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Picrosirius-Rot-Färbung zur semiquantitativen histopathologischen Bewertung der Kollagenablagerung in Mausmodellen der chronischen Lungen-Allotransplantatabstoßung

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DOI:

10.3791/66395

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21. März 2025

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1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Picrosirius-Rot-Färbung ist eine semiquantitative Methode zur objektiven Beurteilung der Kollagenablagerung beim murinen pulmonalen fibrotischen Remodeling in einer räumlich aufgelösten Weise. Neben der Bewertung der Gesamtkollagenablagerung ermöglicht die Picrosirius-Rot-Färbung die Unterscheidung von Kollagenfasern unterschiedlicher Dicke.

Zusammenfassung

Fibrose ist das pathophysiologische Kennzeichen der chronischen Abstoßung nach Lungentransplantation und die größte Hürde für ein langfristiges Überleben des Empfängers. Für die Untersuchung der chronischen Abstoßung stehen mehrere murine Lungentransplantationsmodelle zur Verfügung. Sie zeigen jedoch heterogene Ergebnisse bezüglich fibrotischer Veränderungen des Transplantats, und das histologische Ausmaß der Fibrose wird meist qualitativ berichtet. Daher kann ein ortsaufgelöster Ansatz, der eine statistische Analyse ermöglicht, bei der Bewertung der Fibrose in diesen Modellen hilfreich sein. In dieser Studie wird die Picrosirius-Rot-Färbung für eine semiquantitative Bewertung der Kollagenorganisation in murinen Lungentransplantaten vorgestellt und mit Standard-Hämatoxylin- und Eosin-, Masson-Trichrome- und Herovici-Färbungen verglichen. Die Färbung wurde an Schnitten aus zwei verschiedenen murinen Transplantationsmodellen durchgeführt, die auf kleineren und großen Histokompatibilitätskomplexen (MHC) basierten. Die Methode wurde für die semiquantitative Analyse der Kollagenorganisation in ganzen Lungenschnitten etabliert. Somit kann es als Werkzeug für murine experimentelle Modelle fibrotischer Lungenerkrankungen dienen.

Einleitung

Die Lungentransplantation ist die definitive therapeutische Option für Patienten, die an einer Lungenerkrankung im Endstadium leiden. Das Langzeitüberleben wird jedoch durch chronische Abstoßungsreaktionen beeinträchtigt, von denen 50 % der Empfänger innerhalb der ersten fünf postoperativen Jahre betroffensind 1. Der fibrotische Umbau der kleinen Atemwege und des Lungenparenchyms ist das histologische Kennzeichen, das dem fortschreitenden Verlust der Lungenfunktion bei chronischer Abstoßung von Lungentransplantaten zugrunde liegt2. Experimentell kann die chronische Abstoßung von Lungenallotransplantaten mit einer murinen orthotopen Lungentransplantation zwischen MHC-unpassenden Mausstämmen modelliert werden. Es wurden verschiedene Stammkombinationen vorgeschlagen, um den Phänotyp der chronischen Abstoßungzu erreichen 3. Unter ihnen wird häufig die Transplantatkombination aus dem minderjährigen MHC-Spender und dem C57BL/6-Empfänger verwendet4. Alternativ kann BALB/c-Spenderlunge an C57BL/6-Empfänger transplantiert werden, die täglich immunsuppressiv behandelt werden5. Diese Modelle führen zu histologisch unterschiedlichen Graden fibrotischer Veränderungen6. Diese Veränderungen werden oft qualitativ unter Verwendung der Standardfärbung von Hämatoxylin und Eosin sowie der Trichrom-Färbung nach Masson berichtet.

Die histologische Standardfärbung mit Hämatoxylin und Eosin ermöglicht einen Überblick über die Probe, da sie die Zellkerne blau färbt, während das Zytoplasma und die Kollagenfasern rot erscheinen. Bei der Trichrom-Färbung nach Masson werden die Zellkerne schwarz gefärbt, die Kollagenfasern werden grün bis blau gefärbt und der Hintergrund, einschließlich Zytoplasma, Fibrin und Muskeln, ist rot. Da die Trichrom-Beize von Masson zu unterschätzten Werten führen kann, wird die Verwendung von Picrosirius-Rot-Beize als vorteilhaft angesehen7. Picrosirius Red ist ein linearer anionischer Farbstoff, der mit langen kationischen Kollagenfasern assoziiert ist und eine kontrastreiche rote Färbung bietet. Darüber hinaus verbessert die Picrosirius-Rot-Färbung die natürliche Doppelbrechung von Kollagenfasern unter kreuzpolarisiertem Licht8. Auf diese Weise können die Dicke und Packung der Kollagenfaser bewertet werden. Mit einem Polarisationsfilter wird der Hintergrund dunkel und es wird möglich, die Dicke des abgelagerten Kollagens zu unterscheiden. Während dicke Kollagenfasern rot erscheinen, treten dünne Kollagenfasern unter Polarisation grün auf. Eine direkte Assoziation zwischen Doppelbrechung und Kollagen-Subtyp wird in der Literatur häufig beschrieben, wobei die rote Doppelbrechung Kollagen I und die grüne Doppelbrechung Kollagen IIIzugeordnet wird 9.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Picrosirius-Rot-Färbung zur Beurteilung der Fibrose in murinen Lungentransplantaten. Zusätzlich zur konventionellen histologischen Färbung ermöglicht sie eine semiquantitative Bewertung der fibrotischen Veränderung in murinen Modellen der chronischen Abstoßung, bietet die Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen dicken und dünnen Kollagenfasern in nur einer Färbung, ist kosteneffizient und einfach durchzuführen. Diese Methode kann auch auf andere murine experimentelle Modelle angewendet werden, die durch einen fibrotischen Umbau des Lungenparenchyms gekennzeichnet sind.

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Protokoll

Alle Tierprotokolle entsprechen den ethischen Grundsätzen der 3R für humane Tierversuche und wurden von der lokalen veterinärmedizinischen Ethikkommission (Veterinäramt Kanton Zürich, Schweiz, Studiennummer 45/2014) genehmigt. Ebenso sollten die Leser die Erlaubnis der zuständigen Institutionen einholen, bevor sie Eingriffe an Labortieren durchführen.

1. Probenaufnahme

  1. Durchführung von Tierversuchen nach individuellem Bedarf und entsprechender ethischer Genehmigung. Ein einziger Mikrochirurg führt alle Operationen ohne zusätzliche verlängerte Ischämiezeiten durch.
    HINWEIS: Für eine Reproduktion unserer repräsentativen Ergebnisse besorgen Sie sich spezifische pathogenfreie adulte männliche C57BL/6J-, C57BL/10J- und BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von 27-30 g von Charles River Laboratories. Verwenden Sie für Isotransplantate C57BL/6J-Tiere sowohl als Spender als auch als Empfänger. Transplantieren Sie im Modell mit geringfügigen Fehlanpassungen die Lunge eines C57BL/10J-Spenders an C57BL/6J-Empfänger. Im Major-Mismatching-Modell transplantieren Sie BALB/c-Spenderlungen an C57BL/6J-Empfänger und injizieren postoperativ täglich Cyclosporin (10 mg/kg/Tag) und Methylprednisolon (1,6 mg/kg/Tag) subkutan5. Verwenden Sie Kochsalzlösung zur Perfusion und entnehmen Sie die Lunge nach 8 Wochen (56 Tagen).
  2. Zur Euthanasie intubieren Sie das Tier mit einem 20-G-Katheter und beatmeten Sie es mit O2 , das mit 2 % bis 3 % Isofluran ergänzt ist. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie nicht auf ein Kneifen der Pfote reagieren.
  3. Führen Sie eine mediane Laparomenotomie durch, indem Sie die Bauchdecke mit einer chirurgischen Schere einschneiden und die Länge des Brustbeins durchschneiden, um das Herz freizulegen. Identifizieren Sie die untere Hohlvene und das linke Vorhofohr anhand ihrer anatomischen Lage.
  4. In schneller Folge die untere Hohlvene und das linke Vorhofohr mit einer chirurgischen Schere durchtrennen und das Tier mit 3-5 ml 0,9% NaCl durch die Wurzel der Lungenarterie mit einer Spritze durchbluten, um das gesamte Blut aus dem Lungenkreislauf zu entfernen.
    HINWEIS: Die Euthanasie sollte gemäß der jeweiligen ethischen Genehmigung durchgeführt werden. Andere Methoden können gleichermaßen angewendet werden. Es wird empfohlen, das Blut aus dem Lungenkreislauf gründlich zu entfernen, was auch durch Perfusion nach Kreislaufstillstand erfolgen kann.
  5. Entferne die durchblutete Lunge mit einer Schere.
  6. Zur Konservierung die Proben in 4 % Formalin inkubieren. Injizieren Sie die Formalinlösung direkt in den Bronchus und das Lungengefäßsystem. Tauchen Sie die Proben in Formalin und lassen Sie sie mindestens 6 h inkubieren.
    HINWEIS: Für das Aufblasen der Lunge mit Formalin sollte ein standardisiertes Verfahren angewendet werden, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Beispielprotokolle für solche Verfahren sind an anderer Stelle veröffentlicht10,11.
  7. Trimmen Sie die Orgel nach experimentellen Bedürfnissen. Schneiden Sie die Lunge quer in zwei Hälften, um alle Teile des Bronchialbaums in einem Abschnitt zu erfassen.
  8. Die Proben werden zur Dehydrierung in Alkoholsequenz in einen automatischen Gewebeprozessor überführt, wobei die Xylol- und Paraffinbeschichtung wie folgt geklärt wird: 70 % Ethanol, 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 96 % Ethanol, 100 % Ethanol (je 1 h), 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, Xylol (je 2 h), Xylol (1 h) und Paraffin 3x für 2 h.
  9. Schmelzen Sie Paraffin und betten Sie die Proben in der richtigen Ausrichtung in Polyoxymethylen-Einbettkassetten ein. Achten Sie darauf, die Proben mit der Schnittfläche nach unten einzubetten. Verwenden Sie ein Rotationsmikrotom, um 5-μm-Abschnitte nacheinander zu schneiden. Lassen Sie die Objektträger 24 h bei 37 °C trocknen, bevor Sie sie weiterverarbeiten.

2. Entparaffinisierung und Hydratation von Paraffinobjektträgern

  1. Entfernen Sie das Paraffin, indem Sie die Proben 2x in 100% Xylol für jeweils 5 min inkubieren.
    ACHTUNG: Xylol ist brennbar und gesundheitsgefährdend. Nur unter dem Abzug verwenden.
  2. Hydratisieren Sie die Proben jeweils 2 Minuten lang in 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und 50 % Ethanol. Dann 2 Minuten in destilliertem Wasser waschen.

3. Färben mit Picrosiriusrot

  1. Färben Sie sich 8 Minuten lang in Meyers Hämalumlösung. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser.
  2. Inkubieren Sie die Objektträger 1 h lang in Picrosirius-Rot-Lösung. Verwenden Sie für die Picrosirius-Rot-Lösung entweder eine vorgemischte Färbelösung oder verwenden Sie 0,1 % Direct Red 80 oder Sirius Red F 3B (CI 35780), verdünnt in gesättigter Pikrinsäure.
    ACHTUNG: Pikrinsäure ist brennbar und hochexplosiv und sollte sorgfältig behandelt werden.
    HINWEIS: Es gibt viele verschiedene Anbieter für Picrosirius-Rot-Färbesets, wie in der Materialtabelle aufgeführt. Achten Sie auf Unterschiede im Preis und bei den Färbemethoden und halten Sie sich immer an die Anweisungen der Lieferanten. Es wird empfohlen, nur Färbesets mit dem spezifischen Farbindex für Sirius Red F 3B (CI 35780) zu verwenden.
  3. Tauchen Sie die Objektträger 5x-10x in eine Essigsäurelösung (0,5%). Schütteln Sie die Objektträger vorsichtig, um die Lösung physisch zu entfernen.
  4. Dehydrieren Sie die Objektträger jeweils 5 Minuten lang in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, 100 % Xylol und 100 % Xylol.
  5. Betten Sie ein, indem Sie einen Tropfen Einbettmittel auf jede Probe geben und mit einem Deckglas abdecken. Lassen Sie die Dias unter einem Abzug trocknen.

4. Digitalisierung und Bildverarbeitung

  1. Fokussieren Sie die Proben unter einem Lichtmikroskop mit einer geeigneten Bildgebungssoftware, bis das Bild klar und scharf wird. Fügen Sie einen Polarisationsfilter hinzu und passen Sie den Polarisationsgrad an, bis der Hintergrund vollständig dunkel oder schwarz ist. Wenn der Hintergrund so dunkel wie möglich ist, wird die richtige Polarisation erreicht.
    HINWEIS: Es ist auch möglich, die Picrosirius-Rot-Färbung mit herkömmlichem Durchlicht und ohne Polarisationsfilter sichtbar zu machen. Zu diesem Zweck wird empfohlen, Sirius Red mit Fast Green zu verwenden, da es sich als empfindlicher erwiesen hat als Sirius Red allein12,13. Die Polarisationsmikroskopie ist jedoch notwendig, um zwischen dicken und dünnen Kollagenfasern zu unterscheiden.
  2. Scannen Sie alle Proben vollständig unter 20-facher Vergrößerung und exportieren Sie sie als .tiff. Übertragung auf Fidschi-Software14. Achten Sie darauf, die Dias im Vorfeld richtig zu reinigen und standardisierte Einstellungen bezüglich Belichtungszeit und Lichtquellenintensität zu verwenden.
  3. Umschließen Sie das Sample manuell und schneiden Sie es in der Software mit Edit > Clear Outside aus. Messen Sie die Gesamtoberfläche, indem Sie auf Analysieren > Messen klicken.
    HINWEIS: Die Auswahl des zu messenden Fachs ist ein entscheidender Schritt, um zuverlässige und vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Durch die Digitalisierung und Selektion der gesamten Probe wird ein guter Querschnitt dargestellt und heterogene Gewebe werden als Ganzes betrachtet. Es ist aber auch möglich, sich auf bestimmte Bereiche innerhalb der Proben zu beschränken, wie z.B. das Brustfell oder einzelne Bronchien. Denken Sie daran, immer die Fächer auszuwählen, die standardisiert verglichen werden sollen. Sollten die Proben eine große Variabilität in der Belüftung aufweisen, empfiehlt es sich, den Luftraumbereich aus dem analysierten Fach15 auszuschließen.
  4. Messen Sie den Gesamtkollagengehalt pro Probe anhand des Farbschwellenwerts, indem Sie auf Bild >> Farbschwellenwert anpassen klicken, und passen Sie die Einstellungen an, indem Sie auf Analysieren > Partikel analysieren klicken. Legen Sie die Größe = 1 fest - Unendlich, Löschen, Zusammenfassen. Helligkeit = 35 - 255. Farbton = 2 - 130
    HINWEIS: Eine vernünftige Einstellung der Farbschwellenwerte ist entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.
  5. Wiederholen Sie den Vorgang für dicke und dünne Kollagenfasern, indem Sie den Farbton als rote figure-protocol-1 dicke Kollagenfasern (Farbton 2-30) und gelbgrüne figure-protocol-2 dünne Kollagenfasern (Farbton 31-130) anpassen. Das Ergebnis ist der Bereich der gefärbten Pixel.
  6. Konfigurieren Sie das Makro für die automatische Verarbeitung, indem Sie auf Plugins > Makros > Aufzeichnen klicken und den Vorgang mit allen Samples wiederholen.
  7. Um Endwerte zu erhalten, die auf die Oberfläche des Querschnitts standardisiert sind, dividieren Sie die Fläche der gefärbten Pixel für alle Parameter durch die Gesamtoberfläche, die in den Schritten 4.3 bzw. 4.5 für jede Probe gemessen wurde.

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Ergebnisse

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht eine objektive semiquantitative Bewertung der Kollagenablagerung im Lungengewebe von Mäusen. Der fibrotische Umbau ist das pathophysiologische Kennzeichen der chronischen Abstoßung nach Lungentransplantation. Daher wurde die Picrosirius-Rot-Färbung in Modellen zur Abstoßung chronischer Lungentransplantate unter Verwendung einer linksseitigen orthotopen Lungentransplantation der Maus angewendet. Die große MHC-inmatchende Lungentransplantation von einem BALB/c-Spender auf einen C5...

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Diskussion

Histologische Standardmethoden wie Hämatoxylin und Eosin sowie die Masson-Trichrom-Färbung werden häufig verwendet, um fibrotische Veränderungen in der Lunge von Mäusen räumlich aufgelöst zu erkennen16,19. Oft sind jedoch zusätzliche Methoden notwendig, um diese Veränderungen zu quantifizieren und die Kollagenzusammensetzung des Gewebes zu bewerten.

Die Picrosirius-Rot-Färbung wurde erstmals 1964 zur I...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Birte Ohm wird gefördert durch das Berta-Ottenstein-Programm für Clinician Scientists der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg. Steffen U Eisenhardt ist Heisenberg-Professor der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und hat diese Arbeit mit persönlichen Stipendien unterstützt. Des Weiteren danken wir Sheena Kreuzaler für ihre technische Unterstützung. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von Biorender.com erstellt. Die Bildgebung wurde an der Lighthouse Core Facility durchgeführt, die teilweise von der Medizinischen Fakultät der Universität Freiburg (Projektnummern 2023/A2-Fol; 2021/B3-Fol), dem DKTK und der DFG (Projektnummer 450392965) finanziert wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureHoneywell, Charlotte, USA33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Deutschland4633000956 (Seriennummer)
Deckglas 1.5Roth, Karlsruhe, DeutschlandKCY5.1
Formaldehyd 37%Fisher Scientific, Leicestershire, UKF/1501/PB15
Meyer's Hämalum LösungMerck, Darmstadt, Deutschland109249
Picrosirius RedSolution Morphisto, Offenbach am Main, Deutschland13422Alternativen, die verwendet werden können: ab150681, abcam, Cambridge, Großbritannien; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US
PolarisationsfilterZeiss, Oberkochen, Deutschland000000-1121-813
Rotationsmikrotom, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Deutschland149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Histokitt EindeckmediumRoth, Karlsruhe, Deutschland6638.1
ROTI Plast ParaffinRoth, Karlsruhe, Deutschland6642.5
Rotilabo-Einbettkassetten, POMRoth, Karlsruhe, DeutschlandK113.1
Superfrost Plus AdhäsionsmikroskopObjektträger epredia, Portsmouth, UKJ1800AMNZ
Tissue Processor Leica, Wetzlar, DeutschlandTP 1020
Software
Fiji Software Version 2.14.0/1.54fOpen Source
Imaging Software ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Deutschland

Referenzen

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Schlagwörter

Chronische Lungenabsto ungmurine Lungentransplantationsemiquantitative AuswertungFibroseanalysePolarisationsmikroskopieMasson Trichrom F rbungdigitale Bildanalyse

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