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Methodenartikel

Nagetiermodell des volumetrischen Muskelverlusts von Masseter zur Untersuchung von Bioengineering-Materialien

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DOI:

10.3791/66450

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31. Mai 2024

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die chirurgische Erzeugung einer Verletzung des volumetrischen Muskelverlusts (VML) im Rattenmasseter, das ein reproduzierbares und zugängliches Modell für die Untersuchung von kraniofazialen Muskelverletzungen und deren Behandlung mit Biomaterialien wie dem neuartigen Hydrogel bietet.

Zusammenfassung

Kraniofazialer volumetrischer Muskelverlust (VML) kann als Folge eines schweren Traumas, einer chirurgischen Exzision, einer Entzündung und angeborener oder anderer erworbener Erkrankungen auftreten. Die Behandlung der kraniofazialen VML beinhaltet einen chirurgischen, funktionellen Muskeltransfer. Diese Verfahren sind jedoch nicht in der Lage, die normale Funktion, Empfindung oder den Ausdruck wiederherzustellen, und häufiger bleiben diese Erkrankungen unbehandelt. Es wurde nur sehr wenig über die Regeneration der Skelettmuskulatur in Tiermodellen der kraniofazialen VML geforscht. Dieses Manuskript beschreibt ein Rattenmodell zur Untersuchung kraniofazialer VML-Verletzungen und ein Protokoll zur histologischen Bewertung von Biomaterialien bei der Behandlung dieser Verletzungen. Flüssiges Hydrogel und gefriergetrocknete Gerüste werden zum Zeitpunkt der chirurgischen VML-Erstellung aufgetragen, und Kaugummis werden zu Endzeitpunkten von bis zu 12 Wochen mit hohen Retentionsraten und vernachlässigbaren Komplikationen exzidiert. Hämatoxylin und Eosin (HE), Massons Trichrom und immunhistochemische Analysen werden verwendet, um Parameter der Regeneration der Skelettmuskulatur sowie der Biokompatibilität und Immunmodulation zu bewerten. Während wir die Untersuchung eines Hydrogels auf Hyaluronsäurebasis demonstrieren, bietet dieses Modell ein Mittel zur Bewertung nachfolgender Iterationen von Materialien bei VML-Verletzungen.

Einleitung

Schwere Traumata, chirurgische Exzisionen, Entzündungen und andere erworbene Erkrankungen können zu einem Grad an Gewebeverlust führen, der die endogenen Reparaturmechanismen der Skelettmuskulatur überfordert. Der Verlust von residenten Zellen und Strukturen, die den primären Regenerationsprozess fördern, kann zu pathologischem Umbau und Gewebefibrose führen, was zu langfristigen Funktions- und Empfindungsdefiziten führt und als volumetrischer Muskelverlust (VML) bezeichnet wird1,2,3. Die Entzündungsreaktion auf VML-Verletzungen beinhaltet einen gut dokumentierten und komplexen Mechanismus, an dem Makrophagen, Zytokine und myogene Zellen beteiligt sind und der in der regenerativen Medizin viele theoretische Ziele darstellt4. Während viele In-vitro-Studien diese Ziele in Tiermodellen für die VML-Behandlung von Extremitäten verwendet haben, gibt es in Tiermodellen der kraniofazialen VML einen Mangel an Forschung zur Regeneration der Skelettmuskulatur 5,6,7.

Der Verlust von kraniofazialem Gewebe kann aus den zuvor beschriebenen Zuständen resultieren, und ein Mangel an kraniofazialem Gewebe kann auch bei angeborenen Erkrankungen wie Spalten auftreten, die in einigen Fällen einen echten volumetrischen Mangel an Muskelgewebe beinhalten 8,9. Da die Muskeln der kraniofazialen Region sowohl für die Funktion als auch für das ästhetische Erscheinungsbild wichtig sind, können Langzeitwirkungen von VML erhebliche psychische Beschwerden haben. Mehrere Aspekte des kraniofazialen Skelettmuskels unterscheiden sich von dem aus Somiten gewonnenen Skelettmuskel, der in den Extremitäten zu finden ist, einschließlich Variationen in der Genexpression, dem embryonalen Ursprung, dem Phänotyp der Satellitenzellen, der Menge der Satellitenzellen, der Faserzusammensetzung und der Architektur 10,11,12,13. Diese Schwankungen können dazu führen, dass VML-Verletzungen den kraniofazialen Muskel anders betreffen als den aus Somiten gewonnenen Muskel14,15. Bisher wurden Tissue-Engineering-Ansätze, die gezeigt haben, dass sie die Regeneration in Tiermodellen von VML der Extremitäten erhöhen, nicht äquivalent zu kraniofazialen VML-Tiermodellen übertragen16. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, in vivo Ansätze für kraniofaziale VML-Modelle an Tieren zu optimieren.

Obwohl mehrere in vivo-Studien zu kraniofazialer VML durchgeführt wurden, sind die Studien klein und die Schaffung eines robusten kraniofazialen Muskeldefekts in Tiermodellen stellt eine Herausforderung dar 8,13. Kim et al. berichteten über die Entwicklung eines Maus-Masseter-VML-Modells. In dieser Studie wurde die Histologie jedoch nur bis 28 Tage nach der Verletzung untersucht und es war unklar, Unterschiede in den histologischen Ergebnissen zwischen den Zeitpunktenzu erkennen 17. Rodriguez et al. berichteten über die Entwicklung eines kraniofazialen VML-Modells für Schafe. Sie berichteten jedoch über eine hohe Variabilität innerhalb der Versuchsgruppen, was auf eine Heterogenität in der Schwere der anfänglichen chirurgischen Verletzung hindeutet16. Hier berichten wir über das Protokoll unseres Rattenmasseter-VML-Modells und demonstrieren seinen Nutzen bei der Evaluierung von Tissue-Engineering-Ansätzen.

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Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit allen geltenden Vorschriften durchgeführt, einschließlich der Einhaltung der Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das UCSF Institutional Animal Care and Use Program genehmigte alle Tierverfahren und die postoperative Versorgung (IACUC-Protokoll #AN195944-01).

1. VML-Chirurgie

  1. Betäuben Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 12 Wochen mit einem Gewicht von 276-300 g in einem verschlossenen Behälter unter Isofluoran-Vollnarkose mit einer Rate von 1%-5%, bevor sie in ein steriles Operationsfeld überführt werden.
    1. Positionieren Sie die Nagetiere auf der linken Seite, so dass der Hals in eine neutrale Position gestreckt wird und die Nase in den Narkose-Nasenkonus eingepasst wird, so dass die rechte Gesichtshälfte freigelegt werden kann.
    2. Verjüngung des Isofluoranflusses von der Induktion bis zum Erhaltungsdurchfluss (ca. 2 %).
  2. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Nagetiere auf.
  3. Reinigen Sie die Operationsstelle, die durch eine Linie zwischen dem rechten Mundwinkel, dem Ansatz des rechten Ohrs oben und dem unteren Unterkieferwinkel begrenzt wird, mit Enthaarungscreme vom Fell.
    1. Desinfizieren Sie die Wirkstelle mehrmals in kreisenden Bewegungen mit Ethanol- und Betadin-Peeling.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird aufgrund der Größe und des Ortes des Zugangs keine sterile Abdeckung verwendet. Das Verfahren wird mit einer aseptischen Technik in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Tierhaltung durchgeführt.
  4. Erstellen Sie einen Längsschnitt von 3-4 cm Länge, der sich vom unteren rechten Schnurrhaarpolster bis zum rechten Ohr erstreckt.
    1. Heben Sie einen Hautlappen an, der die Visualisierung des rechten Kaumuskels sowie der bukkalen und unterkieferfarbenen Äste des Nervus facialis ermöglicht (Abbildung 1A).
    2. Befreien Sie die Haut durch stumpfe Trennung von der darunter liegenden Faszie und halten Sie die Hautränder mit chirurgischen Klemmen in einer eingezogenen Position, um den darunter liegenden Muskel optimal sichtbar zu machen.
  5. Machen Sie einen 1-2 cm langen Querschnitt in der Faszie, die über dem vorderen Teil des Kaumuskels liegt. Verwenden Sie eine stumpfe Trennung, um den Raum zwischen der Faszie und dem Kaumuskel zu erweitern, wobei darauf zu achten ist, dass die Gesamtintegrität der verbleibenden Faszie erhalten bleibt.
  6. Indem Sie den Faszienschnitt als Fenster zum oberflächlichen Kaumuskel verwenden, erzeugen Sie mit einer sterilisierten Einweg-Stanzbiopsie eine kreisförmige Verletzung im Muskel mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Tiefe von 5 mm. Stellen Sie sicher, dass der Defekt zwischen dem bukkalen und dem Unterkieferast des Gesichtsnervs zentriert ist, und achten Sie darauf, ein Trauma der Nerven zu vermeiden (Abbildung 1B).
  7. Fügen Sie das Biomaterial zur zirkulären Kaumuskelverletzung hinzu (Abbildung 1C).
  8. Sobald das Mittel an seinem Platz ist, vernähen Sie das muskelintensive Faszienfenster mit einer einzigen 5-0-Monofilamentnaht, um eine Migration zu vermeiden.
    HINWEIS: Feste Wirkstoffe werden direkt in die Wunde eingebracht, und das Gewebe kann gestört werden, um die Sättigung mit Blut zu fördern, während flüssige Mittel hinzugefügt und bei Bedarf gelotet oder sofort mit Faszien verschlossen werden, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden. In dem hier gezeigten Experiment wird ein auf acrylierter Hyaluronsäure basierendes Kryogel verabreicht.
  9. Verschließen Sie die Haut entweder mit einer einfachen unterbrochenen oder laufenden subkutikulären Technik mit 5-0 Monofilament.
    1. Tragen Sie Hautkleber auf die Nähte auf, um eine Dehiszenz des postoperativen Schnitts zu verhindern.
  10. Lassen Sie die Ratten sich in einem Käfig mit einer externen Heizquelle (Heizkissen unter dem Käfig oder sterile Handwärmer im Käfig) erholen und beobachten Sie sie 30 Minuten postoperativ.
  11. Verdünnen Sie das Trimethoprim-Sulfamethoxazol-Antibiotikum (200 mg Trimethoprim und 40 mg Sulfamethoxazol in 5 ml) in Trinkwasser (5 mL/200 mL Wasser) und verabreichen Sie es 7 Tage postoperativ in Nagetieren, die Wasser trinken. Stellen Sie sicher, dass die perioperative Analgesie gemäß den institutionellen Protokollen durchgeführt wird.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden 0,25 % SC Bupivacain vor dem chirurgischen Schnitt, 0,05 mg/kg SC Buprenorphin vor der Genesung von der Anästhesie und 2 mg/kg IP Meloxicam vor der Genesung von der Anästhesie und erneut am folgenden Morgen verabreicht.

2. Masseter-Ernte, Einfrieren und Analyse

  1. Zu vorgegebenen Zeitpunkten töten Sie die Ratten, indem Sie eine Überdosis eines chemischen Mittels (z. B. CO2 oder Anästhetikum) in der Anästhesie-Induktionskammer induzieren.
  2. Bestätigen Sie die Nagetiertötung, indem Sie eine bilaterale Thorakotomie mit einem einzigen Skalpellschnitt durch die 4. Rippe ventral durchführen, um die Lunge zu punktieren (bilaterale Thorakotomie).
  3. Öffnen Sie den chirurgischen Schnitt wieder, um die Visualisierung des Kaumuskels zu ermöglichen, und entfernen Sie die Haut über dem Kaumuskel, um den Zugang zu erleichtern.
  4. Präparieren und entfernen Sie den Kaumuskel vom Unterkiefer, beginnend mit der Trennung am Unterkieferwinkel. Stellen Sie sicher, dass die Dissektion entlang der Knochenoberfläche erfolgt, um die gesamte Dicke des Kaumuskels zu erfassen.
    1. Präparieren Sie nach vorne entlang des Unterkiefers und durchtrennen Sie den Ansatzpunkt der Sehne. Präparieren Sie dann entlang des Jochbogens nach hinten (Abbildung 1D). Zum Schluss sollten Sie den hinteren Ansatz präparieren, da dort ein erhöhtes Blutungsrisiko besteht.
  5. Spülen Sie den exzidierten Kaumuskel in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit, indem Sie die Probe gründlich mit einem Papiertuch abtupfen.
  6. Platzieren Sie den Muskel in einem Kryoformen und tauchen Sie ihn in Einbettungsmedien mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein, wobei das vordere Ende nach unten und das hintere Ende nach oben zeigt.
  7. Geben Sie Isopentan in einen Metallbecher und kühlen Sie ihn ab, indem Sie ihn vorsichtig in flüssigen Stickstoff tauchen, um zu verhindern, dass flüssiger Stickstoff in ihn eindringt.
    1. Sobald das Isopentan die optimale Temperatur (-140 bis -149 °C) erreicht und leicht eingedickt ist, halten Sie das Kryomold mit OCT und den Kaumuskel teilweise in das Isopentan getaucht, bis das OCT durchgefroren ist. Bewahren Sie die gefrorene Kryoform auf Trockeneis auf, bis sie bei -80 °C in einen Gefrierschrank umgefüllt wird.
  8. Kryosektion von gefrorenen Kauproben mit der Ausrichtung, dass der vordere Pol zuerst geschnitten wird und sich nach hinten durch die Probe bewegt. Stellen Sie die Temperatur des Gewebeblocks auf -20 °C und die Temperatur der Kryosektionsklinge auf -15 °C ein. Pro 200 μm werden 4 Objektträger (2 mit 10 μm-Schnitten, 2 mit 6 μm-Schnitten) geschnitten, bevor Sie 200 μm weiter bewegen, 4 zusätzliche Objektträger schneiden und den Vorgang in der gesamten Probe wiederholen.
  9. Verwenden Sie die 10-μm-Schnitte für die histologische Analyse (Masson-Trichrom, Hämatoxylin und Eosin, Picrosirius-Rot usw.) und die 6-μm-Schnitte für die Immunhistochemie.
    HINWEIS: Für die Histologie können auch 6-μm-Schnitte verwendet werden.
  10. Nehmen Sie Bilder mit Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie auf.
  11. Messen Sie die Querschnittsflächen von ~200 Muskelfasern des Kaumuskels mit der Image J-Software.

3. Immunhistochemische Analyse

  1. Für die immunhistochemische Analyse der embryonalen Myosin-Schwerkette fixieren Sie die Objektträger in 4 % PFA für 1 h bei RT.
  2. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT in PBS, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  3. Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger mit 0,5 % Triton X-100 bei RT für 15 min inkubieren.
  4. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT in PBS, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  5. Inkubieren Sie über Nacht mit primären monoklonalen Antikörpern von Wirtsmäusen (1:200) in 2 % normalem Ziegenserum (NGS) bei 4 °C.
  6. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT im PBS-Tween, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  7. Inkubieren Sie mit einem Fluorophor-markierten Anti-Maus-Sekundärantikörper aus dem Kaninchenwirt (1:500) in 2 % NGS bei RT für 2 h.
  8. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT im PBS-Tween, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  9. Montieren Sie die Objektträger mit 3 Tropfen DAPI-Leuchtstoffhalterung, bevor Sie ein Deckglas anbringen.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse für die Bewertung der kraniofazialen VML und der Geweberegeneration mit Biomaterialien umfassen sowohl quantitative als auch qualitative Ergebnisse.

Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für eine qualitative Bewertung unter Verwendung des zuvor beschriebenen Modells. Die Beobachtung des De-novo-Muskelfaserwachstums in unserem Hydrogel ist ein qualitativ positives Ergebnis (Abbildung 2A) und deutet darauf hin, dass ein...

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Diskussion

Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, bei denen besondere Aufmerksamkeit erforderlich ist, um ein optimales Ergebnis zu erzielen. Schritt 1.4 beschreibt den ersten Schnitt und die stumpfe Trennung der Haut von der oberflächlichen Kaufaszie. Die stumpfe Dissektion sollte direkt entlang der Haut mit einer Schere durchgeführt werden, die vom darunter liegenden Muskel und der Faszie weg zeigt, um ein Einkerben und unbeabsichtigtes Schaffen eines Fensters durch die Faszie zu verhin...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wird durch das UCSF Yearlong Research Fellowship Program und das C-Doctor Interdisciplinary Translational Project Program unterstützt. Vielen Dank an die Mitglieder des Pomerantz Lab and Craniofacial Biology Program an der University of California San Francisco für ihre Beiträge.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
F1.652 Myosin-schwerkettiger (embryonaler) monoklonaler AntikörperDSHBF1.652
Ziegen-Anti-Maus-IgG2b-kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Integra Standard-Biopsie-Stanzen, Einweg-Standard-Biopsie-Stanze; 5 mm, Durchmesser: 0,19 Zoll, 0,5 cmIntegra12460411
Eindeckmedium mit DAPI - wässrig, FluoroshieldAbcamab104139
Kaninchen Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 647) präadsorbiertesAbcamab150127
Sulfamethoxazol/Trimethoprim Suspension zum Einnehmen, Kirschgeschmack, 473 mLMed-Vet InternationalArtikelnummer: RXBAC-SUSP

Referenzen

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