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Die Etablierung von kalvarialen, naht-knöchernen Kompositdefekten bei Ratten: Ein standardisiertes Modell für die Untersuchung der nahtregenerativen Therapie

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DOI:

10.3791/66417

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10. Mai 2024

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die detaillierten chirurgischen Abläufe von Schädeldach-Naht-Knochen-Kompositdefekten bei Ratten und untersuchen die kurz- und langfristigen Prognosen des Modells. Unser Ziel ist es, ein standardisiertes Modell für die Entwicklung nahtregenerativer Therapien zu entwickeln.

Zusammenfassung

Großflächige Schädelbaddefekte fallen oft mit einer Rissbildung der Schädelnaht zusammen, was zu Beeinträchtigungen bei der Wiederherstellung der Schädeldefekte und der Schädelentwicklung führt (letztere tritt im sich entwickelnden Schädel auf). Das Fehlen eines standardisierten Modells behindert jedoch den Fortschritt bei der Erforschung nahtregenerativer Therapien und stellt eine Herausforderung für die Durchführung vergleichender Analysen über verschiedene Studien hinweg dar. Um dieses Problem zu lösen, beschreibt das aktuelle Protokoll den detaillierten Modellierungsprozess von kalvarialen Naht-Knochen-Kompositdefekten bei Ratten.

Das Modell wurde erstellt, indem rechteckige Löcher in voller Dicke von 4,5 mm × 2 mm über die koronalen Nähte gebohrt wurden. Die Ratten wurden euthanasiert und die Schädelproben wurden postoperativ an Tag 0, Woche 2, Woche 6 und Woche 12 entnommen. μCT-Ergebnisse von Proben, die unmittelbar nach der Operation entnommen wurden, bestätigten die erfolgreiche Etablierung des Naht-Knochen-Kompositdefekts, bei dem die koronale Naht und das angrenzende Knochengewebe entfernt wurden.

Daten aus der 6. und 12. postoperativen Woche zeigten eine natürliche Heilungstendenz, damit sich der Defekt schließt. Die histologische Färbung bestätigte diesen Trend weiter, indem sie vermehrt mineralisierte Fasern und neuen Knochen im Defektzentrum zeigte. Diese Befunde deuten auf eine fortschreitende Nahtfusion im Laufe der Zeit nach Schädelmarksdefekten hin, was die Bedeutung therapeutischer Interventionen für die Nahtregeneration unterstreicht. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll die Entwicklung von nahtregenerativen Therapien erleichtern wird, indem es neue Einblicke in die funktionelle Wiederherstellung von Schädelbergdefekten bietet und unerwünschte Folgen im Zusammenhang mit Nahtverlust reduziert.

Einleitung

Schädelnähte sind dichte faserige Verbindungen zwischen Schädelknochen, die als Gelenke dienen, um leichte Schädelbewegungen zu erleichtern und ein schützendes Polster für das Gehirn unter Druck zu bieten1. In den letzten Jahren hat die Forschung verstärkt die zentrale Rolle von Schädelnähten bei der Schädelentwicklung, der kraniofazialen Homöostase und dem inhärenten osteoreparativen Potenzial hervorgehoben 2,3,4,5,6,7,8. Während der Wachstums- und Entwicklungsphasen fungieren Schädelnähte als Hauptwachstumszentren im Schädel4. Die Knochenneubildung findet an den osteogenen Fronten auf beiden Seiten der Nähte statt, während die Zellen in den Nähten einen undifferenzierten mesenchymalen Zustand beibehalten, was eine ausgewogene Schädelexpansion neben dem Gehirnwachstum gewährleistet1. Der Verlust der Schädelnähte zu diesem Zeitpunkt führt zu einer Diskrepanz zwischen dem Wachstum des Schädels und des Gehirns, was zu schwerwiegenden Problemen wie Hirnverletzungen, Hydrozephalus, erhöhtem Hirndruck und kognitiver Dysfunktion führt 3,9.

Darüber hinaus spielen Schädelnähte eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Prognose von Schädeldachdefekten 5,7,10. Das Regenerationspotenzial über die Schädeloberfläche ist ungleichmäßig verteilt, wobei die Schädelnähte im Vergleich zu nicht nahten Regionen bemerkenswert überlegene Fähigkeiten aufweisen10,11. Eine Studie zeigt, dass die Geschwindigkeit der Heilung des Schädeldefekts umgekehrt mit dem Abstand zwischen der Schädelnaht und der Verletzungsstelle korreliert10. Insbesondere führt die Entfernung von koronalen und sagittalen Nähten zur Nichtheilung von parietalen Knochendefekten7, was die Notwendigkeit einer Nahtregeneration bei Schädeldachdefekten unterstreicht. Der Fokus der aktuellen Studien liegt jedoch überwiegend auf der Wiederherstellung der kranialen Knochenstruktur unter Vernachlässigung der Regeneration des Nahtmesenchyms.

Was die Fortschritte bei der Nahtregeneration betrifft, so wurden vielversprechende Ergebnisse bei der Transplantation von nahthaltigen Knochenlappen, mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und künstlichen Biomaterialien beobachtet. Wenn Knochenlappen mit Nähten in Schädeldachdefekte transplantiert wurden, integrierten und heilten sie erfolgreich, im Gegensatz zu solchen ohne Nähte, die eine Pseudarthrose und die Unfähigkeit zeigten, Periost, Dura mater oder Osteozyten zu bilden5. Ebenso erleichterte die Implantation von MSCs aus dem Knochenmark in sagittale Naht-Knochen-Kompositdefekte die Bildung nahtartiger Lücken12. Bemerkenswert ist, dass eine kürzlich durchgeführte Studie die Realisierung der Nahtregeneration mit Gli1+ MSCs hervorhob, die eine intrakranielle Druckkontrolle, eine Korrektur der Schädeldeformität und eine verbesserte neurokognitive Funktion ermöglichen13. Mit der Entwicklung der regenerativen Medizin und der biomedizinischen Technik konzentrieren sich die Forscher aufgrund ihrer anpassungsfähigen und anpassbaren Eigenschaften zunehmend auf Tissue Engineering-Biomaterialien14. Insbesondere haben sich Polytetrafluorethylenmembranen bei der gleichzeitigen Rekonstruktion von Schädelknochen- und Nahtmesenchym als wirksam erwiesen15,16.

In der kraniofazialen Forschung fehlen jedoch etablierte Modelle für die Erforschung mesenchymaler regenerativer Nahttherapien, im Gegensatz zu relativ ausgereiften Modellen zur Reparatur anderer Gewebe wie Knochen, Haut, Knorpel und Muskeln17. Das Fehlen eines standardisierten Modells schränkt die Untersuchung von nahtregenerativen Therapien ein und macht es schwierig, vergleichende Analysen über verschiedene Studien hinweg durchzuführen. Daher wurde in unserer Studie ein praktikabler und reproduzierbarer Defekt zwischen Schädeldach und Knochen der Ratte festgestellt. Mit dieser Methode wollen wir geeignete klinische Interventionen für die Rekonstruktion von Schädelnaht entwickeln, die neue Perspektiven für die funktionelle Reparatur von Schädelmarksdefekten bieten und ungünstige Ergebnisse durch Nahtverlust verringern.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan überprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2021-597). Insgesamt 12 (3 Ratten zu jedem der vier Zeitpunkte) Sprague-Dawley (SD) Ratten (männlich, 300 g, 8 Wochen alt) wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Chirurgische Artikel
    1. Bereiten Sie chirurgische Instrumente vor, die in Abbildung 1A dargestellt sind, einschließlich einer gebogenen Pinzette, eines sterilen Einwegskalpells, eines Periostlifts, einer Spülnadel, Wattebäuschen, eines Handstücks mit niedriger Geschwindigkeit, eines chirurgischen Motors, zahnärztlicher Rundbohrer mit niedriger Geschwindigkeit (Abbildung 1B, Durchmesser 1,2 mm bzw. 0,8 mm), eines Nadelhalters, 3-0 monofiler Nähte und einer geraden Schere.
  2. Sterilisation und Desinfektion
    1. Sterilisieren Sie die Instrumente vorab durch Dampfsterilisation (125-135 °C, 20-25 min).
    2. Verwenden Sie Ethanol, um hitzeempfindliche medizinische Geräte wie Elektrorasierer zu sterilisieren.
    3. Verwenden Sie sterile medizinische Vliesstoffe, um die Operationsplattform abzudecken und die Umgebung mit 75 % Ethanol zu desinfizieren.
  3. Anästhesie
    1. Bereiten Sie die Tiere mit einer 1-wöchigen Eingewöhnungsphase auf die Operation vor.
    2. Injizieren Sie den Ratten intraperitoneal Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) 20 Minuten vor der Operation zur Anästhesie oder verwenden Sie ein geeignetes Anästhesieprotokoll, um eine Vollnarkose zu erreichen.
      HINWEIS: Der Ketamin-Xylazin-Anästhesie-Cocktail, der bei Ratten intraperitoneal verabreicht wird, wirkt in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten und erreicht etwa 35-40 Minuten nach der Injektion die maximale Anästhesie. Um eine Unterkühlung während der Narkose zu verhindern, werden Ratten am besten auf ein Heizkissen gelegt.
    3. Verabreichen Sie eine präoperative subkutane Injektion von Carprofen in einer Dosis von 5 mg/kg, um eine Analgesie zu verabreichen.
    4. Verwenden Sie die "Zehenkneifmethode", um festzustellen, ob die Ratten bei Bewusstsein und ansprechbar sind oder nicht.

2. Chirurgischer Ablauf

  1. Vorbereitung der Baustelle
    1. Bringen Sie die Ratte in eine Bauchlage, wobei sich ihr Kopf natürlich vertikal ausstreckt, ohne dass spezielle Vorrichtungen oder Fesseln erforderlich sind, um diese Haltung beizubehalten (Abbildung 2A).
    2. Tragen Sie Veterinärsalbe, d.h. Vaseline, auf die Augen der Ratte auf, um Hornhauttrockenheit zu verhindern.
    3. Entfernen Sie die Haare von der Kopfhaut zwischen dem Nasenrücken und dem Halswirbelsäulengelenk mit einem Elektrorasierer (Abbildung 2B). Desinfizieren Sie den Operationsbereich in kreisenden Bewegungen, die von der Mitte ausgehen, mit 2 % Iodophorlösung, gefolgt von 75 % Ethanol. Verwenden Sie ein chirurgisches Tuch, um den Rücken des Tieres und das Fell um den Schnitt herum zu bedecken.
  2. Öffnung der Operationsstelle
    1. Ausgehend von der Mitte des Nasenbeins wird mit einem Einwegskalpell ein 2 cm langer Längsschnitt in die Haut vorgenommen, der der Mittellinie des Schädels folgt (Abbildung 2C).
    2. Machen Sie mit einem Skalpell einen periostalen Schnitt in der Mittellinie, der den Anfangspunkt und die Ausdehnung der Hautschicht widerspiegelt (Abbildung 2D). Heben Sie dann das Periost auf beiden Seiten des Schnitts vorsichtig mit einem Periostlift an (Abbildung 2E1), um Parietalknochen, Stirnknochen und koronale Nähte freizulegen (Abbildung 2E2).
      HINWEIS: Achten Sie beim Einschneiden des Periosts darauf, die Schädelnähte nicht zu beschädigen, um übermäßige Blutungen beim Schneiden zu vermeiden. Eine adäquate Freilegung der Koronalnaht ist für die folgenden Eingriffe von größter Bedeutung.
    3. Spülen Sie die Wunde mit Kochsalzlösung aus und trocknen Sie den Operationsbereich mit Wattebällchen.
  3. Etablierung eines Nahtknöchel-Kompositdefektmodells
    1. Stellen Sie den chirurgischen Motor auf 35.000 U/min ein, indem Sie den Knopf drehen (Abbildung 1A, gelber Pfeil), und schalten Sie dann den Schalter ein (Abbildung 1A, weißer Pfeil).
    2. Üben Sie von einem beliebigen Punkt auf der Koronalnaht aus eine vertikale Kraft mit einem runden Bohrer mit einem Durchmesser von 1,2 mm aus, bis ein Gefühl des Durchbruchs zu spüren ist.
      HINWEIS: Empfehlen Sie den Mittelpunkt der Koronalnaht (gekennzeichnet durch gelbe Pfeile in Abbildung 2E2) als Ausgangspunkt für die Penetration. Beim Schleifen sollten Zahnbohrer senkrecht zur Schädeloberfläche gehalten werden. Seien Sie vorsichtig, um nicht weiter zu bohren, nachdem Sie die volle Dicke des Schädels durchdrungen haben, um weitere Schäden an den Ratten zu vermeiden, einschließlich Hirnschäden oder Hirnblutungen.
    3. Bewegen Sie den Bohrer vom Penetrationspunkt aus seitlich entlang der Kronennaht, um eine ca. 4 mm lange Positionierungsrille zu erzeugen (Abbildung 2F1). Entfernen Sie Knochengewebe mit dem Bohrer auf beiden Seiten der Positionierungsnut, um zunächst einen rechteckigen Defekt in voller Dicke zu bilden (Abbildung 2F2).
    4. Verwenden Sie einen runden Bohrer mit einem Durchmesser von 0,8 mm, um Details zu verfeinern (Abbildung 2G1), wobei rechte Winkel geschliffen und Fehlerränder geglättet werden, um schließlich einen rechteckigen Standardfehler mit einer Breite von 2 mm und einer Länge von 4,5 mm zu erzielen (Abbildung 2G2).
      HINWEIS: Um eine vollständige Entfernung der koronalen Naht unter Beibehaltung der sagittalen und frontalen Nähte bei 300 g SD-Ratten zu erreichen, beträgt die maximal mögliche Defektlänge ca. 4,5 mm. Unter Berücksichtigung der Breite der koronalen Naht in anterior-posteriorer Richtung (Ergänzende Abbildung S1) wurde die Defektbreite auf 2 mm festgelegt.
    5. Erstellen Sie zwei Defekte in der linken und rechten Hälfte der Koronalnaht zum Selbstvergleich.
    6. Halten Sie während des Bohrvorgangs eine kontinuierliche Spülung mit Kochsalzlösung aufrecht, um sich vor thermischen Verletzungen des Schädels und des Gehirns zu schützen. Verwenden Sie in der Zwischenzeit Wattebällchen, um den Operationsbereich zu trocknen.
  4. Überprüfung der Probenabmessungen
    1. Überprüfen Sie regelmäßig die Länge und Breite der Defekte mit einem Messschieber (Abbildung 2H1, H2), um die Konsistenz aller Proben zu gewährleisten.
  5. Verschluss der Operationsstelle
    1. Verschließen Sie die Haut mit 3-0 monofilen Nähten (Abbildung 2I).
  6. Sofortige postoperative in vivo Mikro-Computertomographie (μCT)
    1. Wenn möglich, führen Sie unmittelbar nach der Operation In-vivo-μCT-Scans an allen Ratten durch, um den Erfolg des chirurgischen Eingriffs zu bestätigen und die Trends bei der Wiederherstellung des Defekts für jedes Individuum zu überwachen.

3. Nachsorge

  1. Gemäß den Tierpflegeprotokollen sind nach der Operation bei Bedarf etablierte Analgetika zu verabreichen, z. B. Carprofen (5 mg/kg, subkutane Anwendung).
  2. Übertragen Sie die Ratten zur postoperativen Erholung auf ein konstantes Heizkissen (37 °C).
  3. Sobald Sie bei vollem Bewusstsein sind, bringen Sie die Ratten in ihren Käfig mit sauberer Einstreu.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Ratten nach der Operation kontinuierlich. Lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie das Brustbein aufrecht erhalten können. Operierte Ratten von anderen isoliert halten, bis sie vollständig genesen sind.
  4. Führen Sie 24 Stunden lang ein Analgesiemanagement und eine postoperative Überwachung durch, gefolgt von täglichen Untersuchungen in der ersten Woche nach der Operation. Überwachen Sie die Ratten danach mindestens 1-2x pro Woche.

4. Probenentnahme und Datenanalyse

  1. Probenvorbereitung
    1. Entnahme von Schädelproben am postoperativen Tag 0, in Woche 2, Woche 6 und Woche 12. Euthanasieren Sie die Ratten durch Inhalation von CO2 .
    2. Fixieren Sie die Proben vor der weiteren Analyse 24 h lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C.
  2. μCT-Auswertung
    1. Durchführung von μCT-Scans an Schädelknochen am postoperativen Tag 0, Woche 6, Woche 12 mit den folgenden Scanparametern: Röntgenröhrenpotential, 70 kVp; Röntgenintensität, 0,2 mA; Filter, AL 0,5 mm; Integrationszeit, 1 x 300 ms; und Voxelgröße, 10 μm.
    2. Erhalten Sie 3D-Rekonstruktionen und Schnittbilder mit einer Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).
    3. Messen Sie das Restfehlervolumen und führen Sie statistische Analysen mit entsprechender Software durch (siehe Materialtabelle).
  3. Histologische Färbung
    1. Entkalken Sie die Schädelknochen in 12 % (w/v) Ethylendiamin-Tetraessigsäurelösung (pH = 7,2) bei 4 °C für 6 Wochen.
      HINWEIS: Entkalken Sie die Proben alle 3 Tage mit Lösungswechsel. Verwenden Sie einen Shaker, um den Prozess zu beschleunigen. Die Fertigstellung ist angezeigt, wenn eine 25-G-Nadel leicht in die Probe eindringt.
    2. Fahren Sie mit der Dehydratisierung, der Paraffineinbettung und der Vorbereitung von 6-μm-Schnitten unter Verwendung der Standardprotokollefort 18.
    3. Führen Sie eine histologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und der Trichrom-Färbung nach Masson gemäß dem Kit-Protokoll18 durch.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde der Kompositdefekt zwischen Schädeldach und Knochen der Ratte durch Bohren eines 4,5 mm x 2 mm großen rechteckigen Lochs durch die koronale Naht festgestellt. Die schematische Darstellung des chirurgischen Schemas und das Flussdiagramm der Forschung sind in Abbildung 3 dargestellt. Die 3D-Aufnahme und die Schnittansicht der postoperativen 0-Tage-Proben, d.h. der Proben, die unmittelbar nach der Operation entnommen wurden, bestätigten die erfolgreiche Schaffung eines Schädelbergdefekts in voller Dicke, bei dem die koronale Naht sowie die angrenzenden Knochenstrukturen an beiden Enden vollständig entfernt wurden (Abbildung 4A). μCT-Bilder und die entsprechenden statistischen Analyseergebnisse 6 Wochen nach der Operation zeigten eine natürliche Neigung zum Defektverschluss, begleitet von unregelmäßigen verkalkten Knötchen, die sich innerhalb des Defekts bildeten (Abbildung 4). Diese Tendenz verstärkte sich 12 Wochen nach der Operation (Abbildung 4), was auf eine mögliche Nahtfusion im Laufe der Zeit hinweist. Weitere histologische Analysen wurden mit H&E und der Trichrom-Färbung von Masson durchgeführt. Zwei Wochen postoperativ beobachteten wir eine bemerkenswerte Ausdehnung und Kontinuität des Periosts und der Dura mater, die dichtes und dickes fibröses Gewebe bildeten und den Defektbereich effektiv versiegelten (Abbildung 5). Bemerkenswert ist, dass zu diesem frühen Zeitpunkt das Auftreten von bläulich gefärbten mineralisierten Fasern festgestellt wurde, deren Vorhandensein bis 6 Wochen nach der Operation erheblich zunahm (Abbildung 5). In der postoperativen 12. Woche wurden große Stücke neuen Knochens im Defektzentrum beobachtet (Abbildung 5), was die ungünstige Prognose der Stromaverkalkung und des Nahtverschlusses bestätigte. Die ungünstigen natürlichen Heilungsergebnisse von Naht-Knochen-Kompositdefekten unterstreichen die Notwendigkeit einer Regeneration der Schädelnaht durch therapeutische Eingriffe, wie z.B. die Implantation von Biomaterialien 13,15,16.

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Abbildung 1: Chirurgische Instrumente. (A) Die chirurgischen Gegenstände wurden in der Reihenfolge ihrer Verwendung nummeriert, einschließlich (1) gebogener Pinzette, (2) sterilem Einwegskalpell, (3) Periostlift, (4) Spülnadel, (5) Wattebällchen, (6) Handstück mit niedriger Geschwindigkeit, (7) chirurgischem Motor (gelber Pfeil steht für den RPM-Knopf und weißer Pfeil für den Schalter), (8) Zahnbohrern mit niedriger Geschwindigkeit, (9) Nadelhalter, (10) 3-0 monofile Nähte und (11) gerade Schere. (B) Runde Bohrer mit niedriger Geschwindigkeit von 1,2 mm und 0,8 mm Durchmesser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Chirurgischer Eingriff. (A) Positionieren Sie die Ratte in Bauchlage. (B) Rasieren Sie das Haar mit einem Elektrorasierer von der Kopfhaut. (C) Haut mit einem Einwegskalpell einschneiden. (D) Schneiden Sie das Periost mit einem Skalpell ein. (E1, E2) Heben Sie das Periost an, um koronale Nähte mit einem Periostlift freizulegen. Die gelben Pfeile zeigen koronale Nähte. (F1) Bohren Sie eine Positioniernut. (F2) Erstellen Sie zunächst einen rechteckigen Defekt mit einem 1,2 mm Rundbohrer. (G1, G2) Schneiden Sie den Defekt mit einem 0,8 mm Rundbohrer ab, um eine rechteckige Standardform von 4,5 x 2 mm zu erhalten. (H1, H2) Kalibrieren Sie die Breite und Länge des Defekts mit einem Messschieber. (I) Verschließen Sie die Haut mit 3-0 monofilen Nähten. Bei dieser Darstellung wird eine Leiche verwendet, die absichtlich unbedeckt gelassen wird, um eine verbesserte anatomische Visualisierung zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung des kalvarialen Naht-Knochen-Komposit-Defekts und Forschungsstrategie dieser Studie. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin; μCT = Mikro-Computertomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Verschlusstendenz des Schädeldach-Naht-Knochen-Komposit-Defekts. (A) Repräsentative μCT-Bilder und Schnittansichten von Naht-Knochen-Kompositdefekten am postoperativen Tag 0, in Woche 6 und Woche 12. Die Querschnitte stellen die Positionen dar, die durch die gelben gestrichelten Linien in 3D-Bildern gekennzeichnet sind. Maßstabsbalken = 2 mm. (B) Quantitative Analyse des Restdefektvolumens nach der Operation durch μCT-Beurteilungen. n = 6 Replikate/Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Einfache ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. S<0.001. Abkürzungen: PO = postoperativ; μCT = Mikro-Computertomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Histologische Variationen von Naht-Knochen-Kompositdefekten. (A) H&E und (B) Masson-Trichrom-Färbung von Naht-Knochen-Kompositdefekten in PO Woche 2, Woche 6 und Woche 12. Die rot gestrichelten Umrisse zeigen das fibröse Gewebe, das den Defektbereich umschließt. Die schwarzen Pentagramme stellen die blau gefärbten mineralisierten Fasern dar. Die gelben Pentagramme markieren den neuen Knochen, der im Defektzentrum gebildet wird. Maßstabsleisten = 500 μm; 200 μm (Einschub). Abkürzungen: PO = postoperativ; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Koronale Nahtbreite in anterior-posteriorer Richtung (Schädeldachbild in sagittaler Ebene). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Konventionelle Modelle von Schädeldefekten, unabhängig davon, ob sie Schädelnähte beinhalten oder nicht, konzentrieren sich in erster Linie auf die Reparatur von Hartgewebe und vernachlässigen oft die vitale Regeneration des Nahtmesenchyms19,20. In der Nahtregenerationsforschung führten frühere Modelle, wie die von Mardas et al.15,16, die einen Trepanbohrer verwendeten, um einen 5 mm zirkulären Defekt über die sagittale Naht von Ratten zu erzeugen, zu einem erheblichen Hartgewebsverlust und wichen damit vom primären Ziel der Nahtregeneration ab. In ähnlicher Weise führte die Methodik von Wilk et al.7, die die Entfernung sowohl der sagittalen als auch der rechten koronalen Nähte und die Schaffung eines kritischen Knochendefekts im rechten Parietalknochen umfasste, zwar informativ, führte jedoch aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Defektstellen zu Komplexitäten und potenziellen Störvariablen. Im Gegensatz dazu erzeugt unser Protokoll bilaterale rechteckige Defekte entlang der koronalen Naht, was auf ein schlankeres und gezielteres Forschungsmodell abzielt. Zu den wichtigsten Schädelnähten gehören die koronale, sagittale, metopische und lambdoide Naht21. Anders als bei den metopischen und sagittalen Nähten, die längs am Schädel angeordnet sind, sind die koronale und die lambdoide Naht quer angeordnet und können in zwei Hälften geteilt werden, was die Bildung von zwei Defekten mit identischen Bedingungen erleichtert. Im Gegensatz zur Lambdoideus-Naht ist das Operationsfeld, das durch den Kopfhautschnitt freigelegt wird, für eine Reihe von Eingriffen an der Koronalnaht besser zugänglich. Das Erzeugen von Defekten sowohl in der linken als auch in der rechten Hälfte der koronalen Naht und die Anwendung unterschiedlicher Eingriffe an jeder Stelle ermöglichen einen einfacheren Vergleich verschiedener Therapien durch Selbstkontrolle. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz einen Vergleich zwischen behandelten und unbehandelten Seiten und gibt Aufschluss über die Unterschiede zwischen dem eingegriffenen Heilungsprozess und dem natürlichen Heilungsprozess. Daher deutet unsere Studie darauf hin, dass die Bildung von nahtknöchernen Kompositdefekten auf beiden Seiten der koronalen Nähte bei Ratten ein geeignetes chirurgisches Modell für die Untersuchung nahtregenerativer Therapien ist.

Die Auswahl der Defektdimensionen orientiert sich akribisch an praktischen und anatomischen Überlegungen. Für dieses spezielle Tiermodell besteht die primäre Herausforderung darin, die koronale Naht vollständig zu entfernen und gleichzeitig die sagittale und frontale Naht zu erhalten, mit minimaler Entfernung des knöchernen Gewebes. Die optimale Strategie besteht daher darin, einen präzisen rechteckigen Defekt entlang der Koronalnaht zu erzeugen. Diese strategische Entscheidung ist unabdingbar, da ein verbleibendes Mesenchym in der Koronalnaht oder angrenzenden Nähten zu Ungenauigkeiten bei der Bewertung der tatsächlichen regenerativen Wirkung der Behandlung führen könnte. Folglich haben wir mit etwa 4,5 mm die größte mögliche Defektlänge für 300 g männliche SD-Ratten ermittelt. Darüber hinaus haben wir unter Berücksichtigung der Breite der koronalen Naht in anterior-posteriorer Richtung (ca. 1,5 mm in der Sagittalebene, wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt) die Defektbreite auf 2 mm festgelegt, um die vollständige Entfernung der Naht von der Schädeloberfläche bis zu ihrer Tiefe zu gewährleisten. Es ist erwähnenswert, dass die spezifischen Abmessungen des Defekts, sowohl in Bezug auf die Länge als auch auf die Breite, auf der Grundlage von Faktoren wie Art und Alter des Tieres sowie den Versuchszielen angepasst werden müssen. Eine andere Studie erzeugte einen schlanken, 0,3 bis 0,4 mm breiten, rechteckigen Defekt entlang der koronalen Naht, der der geringeren Größe von Mäusen gerecht wurde13.

Die Schwierigkeit bei der Generierung dieses chirurgischen Modells liegt insbesondere in der Konstruktion von Standard- und einheitlichen rechteckigen Defekten. Es ist zwingend erforderlich, die Konsistenz der Defektform aufrechtzuerhalten, um eine einheitliche Dosierung der bioaktiven Faktoren über die Proben hinweg zu gewährleisten und dadurch sowohl Schwankungen zwischen den Gruppen als auch innerhalb der Gruppe zu minimieren. In diesem Zusammenhang verwendeten wir bei der Entfernung des Naht-Knochen-Komplexes zunächst einen Rundbohrer mit einem Durchmesser von 1,2 mm, um die koronale Naht zu lokalisieren und einen groben Umriss des rechteckigen Defekts in voller Dicke zu erstellen (Abbildung 1B). Anschließend sind wir auf den kleinsten Rundbohrer (0,8 mm Durchmesser) umgestiegen, um die rechtwinkligen Kurven zu verfeinern und die Fehlerkanten zu glätten (Abbildung 1B). Um die Konsistenz der Länge und Breite jedes Defekts zu gewährleisten, wurde ein Messschieber verwendet, um ein Über- oder Unterschleifen während des Bohrvorgangs zu vermeiden. Trotz dieses Ansatzes zeigte der μCT-Scan, dass der von uns erzeugte rechteckige Defekt immer noch etwas bogenförmig ist (Abbildung 4), was auf die Notwendigkeit einer weiteren Optimierung der Modellierungsmethode hindeutet, um präzise Schleifformen zu erhalten.

Um die Prognose zu bewerten, stellen μCT-Scans das direkteste Mittel dar, einschließlich der Beurteilung der Heilung des Knochengewebes und des Status von Schädelnähten, unabhängig davon, ob sie geschlossen oder frei sind. Darüber hinaus ist die Untersuchung auf histopathologischer Ebene für die Untersuchung der Regeneration von Schädelnaht unerlässlich. Die histopathologische Färbung hilft bei der Unterscheidung des Nicht-Verschlusses von Defekten aufgrund der Bildung von mesenchymalem Gewebe, der knochenrestaurativen Hemmung oder der Materialraumbelastung. Nur Ansätze, die die Regeneration von mesenchymalem Gewebe erleichtern, besitzen wahrscheinlich das Potenzial für eine Regeneration der Schädelnaht. Darüber hinaus wird trotz des Mangels an relevanten Experimenten während der Modellkonstruktion dringend empfohlen, die Expression von Naht-MSC-Markern im regenerierten Gewebe nach therapeutischen Eingriffen auf Proteinebene nachzuweisen. Diese Analyse, bei der Techniken wie Immunfluoreszenz, Immunhistochemie oder Durchflusszytometrie zum Einsatz kommen, trägt dazu bei, den Erfolg der Nahtregeneration zu bestätigen. Zu den spezifischen Naht-MSC-Markern gehören Cd51, Cd200, Gli1, Axin2, Prrx1, Ctsk und mehr 1,22.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Studie über den detaillierten Modellierungsprozess von Schädelnaht-Knochen-Kompositdefekten bei Ratten berichtet wurde, um die Prognose von Kreuznahtdefekten zu untersuchen und geeignete Therapien zur Regeneration von Schädelnähten zu entwickeln. Es ist wichtig anzumerken, dass das Gebiet der Regeneration von Schädelnähten in der Tat eine Nische ist, da es in der Literatur keine Standardmodelle oder -methoden für die Regeneration von Schädelnähten gibt. Daher glauben wir, dass unser Protokoll eine solide methodische Grundlage für die Untersuchung nahtregenerativer Ansätze bietet und innovative Perspektiven auf die funktionelle Wiederherstellung von Schädelbergdefekten eröffnet, mit dem ultimativen Ziel, die Lebensqualität der Patienten zu verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China 82100982 (F.L.), 82101000 (H.W.), 82001019 (B.Y.), dem Science and Technology Department of Sichuan Province 2022NSFSC0598 (B.Y.), 2023NSFSC1499 (H.W.) und Forschungsmitteln der West China School/Hospital of Stomatology Sichuan University (RCDWJS2021-5). Abbildung 3 wurde mit Biorender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% ParaformaldehydBiosharpBL539A
2% IodophorlösungChengdu Jinshan Chemisches Reagenz Co., Ltd.Keine
75% EthanolChengdu Jinshan Chemisches Reagenz Co., Ltd.Keine
WattebällchenHaishi Hainuo Group Co., Ltd. Keine
WattestäbchenLakong Medical Devices Co., Keine
Gebogene PinzetteChengdu Shifeng Co., Ltd.Keine
Dataviewer und Ctan-Software für die Bewertung des RestdefektvolumensBrukerNone Dental
Rundbohrer mit niedriger GeschwindigkeitDreybird Medical Equipment Co., Ltd.RA3-012
RA1-008
Steriles EinwegskalpellHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Keine
Einwegspritzen (22 G)Chengdu Shifeng Co., Ltd.SB1-089(IX)
ElektrorasiererJASEBM320210
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)BioFroxx1340GR500
Hämatoxylin- und Eosin-FleckensetBiosharpBL700B
Spülnadel (23 g)Sichuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Verifizierter
Lieferant - Guangzhou Dental Guard Technology Co., Ltd.Keine Masson
' s Trichrome Stain KitSolarbioG1340
Medizinische VliesstoffeHenan Yadu Industrial Co., Ltd. Keine
Mikro-Computertomographie (&Mikro; CT) Scanco Medical AG&micro; CT45
Mimics 20.0 für SchnittbilderMaterialiseNone
NadelhalterChengdu Shifeng Co., Ltd.Verifizierter
LieferantChengdu Shifeng Co., Ltd.Keine
KochsalzlösungSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Keine
Scanco Medical Visualizer Software für die 3D-BildrekonstruktionScanco Medical AGKeine
SPSS Statistics 20.0 für statistische AnalysenIBMKeine
Ratten Byrness Weil Biotech LtdKeine
.None
Surgical MotorMARATHONN3-140232
Chirurgisches Nahtmaterial (3-0 monofil)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.nichts
Sprague-Dawley gerade Schere Chengdu Shifeng Co., Ltd

Referenzen

  1. Li, B., et al. Cranial suture mesenchymal stem cells: insights and advances. Biomolecules. 11 (8), 1129(2021).
  2. Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Dev Dyn. 219 (4), 472-485 (2000).
  3. Lenton, K. A., Nacamuli, R. P., Wan, D. C., Helms, J. A., Longaker, M. T. Cranial suture biology. Curr Top Dev Biol. 66 (4), 287-328 (2005).
  4. Slater, B. J., et al. Cranial sutures: A brief review. Plast Reconstr Surg. 121 (4), 170-178 (2008).
  5. Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nat Cell Biol. 17 (4), 386-396 (2015).
  6. Maruyama, T., Jeong, J., Sheu, T. -J., Hsu, W. Stem cells of the suture mesenchyme in craniofacial bone development, repair and regeneration. Nat Commun. 7 (1), 10526(2016).
  7. Wilk, K., et al. Postnatal calvarial skeletal stem cells expressing PRX1 reside exclusively in the calvarial sutures and are required for bone regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
  8. Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial suture-derived stem cells and their contribution to cranial bone repair. Front Physiol. 8, 956(2017).
  9. Kajdic, N., Spazzapan, P., Velnar, T. Craniosynostosis-recognition, clinical characteristics, and treatment. Bosn J Basic Med Sci. 18 (2), 110-116 (2018).
  10. Park, S., Zhao, H., Urata, M., Chai, Y. Sutures possess strong regenerative capacity for calvarial bone injury. Stem Cells Dev. 25 (23), 1801-1807 (2016).
  11. Quarto, N., Behr, B., Longaker, M. T. Opposite spectrum of activity of canonical Wnt signaling in the osteogenic context of undifferentiated and differentiated mesenchymal cells: Implications for tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (10), 3185-3197 (2010).
  12. Kaku, M., et al. Mesenchymal Stem Cell-Induced Cranial Suture-Like Gap in Rats. Plast Reconstr Surg. 127 (1), 69-77 (2011).
  13. Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), e18 243-256 (2021).
  14. Koons, G. L., Diba, M., Mikos, A. G. Materials design for bone-tissue engineering. Nat Rev Mater. 5 (8), 584-603 (2020).
  15. Mardas, N., Kostopoulos, L., Karring, T. Bone and suture regeneration in calvarial defects by e-PTFE-membranes and demineralized bone matrix and the impact on calvarial growth: an experimental study in the rat. J Craniofac Surg. 13 (3), 453-462 (2002).
  16. Kostopoulos, L., Karring, T. Regeneration of the sagittal suture by GTR and its impact on growth of the cranial vault. J Craniofac Surg. 11 (6), 553-561 (2000).
  17. Mosaddad, S. A., Hussain, A., Tebyaniyan, H. Exploring the use of animal models in craniofacial regenerative medicine: A narrative review. Tissue Eng Part B Rev. , (2023).
  18. Tan, X., et al. PgC3Mg metal-organic cages functionalized hydrogels with enhanced bioactive and ROS scavenging capabilities for accelerated bone regeneration. J Mater Chem B. 10 (28), 5375-5387 (2022).
  19. Yazdanian, M., et al. Fabrication and properties of βTCP/Zeolite/Gelatin scaffold as developed scaffold in bone regeneration: in vitro and in vivo studies. Biocybern Biomed Eng. 40 (4), 1626-1637 (2020).
  20. Soufdoost, R. S., et al. In vitro and in vivo evaluation of novel Tadalafil/β-TCP/Collagen scaffold for bone regeneration: A rabbit critical-size calvarial defect study. Biocybern Biomed Eng. 39 (3), 789-796 (2019).
  21. Russell, W. P., Russell, M. R. Anatomy, head and neck, coronal suture. StatPearls. , (2022).
  22. Menon, S., et al. Skeletal stem and progenitor cells maintain cranial suture patency and prevent craniosynostosis. Nat Commun. 12 (1), 4640(2021).

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