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Methodenartikel

Modifiziertes Mausmodell für repetitives leichtes Schädel-Hirn-Trauma mit verdünntem Schädelfenster und flüssiger Perkussion

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DOI:

10.3791/66440

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19. April 2024

 ,  ,  ,  , 
1College of Physical Education and Health Sciences, Zhejiang Normal University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein modifiziertes Mausmodell für repetitive milde traumatische Hirnverletzungen (rmTBI) vor, die über eine geschlossene Kopfverletzungsmethode (CHI) induziert werden. Der Ansatz zeichnet sich durch ein verdünntes Schädelfenster und eine Flüssigkeitsperkussion aus, um die Entzündung zu reduzieren, die häufig durch die Exposition von Hirnhäuten verursacht wird, sowie eine verbesserte Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Modellierung von rmTBI bei Nagetieren.

Zusammenfassung

Das leichte Schädel-Hirn-Trauma ist eine klinisch sehr heterogene neurologische Erkrankung. Hochgradig reproduzierbare Tiermodelle für traumatische Hirnverletzungen (SHT) mit gut definierten Pathologien werden dringend benötigt, um die Mechanismen der Neuropathologie nach leichtem SHT zu untersuchen und Therapeutika zu testen. Es hat sich als Herausforderung erwiesen, die gesamten Folgen des SHT in Tiermodellen zu replizieren. Daher ist die Verfügbarkeit mehrerer Tiermodelle für SHT notwendig, um die unterschiedlichen Aspekte und Schweregrade von SHT-Patienten zu berücksichtigen. CHI ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Herstellung von Nagetiermodellen für rmTBI. Diese Methode ist jedoch anfällig für viele Faktoren, einschließlich der verwendeten Aufprallmethode, der Dicke und Form des Schädelknochens, der Apnoe bei Tieren und der Art der verwendeten Kopfstütze und Immobilisierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Kombination der Methoden des dünnen Schädelfensters und der Fluid-Perkussionsverletzung (FPI) zu demonstrieren, um ein präzises Mausmodell des CHI-assoziierten rmTBI zu erstellen. Das Hauptziel dieses Protokolls besteht darin, Faktoren zu minimieren, die sich auf die Genauigkeit und Konsistenz der CHI- und FPI-Modellierung auswirken könnten, einschließlich der Dicke, Form und Kopfstütze des Schädelknochens. Durch die Verwendung einer Methode mit verdünntem Schädelfenster wird eine mögliche Entzündung aufgrund von Kraniotomie und FPI minimiert, was zu einem verbesserten Mausmodell führt, das die klinischen Merkmale repliziert, die bei Patienten mit leichtem SHT beobachtet wurden. Die Ergebnisse der Verhaltens- und histologischen Analyse mittels Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung deuten darauf hin, dass ein rSHT zu einer kumulativen Verletzung führen kann, die sowohl im Verhalten als auch in der groben Morphologie des Gehirns zu Veränderungen führt. Insgesamt stellt das modifizierte CHI-assoziierte rmTBI ein nützliches Werkzeug für Forscher dar, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu erforschen, die zu fokalen und diffusen pathophysiologischen Veränderungen des rmTBI beitragen.

Einleitung

Leichte SHT-Verletzungen, einschließlich Gehirnerschütterungen und Sub-Gehirnerschütterungen, machen die Mehrzahl aller SHT-Fälle aus (>80 % aller SHT)1. Ein leichtes SHT resultiert häufig aus Stürzen, Verkehrsunfällen, Gewalttaten, Kontaktsportarten (z. B. Fußball, Boxen, Hockey) und militärischen Kämpfen 2,3. Ein leichtes SHT kann zu neurobiologischen Ereignissen führen, die die neurologischen Verhaltensfunktionen während des gesamten Lebens des Patienten beeinträchtigen und das Risiko für neurodegenerative Erkrankungen erhöhen 4,5,6. Tiermodelle bieten ein effizientes und kontrolliertes Mittel zur Untersuchung eines leichten SHT, in der Hoffnung, die Diagnose und Behandlung des milden SHT weiter zu verbessern. Es wurden verschiedene Modelle für ein leichtes SHT entwickelt, wie z. B. das Modell des kontrollierten kortikalen Aufpralls (CCI), des Gewichtsabfalls (WD), der Flüssigkeitsperkussionsverletzung (FPI) und der Blast-TBI-Modelle 7,8. Kein einzelnes experimentelles Modell kann die gesamte Komplexität der SHT-induzierten Pathologie nachahmen 9,10. Die Heterogenität dieser Modelle ist vorteilhaft, um die vielfältigen Merkmale milder SHT-Patienten zu adressieren und die entsprechenden zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen. Jedes Tiermodell des SHT hat jedoch seine Grenzen3, die unser aktuelles Wissen über milde SHT bei Tieren und ihre klinische Relevanz einschränken.

Die WD- und CCI-Modelle werden verwendet, um klinische Zustände wie zerebralen Gewebeverlust, akute subdurale Hämatome, axonale Verletzungen, Gehirnerschütterungen, Funktionsstörungen der Blut-Hirn-Schranke und sogar Koma nach SHTzu replizieren 3,11,12. Beim WD-Modell werden Hirnschäden verursacht, indem entweder die Dura mater oder der Schädel mit frei fallenden Gewichten getroffen werden. Der Aufprall eines beschwerten Objekts auf einen intakten Schädel kann gemischte fokale/diffuse Verletzungen replizieren; Diese Methode ist jedoch mit einer schlechten Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Verletzungsstelle, einer Rebound-Verletzung und einer höheren Sterblichkeitsrate aufgrund von Schädelfrakturen verbunden 3,11,12. Beim CCI-Modell wird luftbetriebenes Metall aufgetragen, um direkt auf die freiliegende Dura Mater aufzutreffen. Im Vergleich zum WD-Modell ist das CCI-Modell genauer und reproduzierbarer, erzeugt jedoch aufgrund des geringen Durchmessers der aufprallenden Spitze11 keine diffusen Verletzungen. Bei der FPI-Modellierung wird das Hirngewebe durch Perkussion kurzzeitig verschoben und verformt. FPI kann eine gemischte fokale/diffuse Schädigung induzieren und intrakranielle Blutungen, Hirnschwellungen und fortschreitende Schäden der grauen Substanz nach einem SHT replizieren. FPI hat jedoch eine hohe Mortalitätsrate aufgrund von Hirnstammschäden und anhaltender Apnoe 3,12. Die Kraniotomie, die an herkömmlichen WD-, CCI- und FPI-Modellen beteiligt ist, kann zu kortikalen Kontusionen, hämorrhagischen Läsionen, der Schädigung der Blut-Hirn-Schranke, der Infiltration von Immunzellen, der Aktivierung von Gliazellen, einer verlängerten Modellierungszeit und möglicherweise tödlichen Ergebnissen führen 3,12.

Ein leichtes SHT zeichnet sich durch einen GCS-Score (Glasgow Coma Scale, GCS) im Bereich von 13 bis 152 aus. Ein leichtes SHT kann entweder fokal oder diffus sein und ist sowohl mit akuten Verletzungen wie dem Abbau der zellulären Homöostase, Exzitotoxizität, Glukosemangel, mitochondrialer Dysfunktion, Durchblutungsstörung und axonaler Schädigung als auch mit subakuten Verletzungen, einschließlich axonaler Schädigung, Neuroinflammation und Gliose verbunden 2,3. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Abgrenzung der komplexen Pathophysiologie des SHT sind die zugrundeliegenden Mechanismen des milden SHT/rmSHT nach wie vor schwer fassbar und bedürfen weiterer Untersuchungen9. Angesichts der Tatsache, dass CHI die häufigste Art von SHT12 ist, stellt dieses Protokoll einen neuartigen Ansatz dar, um ein präziser kontrolliertes Mausmodell des rmTBI unter Verwendung eines modifizierten FPI-Geräts zu erstellen, um einen Aufprall in einem ausgedünnten Schädelfensterdurchzuführen 13. Durch die Vermeidung von kraniotomieinduzierten Verletzungen, variablen Schädeldicken- und forminduzierten Ungenauigkeiten sowie Rebound-Verletzungen zielt dieser Ansatz darauf ab, die Hauptnachteile der WD-, CCI- und FPI-Modelle zu überwinden. Die Anwendung von FPI-Auswirkungen auf das dünne Schädelfenster ist praktisch für die Beurteilung von Hirngefäßschäden nach einem RMTT und trägt dazu bei, hohe Sterblichkeitsraten in einigen Modellen zu minimieren, was zu einer größeren Ähnlichkeit mit den klinischen Merkmalen von SHT-Patienten führt.

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Protokoll

Alle Verfahren, die mit diesem Protokoll verbunden sind, wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Zhejiang Normal University, Genehmigungsnummer, dw2019005) und in Übereinstimmung mit der ARRIVE und dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die technischen Spezifikationen finden Sie in der Werkstofftabelle.

1. Verfahren für den Umgang mit Tieren

  1. Halten Sie Mäuse in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 22-24 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 40 % bis 60 %, einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und bieten Sie ad libitum Zugang zu Wasser und Standard-Mäusefutter. Für dieses Experiment wurden 25 männliche ICR-Mäuse (25-30 g, 8 Wochen alt) verwendet.
  2. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip entweder der Kontrollgruppe (n=12) oder der rmTBI-Gruppe (n=13) zu. Um mögliche Aggressionen von Scheinmäusen gegenüber Mäusen zu verhindern, die sich einem rmTBI unterzogen haben, trennen Sie sie in getrennte Käfige.
  3. Geben Sie den Mäusen mindestens 1 Woche Zeit, sich an ihre Käfigumgebung zu gewöhnen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Diese Eingewöhnungsphase stellt sicher, dass sich die Mäuse mit ihrer Umgebung vertraut machen und minimiert die potenziellen Auswirkungen von Stress oder Angst auf physiologische oder Verhaltensreaktionen während der Studie.

2. Vorbereitung des SHT-Geräts

  1. Herstellung des rmTBI-Modells an Mäusen mit einem modifizierten FPI-Gerät (siehe Materialtabelle; Abbildung 1A) 13. Überprüfen Sie vor der Verwendung des FPI-Geräts alle Anschlüsse sorgfältig auf Anzeichen von Leckagen oder Rissen und achten Sie dabei besonders auf die Verbindungsstellen zwischen Zylinder und Schlauch sowie zwischen dem Dreiwegeverbinder und dem Schlauch. Um den Aufpralldruck genau zu bestimmen, wurde ein Druckaufnehmer bis zum Aufprallpunkt an der Fluid-Perkussionsverletzungsvorrichtung13 installiert.
  2. Führen Sie eine sorgfältige Inspektion der FPI-Vorrichtung durch, um sicherzustellen, dass sich der Kolben reibungslos im Zylinder bewegt und dass Stöße effektiv durchgeführt werden können (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im System befinden. Wenn Luftblasen festgestellt werden, geben Sie vorsichtig destilliertes Wasser mit einer 50-ml-Spritze in das System und stoßen Sie die Luftblasen aus, indem Sie die Zylinderstange schnell durch einen nahe gelegenen 3-Wege-Anschluss und/oder durch die Spritze schieben.
    HINWEIS: Das FPI-System besteht aus destilliertem Wasser in der Flasche und den angeschlossenen Schläuchen. Es ist wichtig, das Gerät vor dem Betrieb zu kalibrieren, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

3. Vorbereitung des ausgedünnten Schädels

HINWEIS: Die Tieroperation und die Präparation des dünnen Schädels sollten nicht im Hinblick auf andere Mäuse durchgeführt werden. Das Fenster für den verdünnten Schädel ist nützlich für die Beurteilung von Hirngefäßschäden nach einem FPI-Verfahren.

  1. Halten Sie sich an die Anforderungen des Tierzentrums, indem Sie den Versuchsleiter anweisen, während aller Verfahren zum Umgang mit Tieren einen sterilen Kittel und eine sterile Maske zu tragen.
  2. Desinfizieren Sie die Labortischplatte, das FPI-Gerät, den Anästhesieschlauch und den angrenzenden Arbeitsbereich, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, mit einem 70%igen Ethanolspray.
  3. Wiegen Sie die Mäuse sowohl in der Schein- als auch in der rmTBI-Gruppe vor der Operation und vergleichen Sie ihre Gewichte mit denen, die 1 Woche vor dem Experiment aufgezeichnet wurden. Schließen Sie Mäuse aus der Studie aus, die einen schlechten Gesundheitszustand aufweisen, wie z. B. raues Fell, Durchfall, Gewichtsverlust oder Lethargie. Schließen Sie außerdem Mäuse mit einem Gewicht von weniger als 20 g aus, um sicherzustellen, dass sie wiederholte Stöße tolerieren können. Diese Maßnahmen sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Tierschutzes und die Gewährleistung zuverlässiger Versuchsergebnisse.
  4. Betäuben Sie Mäuse mit 4%-5% Isofluran (in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 L/min) für 3-4 min in einer Induktionskammer. Verabreichen Sie den Augen des Tieres ein ophthalmisches Gleitmittel (siehe Materialtabelle), um die Gleitfähigkeit während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten. Um die Schmerzen zu lindern, verabreichen Sie Buprenorphin subkutan (0,05 mg/kg) in der Mitte zwischen den Ohren 20 Minuten vor der Anästhesie und anschließend alle 6 Stunden für eine Dauer von 24 Stunden. Darüber hinaus ist am Ende der Anästhesie jedem Tier eine subkutane Einzeldosis von 5 mg/kg Carprofen zu verabreichen.
  5. Desinfizieren Sie den Kopf, nachdem die Maus ihre Aufricht- und Pedalentzugsreflexe verloren hat. Schneiden Sie das Fell am Kopf der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und entfernen Sie mit einem Rasierer das restliche Fell. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei aufeinanderfolgenden Anwendungen von 2 % Chlorhexidin, unterbrochen von 75 % Ethanol-Peelings.
  6. Legen Sie eine sterile Einweg-OP-Binde unter das Tier und die Umgebung, um die richtige Hygiene zu gewährleisten. Machen Sie mit einer feinen kleinen chirurgischen Schere einen 1,5 cm langen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut der Maus, um die Operationsstelle vollständig freizulegen (Abbildung 2A).
  7. Befestigen Sie die Maus mit nichtterminalen Ohrbügeln in einem herkömmlichen stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Position des Mauskopfes in einem stereotaktischen Rahmen auf eine flache Ebene oder einen leicht geneigten Winkel an, je nach dem spezifischen Zielbereich, der untersucht werden soll. Reinigen Sie das Operationsgebiet von Fell, um spätere Entzündungen zu vermeiden.
  8. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus mit einem herkömmlichen isothermen Heizkissen auf 37 °C (siehe Materialtabelle).
  9. Halten Sie während des Installationsprozesses der Operations- und Impact-Nabe (weiblicher Luer-Lock) die Mausanästhesie (ohne Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen oder des Schwanzes) mit einem Nasenkonus aufrecht, der eine kontinuierliche Isoflurankonzentration von 2 % liefert, die durch einen kalibrierten Verdampfer reguliert wird.
  10. Reinigen Sie den Operationsbereich um das Fenster des verdünnten Schädels vorsichtig mit einem sterilen, mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen.
  11. Mit einem Mikrobohrer mit flacher Spitze (siehe Materialtabelle, Abbildung 2B) und einer mikrochirurgischen Klinge wird im rechten frontalen motorischen Kortex ein Fenster mit verdünntem Schädel mit einem Durchmesser von ca. 2,5 mm und einer Dicke von 20 μm erstellt. Lokalisieren Sie das Operationsfeld 1,5 mm vor dem Bregma und 1,3-2,0 mm lateral der Mittellinie (Abbildung 2C).
    1. Um zu verhindern, dass der Mikrobohrer während der Erstellung des dünnen Schädelfensters in den Schädel eindringt, befeuchten Sie den Schädel intermittierend, während Sie mit dem Mikrobohrer schleifen.
    2. Bestätigen Sie die Dicke des Schädels, indem Sie den ausgedünnten Schädel vorsichtig mit der abgeflachten Spitze einer feinen Spritzennadel untersuchen und seine Weichheit beurteilen. Schätzen Sie die Klarheit der freiliegenden kortikalen Mikrogefäße visuell, um die Dicke des Schädels zu bestimmen.
    3. Um die Dicke des Schädels zu überprüfen, tragen Sie sterile Kochsalzlösung auf die verdünnte Stelle auf und untersuchen Sie sie visuell mit einem herkömmlichen Präpariermikroskop (siehe Materialtabelle). Diese Technik kann dazu beitragen, dass der Schädel ausreichend ausgedünnt wurde.
      HINWEIS: Schmieren Sie das Mausauge während der gesamten Vorbereitung des verdünnten Schädels und des rmTBI-Modellierungsverfahrens, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Ausdünnung des Schädels auf weniger als 15 μm birgt das Risiko eines leichten kortikalen Traumas, das zu einer leichten kortikalen Entzündung führen kann14.
  12. Befestigen Sie einen angepassten weiblichen Luer-Lock (2,2 mm Innendurchmesser, hergestellt aus einer 19G-Nadelnabe, wie in Abbildung 2D gezeigt) an der Stelle des ausgedünnten Schädels. Befestigen Sie den Luer-Lock mit Kleber und Zahnzement (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Wenn Sie Klebstoff verwenden, um den weiblichen Luer-Lock im Bereich um das Fenster mit verdünntem Schädel zu befestigen, ist es wichtig, den Schädelbereich gründlich zu trocknen und zu verhindern, dass der Klebstoff in das Fenster selbst eindringt. Klebstoff innerhalb des Fensters kann die Aufprallkraft des FPI deutlich reduzieren.

4. CHI-assoziiertes rmTBI-Modellierungsverfahren

  1. Führen Sie rmTBI unter Verwendung der lateralen Fluidperkussionsmethode mit einem modifizierten FPI-Gerät ein, wie zuvor beschrieben13,15.
  2. Nachdem Sie die Verfahren am dünnen Schädelfenster und an der Impaktnabe abgeschlossen haben, übertragen Sie die Maus von der stereotaktischen Apparatur auf die Impaktorplattform.
  3. Angesichts der möglichen Auswirkungen der Anästhesie auf die Zeit des Aufrichtreflexes der Tiere und die Schwere der Verletzungnach der Perkussion 9,16 ist die Anästhesietiefe zu überwachen, indem die Rückzugsreflexe des Lids und der Pfoten bewertet werden (Abbildung 2F).
  4. Verbinden Sie den weiblichen Luer-Lock, der auf das Fenster des verdünnten Schädels geklebt wurde, mit dem männlichen Luer-Lock am Ende des FPI-Geräteschlauchs (Abbildung 2G).
    HINWEIS: In der rmTBI-Modellierung wurde die Isofluran-induzierte Anästhesie bei Mäusen aufgrund der Induktion von Apnoe und Bewusstlosigkeit durch Perkussion verlängert.
  5. Führen Sie zwei leichte SHT (48-Stunden-Intervall) mit dem modifizierten Gerät ein. Wenden Sie den ersten FPI-Aufprall unmittelbar nach Abschluss der Operation am dünnen Schädelfenster und der Installation des Luer-Locks an. Verabreichen Sie den FPI-Aufprall erst, wenn die Maus jedes Mal die Rückkehr eines Entzugsreflexes zu einem Pfotenkneifen zeigt (Abbildung 2H). Die Anwendung eines FPI-Effekts bei tief anästhesierten Mäusen kann zu anhaltender Apnoe und zum Tod führen.
    1. Um den FPI-Aufprall aufzubringen, hebt man das Pendel auf den vorgesehenen Grad entlang des Winkelmessers an der Vorrichtung an und lässt das Pendel mit Hilfe der Softwaresteuerung13,15 los. Der Aufprall sollte eine Perkussionsintensität von 2,0 ± 0,1 atm erreichen, gemäß den etablierten Protokollen, die in Nagetierstudien verwendet werden 10,17,18. Tiere sind von weiteren Tests auszuschließen, wenn der Aufprall zwischen 1,9 und 2,1 atm nicht registriert wurde oder wenn während der FPI eine Schädelfraktur auftrat.
    2. Befestigen Sie die Scheinmäuse auf dem Gerät, aber geben Sie den Aufprall nicht ab.
  6. Nach dem Aufprall sofort den Luer-Lock-Anschluss lösen und die Mäuse zur Wiederherstellung auf ein isothermes Heizkissen übertragen. Nachdem die Maus wieder wach und bei Bewusstsein ist, bringen Sie sie in ihren Heimatkäfig zurück, ohne den weiblichen Luer-Lock zu entfernen. Verabreichen Sie den zweiten FPI-Aufprall auf die gleiche Weise 48 Stunden später.
  7. Entfernen Sie nach dem rmTBI vorsichtig den weiblichen Luer-Lock und den Zahnzement. Vernähen Sie die Kopfhaut mit Gewebekleber und kneifen Sie die Kopfhaut mit einer flachen Pinzette zusammen, um den Adhäsionsprozess zu erleichtern (siehe Materialtabelle; Abbildung 2I).
  8. Um Entzündungen und Infektionen vorzubeugen und postoperative Schmerzen und Beschwerden zu lindern, tragen Sie eine Mischung aus Erythromycin und Natriumdiclofenac-Salbe im Verhältnis 1:1 (siehe Materialtabelle) auf die Wunde auf. Übertragen Sie die Mäuse zur Wiederherstellung auf ein isothermes Heizkissen.
  9. Notieren Sie die Dauer des Aufrichtreflexes, der beginnt, wenn die Maus aus dem stereotaktischen Apparat genommen und seitlich auf die Impaktorplattform für FPI gelegt wird, und so lange andauert, bis die Maus selbstständig aufrecht stehen kann.
  10. Nachdem die Maus wieder wach und bewusst ist, bringe sie in ihren Heimatkäfig zurück. Mäuse sind in der Regel innerhalb von 1,5 Stunden nach der Verletzung bei vollem Bewusstsein und in der Lage, zu gehen.
  11. Beobachten Sie die Mäuse in den Tagen nach der SHT-Modellierung auf verschiedene Anzeichen, einschließlich Atemmuster, Vorhandensein von Schleim um Nase und Mund sowie Rötung, Schwellung, Exsudat oder Wiedereröffnung des Wundbereichs. Nehmen Sie Tiere mit einem oder mehreren der oben genannten abnormalen Symptome von der Studie aus.
    HINWEIS: Die Prä-Mikroinjektion von AAV-GCaMP6s ermöglicht die Beobachtung der zugrunde liegenden neuronalen Ca2+-Homöostase und Erregbarkeit im verletzten Kortex durch das Fenster des verdünnten Schädels unter Verwendung der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie15.

5. Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM)

HINWEIS: Das MWM (siehe Materialtabelle) ist eine weithin anerkannte Methode zur Bewertung des räumlichen Lernens und von Gedächtnisdefiziten bei Mäusen nach einem SHT.

  1. Führen Sie den MWM-Test ab 7 Tagen nach der Verletzung (DPI) durch. Das kreisförmige Becken der MWM hatte einen Durchmesser von 120 cm und eine Höhe von 50 cm, wobei die Wassertemperatur bei 25 °C gehalten wurde. Unterteilen Sie das kreisförmige Becken in vier Quadranten, wobei die Fluchtplattform, eine runde Plattform mit einem Durchmesser von 6 cm und einer Höhe von 30 cm, 1 cm unter der Wasseroberfläche im nordöstlichen Quadranten eingetaucht ist.
  2. Positionieren Sie eine Kamera direkt über dem kreisförmigen Pool, um die Bewegungsbahn der Mäuse aufzuzeichnen. Markieren Sie die Mäuse mit schwarzem Klebeband auf dem Rücken, um die Erkennung durch die Bilderfassungssoftware zu erleichtern und die Datenaufzeichnung zu ermöglichen, einschließlich der Latenz, der Schwimmstrecke und der Bewegungsbahn.
  3. Lege die Mäuse mit dem Gesicht zur Innenwand jedes der vier Quadranten ins Wasser, einmal für jeden Quadranten. Sobald die Mäuse die Plattform gefunden haben, lassen Sie sie dort 10 Sekunden lang ruhen. Wenn eine Maus die Plattform nicht innerhalb von 60 s findet, bitten Sie den Bediener, die Maus zur Plattform zu führen, sie 10 Sekunden lang auf der Plattform ruhen zu lassen und dann die Maus zur Ruhe in ihren Ausgangskäfig zurückzubringen.
  4. Wiederholen Sie für jede Maus den Akquisitionsversuch 4x täglich. Führen Sie nach den Erfassungsversuchen bei 12 DPI ein 60-Sekunden-Experiment mit räumlichen Sonden durch und zeichnen Sie auf, wie oft die Mäuse den ursprünglichen Plattformbereich überquert haben und wie lange die Maus in dem Quadranten verweilt, in dem sich die Plattform befand.
  5. Trocknen Sie die Mäuse nach jedem Versuch schnell mit einem Handtuch ab oder legen Sie sie unter eine Wärmelampe, um ihre Körpertemperatur zu halten und eine Unterkühlung während des 60-s-Erwerbsversuchs von DPI 7 bis DPI 11 zu verhindern.
  6. Nach Abschluss der oben beschriebenen experimentellen Verfahren werden die Mäuse mit Pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) bei 13 DPI anästhesiert. Isotonische Kochsalzlösung transkardial perfundieren, gefolgt von Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2). Entnahme des Gehirns für die konventionelle HE-Färbung zur Beurteilung grober kortikaler und hippokampaler Morphologieveränderungen. Eine detaillierte Beschreibung des HE-Färbeprotokolls findet sich in früheren Veröffentlichungen13,15.
  7. Nachdem alle Experimente abgeschlossen sind, wird die Maus durch Injektion einer Überdosis Pentobarbital (≥100 mg/kg, i.p.) eingeschläfert, wenn keine Mausproben benötigt werden. Vor der Entnahme von Gewebe oder der Entsorgung des Kadavers ist die Maus zu überwachen, bis mindestens 60 s lang kein Herzschlag mehr zu hören ist.

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Ergebnisse

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll skizziert eine Methode zur Induktion eines rmTBI durch ein dünnes Schädelfenster, das eine Lösung für die Hirnverletzung bietet, die durch die Vorbereitung der Kraniotomie während der konventionellen Perkussions-TBI-Modellierung verursacht wird. Durch die Verwendung dieses modifizierten Fluid-Perkussionsverfahrens mit der modifizierten Vorrichtung wurde eine verbesserte Präzision und Reproduzierbarkeit des FPI-Schlags erreicht13. Der modifizierte Impakto...

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Diskussion

SHT bezieht sich auf zwei Haupttypen, geschlossen und penetrierend, wobei letzterer durch eine Störung des Schädels und der Dura mater gekennzeichnet ist. Klinische Daten deuten darauf hin, dass CHIs häufiger vorkommen als penetrierende Verletzungen 1,2. Nach einem einzigen leichten SHT treten bei den meisten Patienten PCS-Symptome auf, die in der Regel in kurzer Zeit abklingen, und es gibt Kontroversen über den Anteil der Patienten, deren PCS sich zu Langzeitfol...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Key Social Development Foundation der Gemeinde Jinhua (Nr. 2020-3-071), dem Zhejiang College Student Innovation and Entrepreneurship Training Program (Nr.: S202310345087, S202310345088) und dem Zhejiang Provincial College Students' Science and Technology Innovation Activity Plan Project (2023R404044). Die Autoren danken Miss Emma Ouyang (Studentin im ersten Jahr an der Johns Hopkins University, Bachelor of Science, Baltimore, USA) für die sprachliche Bearbeitung des Artikels.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
75% Ethanol  Verifizierter Lieferant - Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd. 
BuprenorphinhydrochloridTianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., LtdH12020272Lösung, Analgetikum
CarprofenShanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd53716-49-7Pulver, Analgetikum
ChlorhexidindigluconatShanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.18472-51-019%-21% ige wässrige Lösung, antimikrobieller
Zahnzement- und LösungsmittelsatzShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.20220405, 3#Pulver in passendem Lösungsmittel rekonstituiert
PräpariermikroskopShenzhen RWD Life Science Inc.77019
Erythromycin Salbe Verifizierter Lieferant - Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.220412
Antibiotika-Faseroptik-KaltlichtquelleShenzhen RWD Life Science Inc.F-150C
Mikrobohrer mit flacher Spitze Shenzhen RWD Life Science Inc.HM310082 mm,
Stahl FPI GerätesoftwareJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Animal Brain Impaktor V1.0
ICR-MäuseJinhua Laboratory Animal Center   Bestand#202309125 männliche Mäuse, 25-30g, 8 Wochen alt
IsofluranShandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. 
Isothermes Heizkissen Verifizierter Lieferant - Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hupSonderanfertigung mit einer 19G-Nadelnabe
Mikro-Hand-SchädelbohrerShenzhen RWD Life Science Inc.78001Max: 38.000 U/min
Modifiziertes FPI-GerätJiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris WasserlabyrinthShenzhen RWD Life Science Inc.63031Auswertung der räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten von Mäusen
FreifeldShenzhen RWD Life Science Inc.63008Beurteilung der Locomoation und Angst der Maus
Ophthalmic Gleitmittel Verifizierter Lieferant - Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.
Natriumdiclofenac-Salbe Verifizierter Lieferant - Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.221207nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament
Anästhesiesystem für Kleintiere-Enhanced Shenzhen RWD Life Science Inc.R530IP
Intelligentes VideoverfolgungssystemPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, USAV3.0Tierverfolgung und -analyse
Stereotaktischer RahmenShenzhen RWD Life Science Inc.68043
Vetbond Tissue Adhesive3M, St Paul, MN, USA202402AXNaht die Tierwunde
Y LabyrinthShenzhen RWD Life Science Inc.63005Räumliches Arbeitsgedächtnis der Maus auswerten
2205022023090501SC230724B

Referenzen

  1. Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
  2. Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342(2023).
  3. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  4. Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
  5. Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
  6. Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  8. Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151(2021).
  9. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
  10. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  11. Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709(2023).
  12. Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
  13. Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
  14. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  15. Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
  16. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  17. Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290(2020).
  18. Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
  19. Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128(2017).
  20. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316(2023).
  21. Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
  22. Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
  23. Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847(2017).
  24. Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
  25. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  26. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
  27. Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
  28. Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196(2023).
  29. Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
  30. Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion
Posted by JoVE Editors on 6/04/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66440

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