einweg #15 chirurgische SkalpelleMedlineMDS15315Skalpellklingen
Fentanyl-PflasterMylanNDC:60505-7082Fentanyl Transdermales System
Isofluran PiramalNDC:66794-013-25Isofluran, USP
McPherson Bipolare GerinnungszangeBovieA842Wiederverwendbare, autoklavierbare
Miltex verschiedene Biopsiestempel (3,4 und 5 mm)Integra33-38Biopsiestempel - Größe zur Anpassung an die Studie
VliesgazeStarryshineGZNW222 x 2" Vlies 4-lagige medizinische Mulleinlagen
Povidon-JodBetadinNDC:0034-9200-88Chirurgisches Peeling 7,5% 
Sterile isotonische Natriumchloridlösung 0,9%Aqualite SystemRL-2095Sterile Kochsalzlösung
TätowierfarbeSpaulding & RogersSchwarz - 2 oz - #9053
Tattoo MarkerSpaulding & RogersSpecial Electric Tattoo Marker
Tattoo NadelSpaulding & Rogers1310251Tattoo 5 Punkt Nadel
Tegaderm Transparent Film Dressing3M1.628Großer transparenter Klebeverband
Temperaturgesteuerte HeizplatteCole-Parmer03407-11StableTemp Heizplatte
Rührer ThermometerAmerican ScientificU14295Rohr Quecksilberthermometer
Tiletamin und Zolazepam HydrochloridZoetisNDC: 54771-9050Telazol-Tinktur
aus Benzoe-Spray Smith& Neffe407000Klebeschichtspray
Dreifache antibiotische SalbeFougeraNDC 0168-0012-31Dreifache antibiotische Salbe
Tubular StockinetteMedlineNONNET02Curad Medline Latexfreie elastische Netze
Wärmedecke3MBair Hugger 750 Wärmeeinheit
Xeroform Okklusive Gaze StripCovidien8884433301Xeroforme Vaseline Wundauflagen
XylazinVetoneNDC:13985-704-10AnaSed LA
Yucatà n Minischweine (weiblich, 30 kg)Sinclair Bio ResourcesN/AVollpigmentierung 

Referenzen

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