Modifiziertes Mausmodell für repetitives leichtes Schädel-Hirn-Trauma mit verdünntem Schädelfenster und flüssiger Perkussion

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein modifiziertes Mausmodell für repetitive milde traumatische Hirnverletzungen (rmTBI) vor, die über eine geschlossene Kopfverletzungsmethode (CHI) induziert werden. Der Ansatz zeichnet sich durch ein verdünntes Schädelfenster und eine Flüssigkeitsperkussion aus, um die Entzündung zu reduzieren, die häufig durch die Exposition von Hirnhäuten verursacht wird, sowie eine verbesserte Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Modellierung von rmTBI bei Nagetieren.

Zusammenfassung

Das leichte Schädel-Hirn-Trauma ist eine klinisch sehr heterogene neurologische Erkrankung. Hochgradig reproduzierbare Tiermodelle für traumatische Hirnverletzungen (SHT) mit gut definierten Pathologien werden dringend benötigt, um die Mechanismen der Neuropathologie nach leichtem SHT zu untersuchen und Therapeutika zu testen. Es hat sich als Herausforderung erwiesen, die gesamten Folgen des SHT in Tiermodellen zu replizieren. Daher ist die Verfügbarkeit mehrerer Tiermodelle für SHT notwendig, um die unterschiedlichen Aspekte und Schweregrade von SHT-Patienten zu berücksichtigen. CHI ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Herstellung von Nagetiermodellen für rmTBI. Diese Methode ist jedoch anfällig für viele Faktoren, einschließlich der verwendeten Aufprallmethode, der Dicke und Form des Schädelknochens, der Apnoe bei Tieren und der Art der verwendeten Kopfstütze und Immobilisierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Kombination der Methoden des dünnen Schädelfensters und der Fluid-Perkussionsverletzung (FPI) zu demonstrieren, um ein präzises Mausmodell des CHI-assoziierten rmTBI zu erstellen. Das Hauptziel dieses Protokolls besteht darin, Faktoren zu minimieren, die sich auf die Genauigkeit und Konsistenz der CHI- und FPI-Modellierung auswirken könnten, einschließlich der Dicke, Form und Kopfstütze des Schädelknochens. Durch die Verwendung einer Methode mit verdünntem Schädelfenster wird eine mögliche Entzündung aufgrund von Kraniotomie und FPI minimiert, was zu einem verbesserten Mausmodell führt, das die klinischen Merkmale repliziert, die bei Patienten mit leichtem SHT beobachtet wurden. Die Ergebnisse der Verhaltens- und histologischen Analyse mittels Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung deuten darauf hin, dass ein rSHT zu einer kumulativen Verletzung führen kann, die sowohl im Verhalten als auch in der groben Morphologie des Gehirns zu Veränderungen führt. Insgesamt stellt das modifizierte CHI-assoziierte rmTBI ein nützliches Werkzeug für Forscher dar, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu erforschen, die zu fokalen und diffusen pathophysiologischen Veränderungen des rmTBI beitragen.

Einleitung

Leichte SHT-Verletzungen, einschließlich Gehirnerschütterungen und Sub-Gehirnerschütterungen, machen die Mehrzahl aller SHT-Fälle aus (>80 % aller SHT)¹. Ein leichtes SHT resultiert häufig aus Stürzen, Verkehrsunfällen, Gewalttaten, Kontaktsportarten (z. B. Fußball, Boxen, Hockey) und militärischen Kämpfen ^2,3. Ein leichtes SHT kann zu neurobiologischen Ereignissen führen, die die neurologischen Verhaltensfunktionen während des gesamten Lebens des Patienten beeinträchtigen und das Risiko für neurodegenerative Erkrankungen erhöhen ^4,5,6. Tiermodelle bieten ein effizientes und kontrolliertes Mittel zur Untersuchung eines leichten SHT, in der Hoffnung, die Diagnose und Behandlung des milden SHT weiter zu verbessern. Es wurden verschiedene Modelle für ein leichtes SHT entwickelt, wie z. B. das Modell des kontrollierten kortikalen Aufpralls (CCI), des Gewichtsabfalls (WD), der Flüssigkeitsperkussionsverletzung (FPI) und der Blast-TBI-Modelle ^7,8. Kein einzelnes experimentelles Modell kann die gesamte Komplexität der SHT-induzierten Pathologie nachahmen ^9,10. Die Heterogenität dieser Modelle ist vorteilhaft, um die vielfältigen Merkmale milder SHT-Patienten zu adressieren und die entsprechenden zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen. Jedes Tiermodell des SHT hat jedoch seine Grenzen³, die unser aktuelles Wissen über milde SHT bei Tieren und ihre klinische Relevanz einschränken.

Die WD- und CCI-Modelle werden verwendet, um klinische Zustände wie zerebralen Gewebeverlust, akute subdurale Hämatome, axonale Verletzungen, Gehirnerschütterungen, Funktionsstörungen der Blut-Hirn-Schranke und sogar Koma nach SHT^zu replizieren ^3,11,12. Beim WD-Modell werden Hirnschäden verursacht, indem entweder die Dura mater oder der Schädel mit frei fallenden Gewichten getroffen werden. Der Aufprall eines beschwerten Objekts auf einen intakten Schädel kann gemischte fokale/diffuse Verletzungen replizieren; Diese Methode ist jedoch mit einer schlechten Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Verletzungsstelle, einer Rebound-Verletzung und einer höheren Sterblichkeitsrate aufgrund von Schädelfrakturen verbunden ^3,11,12. Beim CCI-Modell wird luftbetriebenes Metall aufgetragen, um direkt auf die freiliegende Dura Mater aufzutreffen. Im Vergleich zum WD-Modell ist das CCI-Modell genauer und reproduzierbarer, erzeugt jedoch aufgrund des geringen Durchmessers der aufprallenden Spitze¹¹ keine diffusen Verletzungen. Bei der FPI-Modellierung wird das Hirngewebe durch Perkussion kurzzeitig verschoben und verformt. FPI kann eine gemischte fokale/diffuse Schädigung induzieren und intrakranielle Blutungen, Hirnschwellungen und fortschreitende Schäden der grauen Substanz nach einem SHT replizieren. FPI hat jedoch eine hohe Mortalitätsrate aufgrund von Hirnstammschäden und anhaltender Apnoe ^3,12. Die Kraniotomie, die an herkömmlichen WD-, CCI- und FPI-Modellen beteiligt ist, kann zu kortikalen Kontusionen, hämorrhagischen Läsionen, der Schädigung der Blut-Hirn-Schranke, der Infiltration von Immunzellen, der Aktivierung von Gliazellen, einer verlängerten Modellierungszeit und möglicherweise tödlichen Ergebnissen führen ^3,12.

Ein leichtes SHT zeichnet sich durch einen GCS-Score (Glasgow Coma Scale, GCS) im Bereich von 13 bis 15^{2 aus}. Ein leichtes SHT kann entweder fokal oder diffus sein und ist sowohl mit akuten Verletzungen wie dem Abbau der zellulären Homöostase, Exzitotoxizität, Glukosemangel, mitochondrialer Dysfunktion, Durchblutungsstörung und axonaler Schädigung als auch mit subakuten Verletzungen, einschließlich axonaler Schädigung, Neuroinflammation und Gliose verbunden ^2,3. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Abgrenzung der komplexen Pathophysiologie des SHT sind die zugrundeliegenden Mechanismen des milden SHT/rmSHT nach wie vor schwer fassbar und bedürfen weiterer Untersuchungen⁹. Angesichts der Tatsache, dass CHI die häufigste Art von SHT¹² ist, stellt dieses Protokoll einen neuartigen Ansatz dar, um ein präziser kontrolliertes Mausmodell des rmTBI unter Verwendung eines modifizierten FPI-Geräts zu erstellen, um einen Aufprall in einem ausgedünnten Schädelfenster^{durchzuführen 13}. Durch die Vermeidung von kraniotomieinduzierten Verletzungen, variablen Schädeldicken- und forminduzierten Ungenauigkeiten sowie Rebound-Verletzungen zielt dieser Ansatz darauf ab, die Hauptnachteile der WD-, CCI- und FPI-Modelle zu überwinden. Die Anwendung von FPI-Auswirkungen auf das dünne Schädelfenster ist praktisch für die Beurteilung von Hirngefäßschäden nach einem RMTT und trägt dazu bei, hohe Sterblichkeitsraten in einigen Modellen zu minimieren, was zu einer größeren Ähnlichkeit mit den klinischen Merkmalen von SHT-Patienten führt.

Protokoll

Alle Verfahren, die mit diesem Protokoll verbunden sind, wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Zhejiang Normal University, Genehmigungsnummer, dw2019005) und in Übereinstimmung mit der ARRIVE und dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die technischen Spezifikationen finden Sie in der Werkstofftabelle.

1. Verfahren für den Umgang mit Tieren

1. Halten Sie Mäuse in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 22-24 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 40 % bis 60 %, einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und bieten Sie ad libitum Zugang zu Wasser und Standard-Mäusefutter. Für dieses Experiment wurden 25 männliche ICR-Mäuse (25-30 g, 8 Wochen alt) verwendet.
2. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip entweder der Kontrollgruppe (n=12) oder der rmTBI-Gruppe (n=13) zu. Um mögliche Aggressionen von Scheinmäusen gegenüber Mäusen zu verhindern, die sich einem rmTBI unterzogen haben, trennen Sie sie in getrennte Käfige.
3. Geben Sie den Mäusen mindestens 1 Woche Zeit, sich an ihre Käfigumgebung zu gewöhnen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Diese Eingewöhnungsphase stellt sicher, dass sich die Mäuse mit ihrer Umgebung vertraut machen und minimiert die potenziellen Auswirkungen von Stress oder Angst auf physiologische oder Verhaltensreaktionen während der Studie.

2. Vorbereitung des SHT-Geräts

1. Herstellung des rmTBI-Modells an Mäusen mit einem modifizierten FPI-Gerät (siehe Materialtabelle; Abbildung 1A) ¹³. Überprüfen Sie vor der Verwendung des FPI-Geräts alle Anschlüsse sorgfältig auf Anzeichen von Leckagen oder Rissen und achten Sie dabei besonders auf die Verbindungsstellen zwischen Zylinder und Schlauch sowie zwischen dem Dreiwegeverbinder und dem Schlauch. Um den Aufpralldruck genau zu bestimmen, wurde ein Druckaufnehmer bis zum Aufprallpunkt an der Fluid-Perkussionsverletzungsvorrichtung¹³ installiert.
2. Führen Sie eine sorgfältige Inspektion der FPI-Vorrichtung durch, um sicherzustellen, dass sich der Kolben reibungslos im Zylinder bewegt und dass Stöße effektiv durchgeführt werden können (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im System befinden. Wenn Luftblasen festgestellt werden, geben Sie vorsichtig destilliertes Wasser mit einer 50-ml-Spritze in das System und stoßen Sie die Luftblasen aus, indem Sie die Zylinderstange schnell durch einen nahe gelegenen 3-Wege-Anschluss und/oder durch die Spritze schieben.
   HINWEIS: Das FPI-System besteht aus destilliertem Wasser in der Flasche und den angeschlossenen Schläuchen. Es ist wichtig, das Gerät vor dem Betrieb zu kalibrieren, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

3. Vorbereitung des ausgedünnten Schädels

HINWEIS: Die Tieroperation und die Präparation des dünnen Schädels sollten nicht im Hinblick auf andere Mäuse durchgeführt werden. Das Fenster für den verdünnten Schädel ist nützlich für die Beurteilung von Hirngefäßschäden nach einem FPI-Verfahren.

1. Halten Sie sich an die Anforderungen des Tierzentrums, indem Sie den Versuchsleiter anweisen, während aller Verfahren zum Umgang mit Tieren einen sterilen Kittel und eine sterile Maske zu tragen.
2. Desinfizieren Sie die Labortischplatte, das FPI-Gerät, den Anästhesieschlauch und den angrenzenden Arbeitsbereich, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, mit einem 70%igen Ethanolspray.
3. Wiegen Sie die Mäuse sowohl in der Schein- als auch in der rmTBI-Gruppe vor der Operation und vergleichen Sie ihre Gewichte mit denen, die 1 Woche vor dem Experiment aufgezeichnet wurden. Schließen Sie Mäuse aus der Studie aus, die einen schlechten Gesundheitszustand aufweisen, wie z. B. raues Fell, Durchfall, Gewichtsverlust oder Lethargie. Schließen Sie außerdem Mäuse mit einem Gewicht von weniger als 20 g aus, um sicherzustellen, dass sie wiederholte Stöße tolerieren können. Diese Maßnahmen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Tierschutzes und die Gewährleistung zuverlässiger Versuchsergebnisse.
4. Betäuben Sie Mäuse mit 4%-5% Isofluran (in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 L/min) für 3-4 min in einer Induktionskammer. Verabreichen Sie den Augen des Tieres ein ophthalmisches Gleitmittel (siehe Materialtabelle), um die Gleitfähigkeit während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten. Um die Schmerzen zu lindern, verabreichen Sie Buprenorphin subkutan (0,05 mg/kg) in der Mitte zwischen den Ohren 20 Minuten vor der Anästhesie und anschließend alle 6 Stunden für eine Dauer von 24 Stunden. Darüber hinaus ist am Ende der Anästhesie jedem Tier eine subkutane Einzeldosis von 5 mg/kg Carprofen zu verabreichen.
5. Desinfizieren Sie den Kopf, nachdem die Maus ihre Aufricht- und Pedalentzugsreflexe verloren hat. Schneiden Sie das Fell am Kopf der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und entfernen Sie mit einem Rasierer das restliche Fell. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei aufeinanderfolgenden Anwendungen von 2 % Chlorhexidin, unterbrochen von 75 % Ethanol-Peelings.
6. Legen Sie eine sterile Einweg-OP-Binde unter das Tier und die Umgebung, um die richtige Hygiene zu gewährleisten. Machen Sie mit einer feinen kleinen chirurgischen Schere einen 1,5 cm langen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut der Maus, um die Operationsstelle vollständig freizulegen (Abbildung 2A).
7. Befestigen Sie die Maus mit nichtterminalen Ohrbügeln in einem herkömmlichen stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Position des Mauskopfes in einem stereotaktischen Rahmen auf eine flache Ebene oder einen leicht geneigten Winkel an, je nach dem spezifischen Zielbereich, der untersucht werden soll. Reinigen Sie das Operationsgebiet von Fell, um spätere Entzündungen zu vermeiden.
8. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus mit einem herkömmlichen isothermen Heizkissen auf 37 °C (siehe Materialtabelle).
9. Halten Sie während des Installationsprozesses der Operations- und Impact-Nabe (weiblicher Luer-Lock) die Mausanästhesie (ohne Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen oder des Schwanzes) mit einem Nasenkonus aufrecht, der eine kontinuierliche Isoflurankonzentration von 2 % liefert, die durch einen kalibrierten Verdampfer reguliert wird.
10. Reinigen Sie den Operationsbereich um das Fenster des verdünnten Schädels vorsichtig mit einem sterilen, mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen.
11. Mit einem Mikrobohrer mit flacher Spitze (siehe Materialtabelle, Abbildung 2B) und einer mikrochirurgischen Klinge wird im rechten frontalen motorischen Kortex ein Fenster mit verdünntem Schädel mit einem Durchmesser von ca. 2,5 mm und einer Dicke von 20 μm erstellt. Lokalisieren Sie das Operationsfeld 1,5 mm vor dem Bregma und 1,3-2,0 mm lateral der Mittellinie (Abbildung 2C).
    1. Um zu verhindern, dass der Mikrobohrer während der Erstellung des dünnen Schädelfensters in den Schädel eindringt, befeuchten Sie den Schädel intermittierend, während Sie mit dem Mikrobohrer schleifen.
    2. Bestätigen Sie die Dicke des Schädels, indem Sie den ausgedünnten Schädel vorsichtig mit der abgeflachten Spitze einer feinen Spritzennadel untersuchen und seine Weichheit beurteilen. Schätzen Sie die Klarheit der freiliegenden kortikalen Mikrogefäße visuell, um die Dicke des Schädels zu bestimmen.
    3. Um die Dicke des Schädels zu überprüfen, tragen Sie sterile Kochsalzlösung auf die verdünnte Stelle auf und untersuchen Sie sie visuell mit einem herkömmlichen Präpariermikroskop (siehe Materialtabelle). Diese Technik kann dazu beitragen, dass der Schädel ausreichend ausgedünnt wurde.
       HINWEIS: Schmieren Sie das Mausauge während der gesamten Vorbereitung des verdünnten Schädels und des rmTBI-Modellierungsverfahrens, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Ausdünnung des Schädels auf weniger als 15 μm birgt das Risiko eines leichten kortikalen Traumas, das zu einer leichten kortikalen Entzündung führen kann¹⁴.
12. Befestigen Sie einen angepassten weiblichen Luer-Lock (2,2 mm Innendurchmesser, hergestellt aus einer 19G-Nadelnabe, wie in Abbildung 2D gezeigt) an der Stelle des ausgedünnten Schädels. Befestigen Sie den Luer-Lock mit Kleber und Zahnzement (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Wenn Sie Klebstoff verwenden, um den weiblichen Luer-Lock im Bereich um das Fenster mit verdünntem Schädel zu befestigen, ist es wichtig, den Schädelbereich gründlich zu trocknen und zu verhindern, dass der Klebstoff in das Fenster selbst eindringt. Klebstoff innerhalb des Fensters kann die Aufprallkraft des FPI deutlich reduzieren.

4. CHI-assoziiertes rmTBI-Modellierungsverfahren

1. Führen Sie rmTBI unter Verwendung der lateralen Fluidperkussionsmethode mit einem modifizierten FPI-Gerät ein, wie zuvor beschrieben^13,15.
2. Nachdem Sie die Verfahren am dünnen Schädelfenster und an der Impaktnabe abgeschlossen haben, übertragen Sie die Maus von der stereotaktischen Apparatur auf die Impaktorplattform.
3. Angesichts der möglichen Auswirkungen der Anästhesie auf die Zeit des Aufrichtreflexes der Tiere und die Schwere der Verletzung^nach der Perkussion ^9,16 ist die Anästhesietiefe zu überwachen, indem die Rückzugsreflexe des Lids und der Pfoten bewertet werden (Abbildung 2F).
4. Verbinden Sie den weiblichen Luer-Lock, der auf das Fenster des verdünnten Schädels geklebt wurde, mit dem männlichen Luer-Lock am Ende des FPI-Geräteschlauchs (Abbildung 2G).
   HINWEIS: In der rmTBI-Modellierung wurde die Isofluran-induzierte Anästhesie bei Mäusen aufgrund der Induktion von Apnoe und Bewusstlosigkeit durch Perkussion verlängert.
5. Führen Sie zwei leichte SHT (48-Stunden-Intervall) mit dem modifizierten Gerät ein. Wenden Sie den ersten FPI-Aufprall unmittelbar nach Abschluss der Operation am dünnen Schädelfenster und der Installation des Luer-Locks an. Verabreichen Sie den FPI-Aufprall erst, wenn die Maus jedes Mal die Rückkehr eines Entzugsreflexes zu einem Pfotenkneifen zeigt (Abbildung 2H). Die Anwendung eines FPI-Effekts bei tief anästhesierten Mäusen kann zu anhaltender Apnoe und zum Tod führen.
   1. Um den FPI-Aufprall aufzubringen, hebt man das Pendel auf den vorgesehenen Grad entlang des Winkelmessers an der Vorrichtung an und lässt das Pendel mit Hilfe der Softwaresteuerung^13,15 los. Der Aufprall sollte eine Perkussionsintensität von 2,0 ± 0,1 atm erreichen, gemäß den etablierten Protokollen, die in Nagetierstudien verwendet werden 10,17,18. Tiere sind von weiteren Tests auszuschließen, wenn der Aufprall zwischen 1,9 und 2,1 atm nicht registriert wurde oder wenn während der FPI eine Schädelfraktur auftrat.
   2. Befestigen Sie die Scheinmäuse auf dem Gerät, aber geben Sie den Aufprall nicht ab.
6. Nach dem Aufprall sofort den Luer-Lock-Anschluss lösen und die Mäuse zur Wiederherstellung auf ein isothermes Heizkissen übertragen. Nachdem die Maus wieder wach und bei Bewusstsein ist, bringen Sie sie in ihren Heimatkäfig zurück, ohne den weiblichen Luer-Lock zu entfernen. Verabreichen Sie den zweiten FPI-Aufprall auf die gleiche Weise 48 Stunden später.
7. Entfernen Sie nach dem rmTBI vorsichtig den weiblichen Luer-Lock und den Zahnzement. Vernähen Sie die Kopfhaut mit Gewebekleber und kneifen Sie die Kopfhaut mit einer flachen Pinzette zusammen, um den Adhäsionsprozess zu erleichtern (siehe Materialtabelle; Abbildung 2I).
8. Um Entzündungen und Infektionen vorzubeugen und postoperative Schmerzen und Beschwerden zu lindern, tragen Sie eine Mischung aus Erythromycin und Natriumdiclofenac-Salbe im Verhältnis 1:1 (siehe Materialtabelle) auf die Wunde auf. Übertragen Sie die Mäuse zur Wiederherstellung auf ein isothermes Heizkissen.
9. Notieren Sie die Dauer des Aufrichtreflexes, der beginnt, wenn die Maus aus dem stereotaktischen Apparat genommen und seitlich auf die Impaktorplattform für FPI gelegt wird, und so lange andauert, bis die Maus selbstständig aufrecht stehen kann.
10. Nachdem die Maus wieder wach und bewusst ist, bringe sie in ihren Heimatkäfig zurück. Mäuse sind in der Regel innerhalb von 1,5 Stunden nach der Verletzung bei vollem Bewusstsein und in der Lage, zu gehen.
11. Beobachten Sie die Mäuse in den Tagen nach der SHT-Modellierung auf verschiedene Anzeichen, einschließlich Atemmuster, Vorhandensein von Schleim um Nase und Mund sowie Rötung, Schwellung, Exsudat oder Wiedereröffnung des Wundbereichs. Nehmen Sie Tiere mit einem oder mehreren der oben genannten abnormalen Symptome von der Studie aus.
    HINWEIS: Die Prä-Mikroinjektion von AAV-GCaMP6s ermöglicht die Beobachtung der zugrunde liegenden neuronalen Ca2+-Homöostase und Erregbarkeit im verletzten Kortex durch das Fenster des verdünnten Schädels unter Verwendung der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie¹⁵.

5. Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM)

HINWEIS: Das MWM (siehe Materialtabelle) ist eine weithin anerkannte Methode zur Bewertung des räumlichen Lernens und von Gedächtnisdefiziten bei Mäusen nach einem SHT.

1. Führen Sie den MWM-Test ab 7 Tagen nach der Verletzung (DPI) durch. Das kreisförmige Becken der MWM hatte einen Durchmesser von 120 cm und eine Höhe von 50 cm, wobei die Wassertemperatur bei 25 °C gehalten wurde. Unterteilen Sie das kreisförmige Becken in vier Quadranten, wobei die Fluchtplattform, eine runde Plattform mit einem Durchmesser von 6 cm und einer Höhe von 30 cm, 1 cm unter der Wasseroberfläche im nordöstlichen Quadranten eingetaucht ist.
2. Positionieren Sie eine Kamera direkt über dem kreisförmigen Pool, um die Bewegungsbahn der Mäuse aufzuzeichnen. Markieren Sie die Mäuse mit schwarzem Klebeband auf dem Rücken, um die Erkennung durch die Bilderfassungssoftware zu erleichtern und die Datenaufzeichnung zu ermöglichen, einschließlich der Latenz, der Schwimmstrecke und der Bewegungsbahn.
3. Lege die Mäuse mit dem Gesicht zur Innenwand jedes der vier Quadranten ins Wasser, einmal für jeden Quadranten. Sobald die Mäuse die Plattform gefunden haben, lassen Sie sie dort 10 Sekunden lang ruhen. Wenn eine Maus die Plattform nicht innerhalb von 60 s findet, bitten Sie den Bediener, die Maus zur Plattform zu führen, sie 10 Sekunden lang auf der Plattform ruhen zu lassen und dann die Maus zur Ruhe in ihren Ausgangskäfig zurückzubringen.
4. Wiederholen Sie für jede Maus den Akquisitionsversuch 4x täglich. Führen Sie nach den Erfassungsversuchen bei 12 DPI ein 60-Sekunden-Experiment mit räumlichen Sonden durch und zeichnen Sie auf, wie oft die Mäuse den ursprünglichen Plattformbereich überquert haben und wie lange die Maus in dem Quadranten verweilt, in dem sich die Plattform befand.
5. Trocknen Sie die Mäuse nach jedem Versuch schnell mit einem Handtuch ab oder legen Sie sie unter eine Wärmelampe, um ihre Körpertemperatur zu halten und eine Unterkühlung während des 60-s-Erwerbsversuchs von DPI 7 bis DPI 11 zu verhindern.
6. Nach Abschluss der oben beschriebenen experimentellen Verfahren werden die Mäuse mit Pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) bei 13 DPI anästhesiert. Isotonische Kochsalzlösung transkardial perfundieren, gefolgt von Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2). Entnahme des Gehirns für die konventionelle HE-Färbung zur Beurteilung grober kortikaler und hippokampaler Morphologieveränderungen. Eine detaillierte Beschreibung des HE-Färbeprotokolls findet sich in früheren Veröffentlichungen^13,15.
7. Nachdem alle Experimente abgeschlossen sind, wird die Maus durch Injektion einer Überdosis Pentobarbital (≥100 mg/kg, i.p.) eingeschläfert, wenn keine Mausproben benötigt werden. Vor der Entnahme von Gewebe oder der Entsorgung des Kadavers ist die Maus zu überwachen, bis mindestens 60 s lang kein Herzschlag mehr zu hören ist.

Ergebnisse

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll skizziert eine Methode zur Induktion eines rmTBI durch ein dünnes Schädelfenster, das eine Lösung für die Hirnverletzung bietet, die durch die Vorbereitung der Kraniotomie während der konventionellen Perkussions-TBI-Modellierung verursacht wird. Durch die Verwendung dieses modifizierten Fluid-Perkussionsverfahrens mit der modifizierten Vorrichtung wurde eine verbesserte Präzision und Reproduzierbarkeit des FPI-Schlags erreicht¹³. Der modifizierte Impaktor ist so vielseitig, dass er sowohl für die CHI- als auch für die FPI-Modellierung mit oder ohne Schädelkraniotomie verwendet werden kann. Darüber hinaus wird die Schwere der Verletzung durch die Anpassung von Verletzungsparametern, wie z. B. den Fallwinkel des Aufprallpendels, oder durch das Hinzufügen von zusätzlichen geschlossenzelligen Ethylen-Vinylacetat-Schaumstoffpolstern unterschiedlicher Härte an der Endplatte der Kolbenstange moduliert.

Das modifizierte rmTBI-Modell bietet signifikante Vorteile, wie z. B. die Erzeugung einer fokalen und diffusen Pathologie ohne Freilegung der kortikalen Dural, wodurch die Entzündung durch meningeale Exposition und/oder direkte FPI auf das Parenchym minimiert wird. Darüber hinaus reduziert dieses Modell Schwankungen in der Dicke und Form des Schädelknochens, um zuverlässige Verletzungsergebnisse zu erzielen. Daher ist das modifizierte rmTBI-Modell effektiv und zuverlässig bei der Simulation klinisch relevanter postkonkussiver Symptome (PCS)-bedingter neuropathologischer und verhaltensbezogener Defizite über verschiedene Verletzungsgrade hinweg. Insbesondere ist dieses Modell nützlich für die Untersuchung pathologischer Mechanismen von TBI, die auf der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von TBI-Modellen von Tieren beruhen, insbesondere für die Untersuchung milder SHT-bezogener Mechanismen.

Der frontale laterale Ast der mittleren Hirnarterie der Maus und der kaudalen Rhinalvene¹⁹, die sich unterhalb des verdünnten Schädels befinden, ermöglichten eine klare Visualisierung unter der Kamera. Nach zwei rmTBI-Perkussionen, jeweils bei einem Druck von etwa 2,0 atm, zeigten alle Mäuse subdurale Hämatome bei 0 DPI. Obwohl die Integrität des ausgedünnten Schädels nicht beeinträchtigt zu sein schien; Es wurde jedoch eine Verringerung der Anzahl der Mikrogefäße zusammen mit Veränderungen in der Morphologie der Mikrogefäße beobachtet (Abbildung 2H), wie bereits berichtet¹⁵. Mit 2 DPI lösten sich die Hämatome weitgehend auf. Die Sterblichkeit resultiert in erster Linie aus dem Aufprall der Maus, während die Maus unter tiefer Narkose steht, was die Apnoe erheblich verlängern kann. Die regelmäßige Beurteilung der Narkosetiefe vor dem Aufprall durch die Rückzugsreflexe des Lides und der Pfoten kann die Mortalität erheblich senken. Weitere Faktoren, die sich auf die Sterblichkeitsrate nach einer Flüssigkeitsperkussion auswirken können, sind die Belastung der Maus, die Härte des Schädels, das Geschlecht und das Alter. In einer früheren Studie, in der das gleiche rmTBI-Protokoll verwendet wurde, war eine C57BL/6J-Maus¹⁵ Jahre alt. In diesem Protokoll wurden nur männliche ICR-Mäuse verwendet, um das gesamte Verfahren einzuführen.

Sowohl Human- als auch Tierstudien haben gezeigt, dass selbst wiederholte subkonkussive Kopfstöße weit verbreitete mikrostrukturelle Verletzungen der weißen Substanz verursachen können 20,21,22, die mit einer schlechteren kognitiven Leistung verbunden sind^21,22. Bei 7-12 DPI kann rmTBI zu Beeinträchtigungen des räumlichen Lernens und des Gedächtnisses führen, die mit dem MWM-Paradigma untersucht wurden. Abbildung 4 veranschaulicht die Ergebnisse dieser Bewertung.

Die Analyse des letzten Akquisitionsversuchs im MWM zeigte eine signifikante Erhöhung (p< 0,05) der Latenz von rmTBI-Mäusen, um die submerse Plattform zu erreichen, im Vergleich zur Kontrollgruppe. In der Sondenstudie zeigte die Analyse des Prozentsatzes der Zeit, die im ursprünglichen Plattformquadranten verbracht wurde, eine signifikante Reduktion (p<0,01) in der rmTBI-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, was auf einen Rückgang des räumlichen Referenzlernens und der Gedächtnisfähigkeiten bei Mäusen mit rmTBI hinweist.

Das hier beschriebene Verfahren wurde in einer früheren Veröffentlichung¹⁵ mit den C57BL/6J-Mäusen verwendet. Neben der MWM wurden drei weitere Analysen durchgeführt, die im Folgenden beschrieben werden.

Das OFT wurde verwendet, um die Fortbewegungs- und Erkundungsfähigkeiten zu bewerten, indem die mittlere Reisegeschwindigkeit, die zurückgelegte Gesamtstrecke und der Prozentsatz der zurückgelegten Strecke in den mittleren Zonen gemessen wurden. Führen Sie einen Open-Field-Test (OFT) bei 6 DPI durch, um Fortbewegung, Erkundung und Angst bei Mäusen zu bewerten. Das Testgerät mit den Maßen 40 x 40 x 40 cm, das in 16 Zonen (jeweils 18 x 18 cm) unterteilt wurde. Die Maus wurde in der Mitte des Geräts platziert und durfte 5 Minuten lang frei erkunden. Es wurden die in den mittleren 4 Zonen zurückgelegte Strecke, die zurückgelegte Gesamtstrecke, die mittlere Bewegungsgeschwindigkeit und die in den Grenzzonen verbrachte Zeit aufgezeichnet. Das Angstniveau wurde auf der Grundlage des prozentualen Prozentsatzes der zurückgelegten Strecke in den zentralen Zonen und der Zeit, die Nagetiere während eines 5-minütigen Beobachtungszeitraums in den angrenzenden Zonen verbrachten, bewertet. Bei 6 DPI hat das rmTBI möglicherweise keinen signifikanten Einfluss auf die allgemeinen Bewegungsfähigkeiten der Mäuse, es kann erhebliche Angst hervorrufen und das Erkundungsverhalten verändern, wie in Abbildung 4¹⁵ gezeigt. Darüber hinaus induziert das modifizierte rmTBI-Modell diffuse axonale Verletzungen, die durch zusätzliche Verhaltenstests, wie z.B. den in diesem Protokoll beschriebenen kognitiven Fähigkeitstest, bewertet werden können.

Es wurde gezeigt, dass RmTBI das räumliche Arbeits- und Referenzgedächtnis bei Mäusen beeinträchtigt, wie in Abbildung 5¹⁵ dargestellt. Diese kognitiven Funktionen wurden mit dem Y-Labyrinth-Test bewertet. Der Test wurde bei 8 DPI durchgeführt, um die Defizite des Kurzzeitarbeitsgedächtnisses bei Mäusen zu messen. Für das spontane Wechselverhalten: Es wurde ein Y-Labyrinth aus Acryl (20 cm hoch, 50 cm lang und 10 cm breit an der Unterseite) verwendet. Nachdem ich die Maus in der Mitte des Geräts platziert und sie 8 Minuten lang erkunden gelassen hatte, wurden die Armeintritte aufgezeichnet. Spontanes Wechselverhalten ist definiert als das sukzessive Eindringen der Maus in die drei Arme bei Triplett-Sets. Berechnen Sie die spontane Wechselrate (%) als (aufeinanderfolgende Triplett-Sätze / Gesamtzahl der Armeinträge minus 2) x 100. Schließen Sie für das räumliche Bezugsgedächtnis während des 8-minütigen Trainings nach dem Zufallsprinzip einen Arm des Y-Labyrinth-Geräts. Nach 1 h nach der ersten Belichtung wird die Maus mit allen drei Armen wieder in das Labyrinth eingeführt und kann 3 Minuten lang frei erkunden. Die Zeit, die für die Erkundung des neuen Arms im Vergleich zu den beiden anderen Armen aufgewendet wurde, wird aufgezeichnet. Berechnen Sie den Präferenzindex als die im neuen Arm verbrachte Zeit im Vergleich zur Zeit, die in allen drei Armen verbracht wurde.

Darüber hinaus empfehlen wir, grobe strukturelle Läsionen im Gehirn mit einer einfachen HE-Färbung (Abbildung 6)¹⁵ nach Abschluss aller Verhaltenstests zu bewerten. Verwenden Sie die kortikale Region, die von 1 mm anterior der Läsionsstelle bis zum hinteren Rand der Läsion geschnitten ist, und die Hippocampusregion, die koronal an der typischen sichelförmigen Zone geschnitten ist (Bregma: -1,7 bis -2,2 mm). Das Zählen der Neuronen in jedem Objektträger aus sechs randomisierten Feldern unter Verwendung eines Okulargitters (400-fache Vergrößerung) und die Mittelung der Neuronenzahl ergaben die numerische Dichte pro Gesichtsfeld (numerische Dichte). Es wurde festgestellt, dass die von rmTBI betroffenen Hirnregionen unterschiedlich starke Neuronenverletzungen aufwiesen¹⁵. Insbesondere zeigte der motorische Kortex ein stärkeres und vielfältigeres Ausmaß solcher Verletzungen als der Hippocampus. Die HE-Färbung zeigte eine beträchtliche Verschiebung in Richtung pyknotischer Morphologie von normalen Neuronen (Abbildung 6A,B,E,F). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass sich die extrazelluläre Matrix spezifisch im Bereich der Läsion lockert (Abbildung 6F). Neben den beobachteten matrixgelockerten Bereichen zeigten rmTBI-Mäuse auch eine signifikante Zunahme der hyperchromen Färbung, die sich in einer dunkleren roten Farbe in einer signifikanten Anzahl von subgranularen Neuronen im Gyrus dentatus und einigen kortikalen und CA1-Neuronen zeigt. Interessanterweise wiesen diese Färbemuster keine begleitenden Anzeichen einer zytoplasmatischen Schrumpfung oder eines pyknotischen Kerns auf (Abbildung 6C,D,G,H,K)¹⁵. Die oben erwähnten Verhaltens- (mit Ausnahme des WMM-Tests) und HE-Färbemethoden wurden in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung ausführlich beschrieben, in der das modifizierte rmTBI-Modell^{vorgestellt wurde 15}.

Abbildung 1: Das modifizierte FPI-Gerät und der Software-Screenshot. (A) Das modifizierte FPI-Gerät. (B) Der Screenshot zeigt die FPI-Druckwellenform und die automatische Messung und den Export von Echtzeit-Aufpralldruckparametern wie Anstiegszeit, Abfallzeit und Halbwertsdauer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Das modifizierte Mausmodell des rmTBI in ICR-Mäusen. (A) Es wird ein Mittellinienschnitt gemacht, um das Operationsgebiet freizulegen. (B) Auf dem motorischen Kortex wurde ein verdünntes Schädelfenster hergestellt. Die Klarheit der freiliegenden kortikalen Mikrogefäße wird verwendet, um die Dicke des Schädels zu bestimmen. (C) Die Dicke des Schädels kann auch überprüft werden, indem der verdünnte Schädel vorsichtig mit der abgeflachten Spitze einer feinen Spritzennadel untersucht und seine Weichheit beurteilt wird. (D) Der weibliche Luer-Lock wurde auf das Fenster des ausgedünnten Schädels geklebt. (E) Der angebrachte weibliche Luer-Lock wurde durch Auftragen von Zahnzement gesichert. (F) Die Tiefe der Anästhesie wurde durch Überprüfung der Lid- und Pfotenrückzugsreflexe überwacht. (G) Der FPI-Aufprall wurde nach der Rückkehr eines Entzugsreflexes zu einem Pfotenkneifen abgegeben. (H) Post-rmTBI-Bild eines verdünnten Schädelfensters bei 0 DPI. (I) Die Kopfhaut wurde mit Gewebekleber vernäht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die Auswirkungen von rmTBI auf das räumliche Referenzlernen und das Gedächtnis bei ICR-Mäusen. (A) Die Navigationsspur für Mäuse während des letzten Akquisitionsversuchs, aufgezeichnet bei 11 DPI, (B) die räumliche Sondenroute im Sondenversuch, aufgezeichnet bei 12 DPI, und (C) die Fluchtzeit, die Mäuse benötigten, um die Plattform während des letzten Akquisitionsversuchs zu lokalisieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die rmTBI-Gruppe signifikant länger brauchte, um die versteckte Plattform zu erreichen als die Kontrollgruppe (S<0,05). (D) Der Prozentsatz der Zeit, die Mäuse im ursprünglichen Plattformquadranten verbrachten, im Verhältnis zur Gesamtnavigationszeit während des Sondenversuchs war in der rmTBI-Gruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (p<0,01). n=8. *p<0,05, **p<0,01 vs. Kontrolle durch ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Auswirkungen von rmTBI auf Fortbewegung, Exploration und Angst bei C57BL/6J-Mäusen. (A) Repräsentative Spuren der Kontroll- und rmTBI-Bewegung von Mäusen während einer 5-minütigen OFT. (B-E) Zusammengefasste Daten zeigen die zurückgelegte Strecke in den mittleren Zonen, die insgesamt zurückgelegte Entfernung, die durchschnittliche Reisegeschwindigkeit bzw. die in den peripheren Zonen verbrachte Zeit. Kontrolle, n=13; rmTBI, n = 12. S<. 01 vs. Kontrolle durch ungepaarten t-Test. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die Auswirkungen von rmTBI auf das räumliche Arbeits- und Referenzgedächtnis in C57BL/6J-Mäusen. (A, B) Repräsentative Spuren der Kontroll- und rmTBI-Mausbewegung während der räumlichen Arbeits- und Referenzgedächtnisbewertungen im Y-Labyrinth. Der Y-Labyrinth-Spontanwechseltest ist eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung des Kurzzeitgedächtnisses in Nagetiermodellen¹⁵. (C) Zusammenfassung der spontanen Wechselraten von Kontroll- und rmTBI-Mäusen während der räumlichen Arbeitsbewertung. Nagetiere ziehen es in der Regel vor, einen neuen Arm des Labyrinths zu erkunden, anstatt einen bereits erkundeten erneut zu besuchen. Basierend auf der Zeit, die Nagetiere im neuen Arm verbracht haben, im Vergleich zu der Zeit, die sie in allen drei Armen verbracht haben, wird ein Präferenzindex berechnet, der dann analysiert wird. (D) Zusammenfassung des Präferenzindex von Kontroll- und rmTBI-Mäusen während der räumlichen Arbeitsbewertung. Kontrolle, n=13; rmTBI, n=12. S<. 01 vs. Kontrolle durch ungepaarten t-Test. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Vergleich der HE-Färbung des ipsilateral verletzten motorischen Kortex und der Subregion des Gyrus dentatus des Hippocampus zwischen Kontrolle und rmTBI bei C57BL/6J-Mäusen. (A, B) Normaler motorischer Kortex; und (C, D) die Hippocampusregion von Kontrollmäusen in verschiedenen Vergrößerungen. (E, F) Verletzte motorische Hirnrinde und (G, H) Hippocampusregionen von rmTBI-Mäusen. Hyperchrome Neuronen im Kortex und CA1 könnten entweder durch die Operationsvorbereitung oder ein anhaltendes rmTBI leicht beeinflusst worden sein; Im motorischen Kortex von rmTBI-Mäusen wurden jedoch hypochrome (möglicherweise intermediär verletzte) und pyknotische (apoptotische Neuronen) Neuronen im Vergleich zu normalen Neuronen bei den Kontrollmäusen beobachtet. Zu diesen neuronalen Apoptosemerkmalen gehörte eine neuronale zytoplasmatische und Kernschrumpfung, begleitet von einer scheinbaren Vakuolisierung. Bemerkenswert ist, dass die weiße Abgrenzungslinie in (E) die Grenze zwischen dem Läsionierten und dem umgebenden Gewebe darstellt. Darüber hinaus bezogen sich die hyperchromen Neuronen in der DG-Subregion (H) möglicherweise auf neu generierte unreife und reife granulare Neuronen. Die folgenden Balkendiagramme zeigen die Verteilung normaler und rmTBI-betroffener Neuronen in den Subregionen (I) motorischer Kortex und Hippocampus (J), CA1 und (K) DG. Kontrolle, n=13; rmTBI, n=12, ***p<. 001 vs. Kontrolle durch ungepaarten t-Test. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

SHT bezieht sich auf zwei Haupttypen, geschlossen und penetrierend, wobei letzterer durch eine Störung des Schädels und der Dura mater gekennzeichnet ist. Klinische Daten deuten darauf hin, dass CHIs häufiger vorkommen als penetrierende Verletzungen ^1,2. Nach einem einzigen leichten SHT treten bei den meisten Patienten PCS-Symptome auf, die in der Regel in kurzer Zeit abklingen, und es gibt Kontroversen über den Anteil der Patienten, deren PCS sich zu Langzeitfolgen entwickelt ^23,24. Infolgedessen haben die Forscher ihren Fokus auf repetitive CHI-Modelle verlagert, um die kumulativen Auswirkungen mehrerer Gehirnerschütterungen besser zu verstehen²⁵, die häufig bei Stürzen, Verkehrsunfällen und Kontaktsportarten auftreten. Diese wiederholten Auswirkungen können zu schwerwiegenderen und langfristigeren Auswirkungen führen ^26,27. Durch die Verwendung repetitiver CHI-Modelle können Forscher die potenziellen additiven oder synergistischen Effekte mehrerer Gehirnerschütterungen untersuchen und ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen erlangen, die zu PCS beitragen. Solche Modelle können die Entwicklung gezielter therapeutischer Interventionen erleichtern, um die Langzeitfolgen wiederholter Kopfstöße zu mildern.

Obwohl einige CHI-Modelle versuchen, sowohl fokale Einzel- als auch rmTBI zu simulieren, indem sie sowohl lineare als auch Rotationskräfte einbeziehen, können diese Modelle aufgrund von Faktoren wie Schädelfraktur, Schädelmorphologie und -dicke, erweiterter tierischer Apnoe¹⁰ und Variabilität in mechanischen Eingabeparametern, insbesondere wenn Rotationskopfbewegungen berücksichtigt werden, zu Rückprallverletzungen und Ungenauigkeiten in der Verletzungsschwere führen⁹. Kolbenkontrollierte Aufprall- und Gewichtsabfallmethoden werden häufig verwendet, um rmTBI in Tiermodellen von CHI²⁵ zu induzieren. Der kolbengesteuerte Aufprall ermöglicht eine präzise und einstellbare Einstellung der Aufprallparameter durch den Einsatz von elektromagnetisch oder pneumatisch angetriebenen Prallkörpern und ermöglicht so eine hohe Schlagreproduzierbarkeit. Der Einsatz des kolbengesteuerten Aufpralls, sei es auf den exponierten Kortex wie bei der CCI oder auf den geschlossenen Schädel, erfordert jedoch immer noch eine stringente Immobilisierung des Tierkopfes in einem stereotaktischen Rahmen während des Aufpralls. Umgekehrt erfordern Gewichtsabnahmemethoden einfache und kostengünstige Materialien, die leicht einzurichten sind, aber der Kompromiss ist eine etwas hohe Variabilität in der Schwere der Verletzung²⁵.

Das FPI-Modell induziert typischerweise gemischte fokale und diffuse Verletzungen, was die Herstellung von SHT unterschiedlicher Schweregrade ermöglicht. Trotz seiner Vorteile hat das FPI-Modell auch potenzielle Einschränkungen. Wie das CCI-Modell erfordert auch die FPI eine Kraniotomie, einen chirurgischen Eingriff, der eine Entzündung im Hirngewebe auslösen kann¹⁷. Darüber hinaus dringt selbst ein milder FPI häufig in unterschiedlichen Tiefen in die Dura ein, was zu Verwirrungen bei der Interpretation der Daten führen kann. Daher haben CCI- und FPI-Modelle Einschränkungen bei der Replikation der klinischen Merkmale, die bei leichten SHT-Patienten beobachtet wurden⁹. Daher stellen wir ein Protokoll vor, das das dünne Schädelfenster und die FPI-Methode kombiniert, die zur Erstellung eines präziseren Mausmodells des CHI-assoziierten rmTBI verwendet werden kann. Ziel dieses Protokolls ist es, die klinischen Merkmale von Patienten mit leichtem SHT genau widerzuspiegeln. Ein hochgradig reproduzierbares Modell wäre ein unschätzbares Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Pathophysiologie des milden SHT zugrunde liegen, und mögliche therapeutische Interventionen zu bewerten.

Unsere Forschungsergebnisse zu rmTBI stimmen mit früheren Veröffentlichungen überein, in denen verdünnte Schädelfenster für leichte SHT-Untersuchungen verwendet^{wurden 28,29}. Zum Beispiel erzeugten Ren et al. ein verdünntes Schädelfenster mit einer Dicke von etwa 30 μm im linken parietalen Assoziationskortex und induzierten ein leichtes SHT, indem sie das Fenster vorsichtig mit einem stumpfen Ende mit einem Durchmesser von 1 mm von einem chirurgischen stereotaktischen Instrument drückten²⁹. Ihre Studie zeigte eine bemerkenswerte Ausweitung des Zelltods und der Expression reaktiver oxidativer Spezies (ROS) im verletzten Kortex²⁹. Um das rmTBI zu untersuchen, applizierten Nguyen et al. drei CCIs mit einer modifizierten Impaktorspitze (runde Silikonspitze mit 3 mm Durchmesser und 1,5 mm Dicke) auf ein verdünntes Schädelfenster der Maus (20-40 μm dick) im parietalen Assoziationskortex²⁸. Um die Transparenz des ausgedünnten Schädelbereichs für die Langzeitbildgebung zu schützen und zu erhalten, bedeckten sie das Fenster des verdünnten Schädels mit einer dünnen Schicht Cyanacrylatkleber. Die drei CCIs wurden 3 Wochen lang einmal wöchentlich mit Aufprallparametern von 4 m/s in der Geschwindigkeit und 2 mm in der Tiefe durchgeführt. Als Ergebnis der drei CCIs zeigten die Mäuse eine deutliche Astrogliose und Mikrogliaaktivierung²⁸. Angesichts der Tatsache, dass die Verwendung des dünnen Schädelfensters als Modell für leichtes SHT/rmSHT relativ neu ist, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der Schwere/dem Fortschreiten der Verletzung und verschiedenen Aufpralltechniken zu untersuchen. In einer früheren Studie konnten wir beispielsweise offensichtliche Veränderungen in der Zellmorphologie nach zwei FPIs beobachten, die im Abstand von 2 Tagen verabreicht wurden¹⁵. In anderen Studien führte eine einzige sanfte Kompression des ausgedünnten Schädelfensters zu einem leichten SHT mit offensichtlichem Zelltod und reaktiver oxidativer Speziesexpression²⁹, und drei wöchentliche CCIs führten zu einer robusten Astrogliose und Mikrogliaaktivierung²⁸.

Es sollten mehrere Schritte vorsichtig durchgeführt werden, um ein konsistentes Verletzungsmodell unter Verwendung der beschriebenen Methode herzustellen. Während der Operation des ausgedünnten Schädelfensters sollte der Mauskopf basierend auf verschiedenen Zielbereichen (z. B. haben wir uns auf den motorischen Kortex konzentriert) in einem stereotaktischen Rahmen auf horizontaler Ebene oder in einem leichten lateralen Winkel zur gegenüberliegenden Seite des verdünnten Schädelfensters in diesem Protokoll fixiert werden. Diese spezifische Positionierung kann die Bildung des ausgedünnten Schädelfensters in dem Bereich erleichtern, der dem motorischen Kortex entspricht. Die genaue Platzierung der Ohrbügel ist einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens, und es kann Zeit und Übung erfordern, es zu beherrschen. Bevor Sie versuchen, das Fenster des dünnen Schädels zu operieren oder CHI zu induzieren, ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Schädel waagerecht ist. Ist der Schädel nicht richtig positioniert, sollte der Kopf entsprechend angepasst werden. Aufgrund der ungleichmäßigen Form und Dicke des Schädelknochens ist das Schädelwachstum selbst innerhalb eines spezifischen Knochens³⁰ variabel. Es ist entscheidend, die Kopfpositionierung anzupassen, bevor das Verfahren mit ausgedünntem Schädelfenster oder CHI durchgeführt wird. Geschieht dies nicht, erhöht sich das Risiko von Schädelfrakturen, die die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des CHI erheblich beeinträchtigen können. Eine umfassendere Anleitung zum Verfahren mit verdünnten Schädelfenstern finden Sie in dem von Guang et ^al.14 beschriebenen Protokoll.

Die Wahl des TBI-Modellierungsbereichs variiert je nach Forschungsschwerpunkt der Forscher. Angesichts der signifikanten Variabilität der tatsächlichen Lokalisation der Verletzung bei CHI wird empfohlen, die Aufprallstelle in zukünftigen experimentellen Studien zu variieren, obwohl die meisten Studien berichten, dass die Aufprallstelle zentral zwischen Bregma und Lambda liegt, wie in einer Überprüfung von CHI-Tiermodellen^{festgestellt wurde 25}. Um das modifizierte CHI-Modell für dünne Schädelverletzungen zu validieren, empfehlen wir, mit dem motorischen Kortex zu beginnen, wie in diesem Protokoll beschrieben. Das rmTBI kann Verletzungen des fokalen motorischen Kortex verursachen, die mit lokomotorischen Bewertungsansätzen wie dem OFT in diesem Protokoll leicht beurteilt werden können. Der Schnitt, der während dieses Verfahrens gemacht wird, benötigt Zeit, um zu heilen, und dies kann möglicherweise eine periphere Immunantwort auslösen, die letztendlich Variabilität in das Experiment bringt. Um das Risiko von Entzündungen, Infektionen und postoperativen Schmerzen und Beschwerden zu minimieren, empfehlen wir, eine topische Salbe mit einer Kombination aus Erythromycin und Natriumdiclofenac auf die Wunde aufzutragen. Dieser Ansatz hat sich als wirksam bei der Verringerung von Entzündungen und Schmerzen erwiesen, die mit chirurgischen Eingriffen bei Tieren verbunden sind.

Das auf dünnen Schädeln basierende Fluid-Percussion-Protokoll ist eine vielversprechende Methode zur Modellierung von rmTBI bei Nagetieren, da es die Entzündung reduziert, die häufig durch die Exposition der Hirnhäute gegenüber FPI verursacht wird. Diese Technik, die im Thinned-Skull-Fenster zum Einsatz kommt, kann klinisch relevantes PCS in unterschiedlichem Maße effektiv erzeugen und bietet Forschern, die rmTBI untersuchen, eine potenzielle Alternative. Darüber hinaus erleichtert das Fenster des verdünnten Schädels die Beobachtung der Ca2⁺ -Homöostase und der neuronalen Übererregbarkeit im Kortex in vivo¹⁵. Die Anwendung dieser Technik kann unser Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der PCS-Progression kurz-/mittel- und langfristig verbessern und dadurch die Fähigkeit verbessern, ihre Entwicklung vorherzusagen und wirksamere therapeutische Behandlungen zu entwickeln.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
75% Ethanol	Verifizierter Lieferant - Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.
Buprenorphinhydrochlorid	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	H12020272	Lösung, Analgetikum
Carprofen	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Pulver, Analgetikum
Chlorhexidindigluconat	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	19%-21% ige wässrige Lösung, antimikrobieller
Zahnzement- und Lösungsmittelsatz	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Pulver in passendem Lösungsmittel rekonstituiert
Präpariermikroskop	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Erythromycin Salbe	Verifizierter Lieferant - Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	220412
Antibiotika-Faseroptik-Kaltlichtquelle	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Mikrobohrer mit flacher Spitze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	2 mm,
Stahl FPI Gerätesoftware	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impaktor V1.0
ICR-Mäuse	Jinhua Laboratory Animal Center	Bestand#2023091	25 männliche Mäuse, 25-30g, 8 Wochen alt
Isofluran	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.
Isothermes Heizkissen	Verifizierter Lieferant - Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.
Luer Loc hup			Sonderanfertigung mit einer 19G-Nadelnabe
Mikro-Hand-Schädelbohrer	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max: 38.000 U/min
Modifiziertes FPI-Gerät	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris Wasserlabyrinth	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Auswertung der räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten von Mäusen
Freifeld	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Beurteilung der Locomoation und Angst der Maus
Ophthalmic Gleitmittel	Verifizierter Lieferant - Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.
Natriumdiclofenac-Salbe	Verifizierter Lieferant - Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	221207	nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament
Anästhesiesystem für Kleintiere-Enhanced	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Intelligentes Videoverfolgungssystem	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Tierverfolgung und -analyse
Stereotaktischer Rahmen	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Naht die Tierwunde
Y Labyrinth	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Räumliches Arbeitsgedächtnis der Maus auswerten