Methodenartikel

Nagetiermodell des volumetrischen Muskelverlusts von Masseter zur Untersuchung von Bioengineering-Materialien

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DOI:

10.3791/66450

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31. Mai 2024

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die chirurgische Erzeugung einer Verletzung des volumetrischen Muskelverlusts (VML) im Rattenmasseter, das ein reproduzierbares und zugängliches Modell für die Untersuchung von kraniofazialen Muskelverletzungen und deren Behandlung mit Biomaterialien wie dem neuartigen Hydrogel bietet.

Zusammenfassung

Kraniofazialer volumetrischer Muskelverlust (VML) kann als Folge eines schweren Traumas, einer chirurgischen Exzision, einer Entzündung und angeborener oder anderer erworbener Erkrankungen auftreten. Die Behandlung der kraniofazialen VML beinhaltet einen chirurgischen, funktionellen Muskeltransfer. Diese Verfahren sind jedoch nicht in der Lage, die normale Funktion, Empfindung oder den Ausdruck wiederherzustellen, und häufiger bleiben diese Erkrankungen unbehandelt. Es wurde nur sehr wenig über die Regeneration der Skelettmuskulatur in Tiermodellen der kraniofazialen VML geforscht. Dieses Manuskript beschreibt ein Rattenmodell zur Untersuchung kraniofazialer VML-Verletzungen und ein Protokoll zur histologischen Bewertung von Biomaterialien bei der Behandlung dieser Verletzungen. Flüssiges Hydrogel und gefriergetrocknete Gerüste werden zum Zeitpunkt der chirurgischen VML-Erstellung aufgetragen, und Kaugummis werden zu Endzeitpunkten von bis zu 12 Wochen mit hohen Retentionsraten und vernachlässigbaren Komplikationen exzidiert. Hämatoxylin und Eosin (HE), Massons Trichrom und immunhistochemische Analysen werden verwendet, um Parameter der Regeneration der Skelettmuskulatur sowie der Biokompatibilität und Immunmodulation zu bewerten. Während wir die Untersuchung eines Hydrogels auf Hyaluronsäurebasis demonstrieren, bietet dieses Modell ein Mittel zur Bewertung nachfolgender Iterationen von Materialien bei VML-Verletzungen.

Einleitung

Schwere Traumata, chirurgische Exzisionen, Entzündungen und andere erworbene Erkrankungen können zu einem Grad an Gewebeverlust führen, der die endogenen Reparaturmechanismen der Skelettmuskulatur überfordert. Der Verlust von residenten Zellen und Strukturen, die den primären Regenerationsprozess fördern, kann zu pathologischem Umbau und Gewebefibrose führen, was zu langfristigen Funktions- und Empfindungsdefiziten führt und als volumetrischer Muskelverlust (VML) bezeichnet wird1,2,3. Die Entzündungsreaktion auf VML-Verletzungen beinhaltet einen gut dokumentierten und komplexen Mechanismus, an dem Makrophagen, Zytokine und myogene Zellen beteiligt sind und der in der regenerativen Medizin viele theoretische Ziele darstellt4. Während viele In-vitro-Studien diese Ziele in Tiermodellen für die VML-Behandlung von Extremitäten verwendet haben, gibt es in Tiermodellen der kraniofazialen VML einen Mangel an Forschung zur Regeneration der Skelettmuskulatur 5,6,7.

Der Verlust von kraniofazialem Gewebe kann aus den zuvor beschriebenen Zuständen resultieren, und ein Mangel an kraniofazialem Gewebe kann auch bei angeborenen Erkrankungen wie Spalten auftreten, die in einigen Fällen einen echten volumetrischen Mangel an Muskelgewebe beinhalten 8,9. Da die Muskeln der kraniofazialen Region sowohl für die Funktion als auch für das ästhetische Erscheinungsbild wichtig sind, können Langzeitwirkungen von VML erhebliche psychische Beschwerden haben. Mehrere Aspekte des kraniofazialen Skelettmuskels unterscheiden sich von dem aus Somiten gewonnenen Skelettmuskel, der in den Extremitäten zu finden ist, einschließlich Variationen in der Genexpression, dem embryonalen Ursprung, dem Phänotyp der Satellitenzellen, der Menge der Satellitenzellen, der Faserzusammensetzung und der Architektur 10,11,12,13. Diese Schwankungen können dazu führen, dass VML-Verletzungen den kraniofazialen Muskel anders betreffen als den aus Somiten gewonnenen Muskel14,15. Bisher wurden Tissue-Engineering-Ansätze, die gezeigt haben, dass sie die Regeneration in Tiermodellen von VML der Extremitäten erhöhen, nicht äquivalent zu kraniofazialen VML-Tiermodellen übertragen16. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, in vivo Ansätze für kraniofaziale VML-Modelle an Tieren zu optimieren.

Obwohl mehrere in vivo-Studien zu kraniofazialer VML durchgeführt wurden, sind die Studien klein und die Schaffung eines robusten kraniofazialen Muskeldefekts in Tiermodellen stellt eine Herausforderung dar 8,13. Kim et al. berichteten über die Entwicklung eines Maus-Masseter-VML-Modells. In dieser Studie wurde die Histologie jedoch nur bis 28 Tage nach der Verletzung untersucht und es war unklar, Unterschiede in den histologischen Ergebnissen zwischen den Zeitpunktenzu erkennen 17. Rodriguez et al. berichteten über die Entwicklung eines kraniofazialen VML-Modells für Schafe. Sie berichteten jedoch über eine hohe Variabilität innerhalb der Versuchsgruppen, was auf eine Heterogenität in der Schwere der anfänglichen chirurgischen Verletzung hindeutet16. Hier berichten wir über das Protokoll unseres Rattenmasseter-VML-Modells und demonstrieren seinen Nutzen bei der Evaluierung von Tissue-Engineering-Ansätzen.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit allen geltenden Vorschriften durchgeführt, einschließlich der Einhaltung der Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das UCSF Institutional Animal Care and Use Program genehmigte alle Tierverfahren und die postoperative Versorgung (IACUC-Protokoll #AN195944-01).

1. VML-Chirurgie

  1. Betäuben Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 12 Wochen mit einem Gewicht von 276-300 g in einem verschlossenen Behälter unter Isofluoran-Vollnarkose mit einer Rate von 1%-5%, bevor sie in ein steriles Operationsfeld überführt werden.
    1. Positionieren Sie die Nagetiere auf der linken Seite, so dass der Hals in eine neutrale Position gestreckt wird und die Nase in den Narkose-Nasenkonus eingepasst wird, so dass die rechte Gesichtshälfte freigelegt werden kann.
    2. Verjüngung des Isofluoranflusses von der Induktion bis zum Erhaltungsdurchfluss (ca. 2 %).
  2. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Nagetiere auf.
  3. Reinigen Sie die Operationsstelle, die durch eine Linie zwischen dem rechten Mundwinkel, dem Ansatz des rechten Ohrs oben und dem unteren Unterkieferwinkel begrenzt wird, mit Enthaarungscreme vom Fell.
    1. Desinfizieren Sie die Wirkstelle mehrmals in kreisenden Bewegungen mit Ethanol- und Betadin-Peeling.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird aufgrund der Größe und des Ortes des Zugangs keine sterile Abdeckung verwendet. Das Verfahren wird mit einer aseptischen Technik in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Tierhaltung durchgeführt.
  4. Erstellen Sie einen Längsschnitt von 3-4 cm Länge, der sich vom unteren rechten Schnurrhaarpolster bis zum rechten Ohr erstreckt.
    1. Heben Sie einen Hautlappen an, der die Visualisierung des rechten Kaumuskels sowie der bukkalen und unterkieferfarbenen Äste des Nervus facialis ermöglicht (Abbildung 1A).
    2. Befreien Sie die Haut durch stumpfe Trennung von der darunter liegenden Faszie und halten Sie die Hautränder mit chirurgischen Klemmen in einer eingezogenen Position, um den darunter liegenden Muskel optimal sichtbar zu machen.
  5. Machen Sie einen 1-2 cm langen Querschnitt in der Faszie, die über dem vorderen Teil des Kaumuskels liegt. Verwenden Sie eine stumpfe Trennung, um den Raum zwischen der Faszie und dem Kaumuskel zu erweitern, wobei darauf zu achten ist, dass die Gesamtintegrität der verbleibenden Faszie erhalten bleibt.
  6. Indem Sie den Faszienschnitt als Fenster zum oberflächlichen Kaumuskel verwenden, erzeugen Sie mit einer sterilisierten Einweg-Stanzbiopsie eine kreisförmige Verletzung im Muskel mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Tiefe von 5 mm. Stellen Sie sicher, dass der Defekt zwischen dem bukkalen und dem Unterkieferast des Gesichtsnervs zentriert ist, und achten Sie darauf, ein Trauma der Nerven zu vermeiden (Abbildung 1B).
  7. Fügen Sie das Biomaterial zur zirkulären Kaumuskelverletzung hinzu (Abbildung 1C).
  8. Sobald das Mittel an seinem Platz ist, vernähen Sie das muskelintensive Faszienfenster mit einer einzigen 5-0-Monofilamentnaht, um eine Migration zu vermeiden.
    HINWEIS: Feste Wirkstoffe werden direkt in die Wunde eingebracht, und das Gewebe kann gestört werden, um die Sättigung mit Blut zu fördern, während flüssige Mittel hinzugefügt und bei Bedarf gelotet oder sofort mit Faszien verschlossen werden, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden. In dem hier gezeigten Experiment wird ein auf acrylierter Hyaluronsäure basierendes Kryogel verabreicht.
  9. Verschließen Sie die Haut entweder mit einer einfachen unterbrochenen oder laufenden subkutikulären Technik mit 5-0 Monofilament.
    1. Tragen Sie Hautkleber auf die Nähte auf, um eine Dehiszenz des postoperativen Schnitts zu verhindern.
  10. Lassen Sie die Ratten sich in einem Käfig mit einer externen Heizquelle (Heizkissen unter dem Käfig oder sterile Handwärmer im Käfig) erholen und beobachten Sie sie 30 Minuten postoperativ.
  11. Verdünnen Sie das Trimethoprim-Sulfamethoxazol-Antibiotikum (200 mg Trimethoprim und 40 mg Sulfamethoxazol in 5 ml) in Trinkwasser (5 mL/200 mL Wasser) und verabreichen Sie es 7 Tage postoperativ in Nagetieren, die Wasser trinken. Stellen Sie sicher, dass die perioperative Analgesie gemäß den institutionellen Protokollen durchgeführt wird.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden 0,25 % SC Bupivacain vor dem chirurgischen Schnitt, 0,05 mg/kg SC Buprenorphin vor der Genesung von der Anästhesie und 2 mg/kg IP Meloxicam vor der Genesung von der Anästhesie und erneut am folgenden Morgen verabreicht.

2. Masseter-Ernte, Einfrieren und Analyse

  1. Zu vorgegebenen Zeitpunkten töten Sie die Ratten, indem Sie eine Überdosis eines chemischen Mittels (z. B. CO2 oder Anästhetikum) in der Anästhesie-Induktionskammer induzieren.
  2. Bestätigen Sie die Nagetiertötung, indem Sie eine bilaterale Thorakotomie mit einem einzigen Skalpellschnitt durch die 4. Rippe ventral durchführen, um die Lunge zu punktieren (bilaterale Thorakotomie).
  3. Öffnen Sie den chirurgischen Schnitt wieder, um die Visualisierung des Kaumuskels zu ermöglichen, und entfernen Sie die Haut über dem Kaumuskel, um den Zugang zu erleichtern.
  4. Präparieren und entfernen Sie den Kaumuskel vom Unterkiefer, beginnend mit der Trennung am Unterkieferwinkel. Stellen Sie sicher, dass die Dissektion entlang der Knochenoberfläche erfolgt, um die gesamte Dicke des Kaumuskels zu erfassen.
    1. Präparieren Sie nach vorne entlang des Unterkiefers und durchtrennen Sie den Ansatzpunkt der Sehne. Präparieren Sie dann entlang des Jochbogens nach hinten (Abbildung 1D). Zum Schluss sollten Sie den hinteren Ansatz präparieren, da dort ein erhöhtes Blutungsrisiko besteht.
  5. Spülen Sie den exzidierten Kaumuskel in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT) und entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit, indem Sie die Probe gründlich mit einem Papiertuch abtupfen.
  6. Platzieren Sie den Muskel in einem Kryoformen und tauchen Sie ihn in Einbettungsmedien mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein, wobei das vordere Ende nach unten und das hintere Ende nach oben zeigt.
  7. Geben Sie Isopentan in einen Metallbecher und kühlen Sie ihn ab, indem Sie ihn vorsichtig in flüssigen Stickstoff tauchen, um zu verhindern, dass flüssiger Stickstoff in ihn eindringt.
    1. Sobald das Isopentan die optimale Temperatur (-140 bis -149 °C) erreicht und leicht eingedickt ist, halten Sie das Kryomold mit OCT und den Kaumuskel teilweise in das Isopentan getaucht, bis das OCT durchgefroren ist. Bewahren Sie die gefrorene Kryoform auf Trockeneis auf, bis sie bei -80 °C in einen Gefrierschrank umgefüllt wird.
  8. Kryosektion von gefrorenen Kauproben mit der Ausrichtung, dass der vordere Pol zuerst geschnitten wird und sich nach hinten durch die Probe bewegt. Stellen Sie die Temperatur des Gewebeblocks auf -20 °C und die Temperatur der Kryosektionsklinge auf -15 °C ein. Pro 200 μm werden 4 Objektträger (2 mit 10 μm-Schnitten, 2 mit 6 μm-Schnitten) geschnitten, bevor Sie 200 μm weiter bewegen, 4 zusätzliche Objektträger schneiden und den Vorgang in der gesamten Probe wiederholen.
  9. Verwenden Sie die 10-μm-Schnitte für die histologische Analyse (Masson-Trichrom, Hämatoxylin und Eosin, Picrosirius-Rot usw.) und die 6-μm-Schnitte für die Immunhistochemie.
    HINWEIS: Für die Histologie können auch 6-μm-Schnitte verwendet werden.
  10. Nehmen Sie Bilder mit Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie auf.
  11. Messen Sie die Querschnittsflächen von ~200 Muskelfasern des Kaumuskels mit der Image J-Software.

3. Immunhistochemische Analyse

  1. Für die immunhistochemische Analyse der embryonalen Myosin-Schwerkette fixieren Sie die Objektträger in 4 % PFA für 1 h bei RT.
  2. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT in PBS, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  3. Permeabilisieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger mit 0,5 % Triton X-100 bei RT für 15 min inkubieren.
  4. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT in PBS, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  5. Inkubieren Sie über Nacht mit primären monoklonalen Antikörpern von Wirtsmäusen (1:200) in 2 % normalem Ziegenserum (NGS) bei 4 °C.
  6. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT im PBS-Tween, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  7. Inkubieren Sie mit einem Fluorophor-markierten Anti-Maus-Sekundärantikörper aus dem Kaninchenwirt (1:500) in 2 % NGS bei RT für 2 h.
  8. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal bei RT im PBS-Tween, wobei Sie jede Wäsche 10 Minuten ruhen lassen.
  9. Montieren Sie die Objektträger mit 3 Tropfen DAPI-Leuchtstoffhalterung, bevor Sie ein Deckglas anbringen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse für die Bewertung der kraniofazialen VML und der Geweberegeneration mit Biomaterialien umfassen sowohl quantitative als auch qualitative Ergebnisse.

Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für eine qualitative Bewertung unter Verwendung des zuvor beschriebenen Modells. Die Beobachtung des De-novo-Muskelfaserwachstums in unserem Hydrogel ist ein qualitativ positives Ergebnis (Abbildung 2A) und deutet darauf hin, dass ein Biomaterial eine ausreichende architektonische Unterstützung und Wachstumsfaktor- oder Nährstoffzufuhr bieten kann. Die Retention des Hydrogels im Wundbett (Abbildung 2B) ist auf dem HE-Fleck sichtbar. Eine qualitative Bewertung anderer Gewebe innerhalb eines Biomaterials kann durchgeführt werden, wie z. B. die Identifizierung von Blutgefäßen mit HE (Abbildung 2C) und Massons Trichrom (Abbildung 2D). Die Unterkiefer- und bukkalen Äste des Gesichtsnervs sind in der oberen linken und oberen rechten Ecke des Bildes in Abbildung 2B zu sehen, was die korrekte Platzierung des Hydrogels im VML-Verletzungsbett bestätigt und die Orientierung ermöglicht. Über dem Hydrogel ist eine Faszienschicht zu sehen, die bestätigt, dass der Faszienverschluss erfolgreich war und während der postoperativen Phase intakt blieb. Ein negatives Ergebnis, das in diesem Stadium beobachtet wird, wäre der vollständige Verlust des Hydrogels (Abbildung 2E) oder der Verlust des faszialen Verschlusses und der Extrusion aus dem Wundbett (Abbildung 2F), wobei HE je nach verstrichener Zeit postoperativ Hinweise auf ein Wundbett oder eine fibrotische Narbe zeigt.

Die immunhistochemische Analyse ist entscheidend für die Bewertung von Biomaterialien für die Behandlung von kraniofazialer VML, um Zelltypen und molekulare Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu identifizieren. Da VML zum Verlust von residenten Zellen und Architekturen führt, die in der Lage sind, die Skelettmuskulatur zu regenerieren, ist die De-novo-Muskelregeneration an der verletzten Stelle ein wichtiges Ergebnis bei der Behandlung4 und der Bewertung der Wirksamkeit bei biomaterialbasierten Therapien für VML. Entwicklungsisoformen von Myosin, einschließlich embryonalem (MYH3) und neonatalem Myosin (MYH8), werden in regenerierenden Skelettmuskelfasern reexprimiert und stellen einen spezifischen Marker für die Regeneration von Fasern dar18,19. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel dafür, wie die Immunhistochemie zur Identifizierung von zellulären Typen von Interesse verwendet werden kann, in diesem Fall der embryonalen Myosin-Schwerkette.

Schließlich kann ImageJ zur Quantifizierung von Merkmalen von histologischen Objektträgern verwendet werden, einschließlich Immunhistochemie und spezieller Färbungen wie Massons Trichrom, um die fibrotische Reaktion zu messen (Abbildung 4). Die Entfernung eines Teils des Muskels bei VML-Verletzungen verändert die Muskelarchitektur und -zusammensetzung, was zu einer erhöhten Kollagen-I-Ablagerung und einer Fibrose des groben Kompartimentgewebes führt 2,3. Viele Studien, in denen biomaterialbasierte Behandlungen für VML untersucht werden, vergleichen die Fibrose zwischen ihrer Interventionsgruppe und der Kontrollgruppe4. Mit der hier beschriebenen Methode können die Wundbetten bei Tieren, die eine VML-Verletzung erlitten haben, am Masson-Trichrom als fibrotische Narben identifiziert werden (Abbildung 4A). Die Farbentfaltung durch ImageJ kann den blauen Kanal, der dem Bindegewebe entspricht, isolieren und quantifizieren (Abbildung 4B) und dann für die Messung auf Graustufen einstellen (Abbildung 4C). Der Bereich der Narbe kann mit Bild J (Abbildung 4D) isoliert und vermessen und auf einen Maßstabsbalken auf dem Bild kalibriert werden, um eine genaue Größe und einen reproduzierbaren Bereich zu gewährleisten. Mit diesem Ansatz kann die Bindegewebsablagerung gemessen werden (Abbildung 4E).

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Abbildung 1: Chirurgisches Schema zur Veranschaulichung der Schritte. (A,B) Chirurgische VML-Verletzung des Kaumuskels. (C) Anwendung von Biomaterialien. (D) Masseter-Ernte. (E) Muskelmorphologie nach der Entnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: HE- und Masson-Trichrom-Färbung. (A) HE-gefärbte Ratten-Kaumuskelschnitte von der Hydrogel-Muskel-Grenzfläche mit Pfeilen, die Strukturen anzeigen, die morphologisch als Skelettmuskelfasern identifiziert wurden. (B) HE-gefärbter Ratten-Kaumuskelschnitt, der die Häufigkeit von Skelettmuskelfasern im gesamten Hydrogel zeigt. (C) HE-gefärbtes und (D) Masson-Trichrom-gefärbtes Gewebe mit Pfeilen, die Strukturen anzeigen, die morphologisch als Blutgefäße identifiziert wurden. (E,F) Negative Ergebnisse, die einen vollständigen Verlust des Hydrogels mit einem Gel zeigen, das an der oberflächlichen Seite des Kaumuskels und nicht am Wundbett haftet, bzw. einen unvollständigen Verlust des Hydrogels mit Verlust des Faszienverschlusses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immunhistologische Färbung auf embryonale Myosin-Schwerkette (eMHC) und Laminin auf Ratten-Kauter-Querschnitten. (A) 2 Wochen nach der Operation. (B) 12 Wochen nach der Operation. Eine erhöhte Konzentration von eMHC ist in der 12-wöchigen Probe im Vergleich zur 2-wöchigen Probe zu beobachten. Bilder, die mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Quantitative Fibroseanalyse. (A) Massons Trichrom-gefärbter Ratten-Kauschnitt zur Quantifizierung der Bindegewebsablagerung als Proxy für die Wundfibrose nach VML-Verletzung nach 12 Wochen. (B) Bild J wurde verwendet, um den blauen Kanal zu dekonvolutieren, der dem Bindegewebe entspricht. (C) Das Bild wurde für die Analyse in Graustufen konvertiert. (D) Die Fläche, die der fibrotischen Narbe entspricht, wurde isoliert, und (E) die Querschnittsfläche und die Prozentsätze des Feldes, die Weiß (Hintergrund) und Schwarz (Bindegewebe) entsprechen, wurden berechnet. Bilder, die mit Lichtmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, bei denen besondere Aufmerksamkeit erforderlich ist, um ein optimales Ergebnis zu erzielen. Schritt 1.4 beschreibt den ersten Schnitt und die stumpfe Trennung der Haut von der oberflächlichen Kaufaszie. Die stumpfe Dissektion sollte direkt entlang der Haut mit einer Schere durchgeführt werden, die vom darunter liegenden Muskel und der Faszie weg zeigt, um ein Einkerben und unbeabsichtigtes Schaffen eines Fensters durch die Faszie zu verhindern. Der kaudale Aspekt des oberflächlichen Kaumuskels sollte vermieden werden, um eine unbeabsichtigte Verletzung der Vena submandibularis oder der Arteria carotis externa zu vermeiden. Schritt 1.5 und 1.6 beschreiben die Entstehung des Faszienfensters bzw. des VML-Defekts. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Faszienschnitt die minimale Größe hat, die für die Stanzbiopsie erforderlich ist, da die Faszie dazu neigt, sich vom Schnitt weg zusammenzuziehen, und es schwierig sein kann, die Kanten in Schritt 1.8 zu lokalisieren, wenn ein zu großer Schnitt gemacht wird. Auch hier sollte eine stumpfe Dissektion unter der Faszie nur so weit durchgeführt werden, dass die Stanzbiopsie in das Fenster passt und entsprechend abgewinkelt wird, um senkrecht zum Unterkiefer zu stehen. Bei der Entstehung der VML-Verletzung ist es wichtig, den größten Bereich zwischen dem Unterkiefer- und dem bukkalen Ast des Gesichtsnervs zu identifizieren. Der distale Nervus mandibularis teilt sich in eine obere und eine untere Abteilung, und es gibt Unterschiede in der Stelle, an der sich die obere Abteilung von der unteren Abteilung weg zum bukkalen Ast des Nervus facialis verzweigt. Da diese Teilung überlegen verläuft, kann es bei einigen Tieren vorkommen, dass die obere Teilung des N. mandibularis direkt im Bauch des Kaumuskels liegt, wo der Defekt entstehen sollte. In diesen Fällen sollte das Tier nicht für die Analyse verwendet werden, da wahrscheinlich eine periphere Nervenverletzung vorliegt, die die Daten verfälscht. Bei der Erstellung der Stanzbiopsie kann ein sanftes Verdrehen erforderlich sein, um die volle Tiefe von 5 mm zu durchdringen. Schritt 2.4 beschreibt das Abtupfen der Gewebeprobe nach dem Waschen, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Dies geschieht, um die Bildung von Eiskristallen während des Einfrierens des Gewebes und die anschließende Verringerung der Gefrierartefakte in der Histologiezu verhindern 20.

Einer der Vorteile dieser Methode ist der leichte Zugang zum oberflächlichen Kaumuskel und das relative Fehlen von Hochrisikostrukturen, die während der Operation auftreten können. Da das Gefäßsystem in das kaudale Ende des Muskels eintritt, können signifikante Blutungen in den meisten Fällen vermieden werden. Dies ist wichtig, da es nicht nur das Morbiditätsrisiko senkt, sondern auch die Standardisierung erhöht und die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die Ischämie einen verwirrenden Effekt auf die Muskelregeneration hat. Aufgrund der Verfügbarkeit eines faszialen Gehäuses kann dieses Protokoll zur Bewertung von Biomaterialien in flüssigen oder festen Formfaktoren verwendet werden. Während ein azelluläres Hydrogel als Beispiel für dieses Protokoll verwendet wurde, kann diese Methode repliziert werden, um Biomaterialien mit humanem Stammzelleinbau an immundefizienten Ratten zu testen, wie dies in früheren Studien an VML21 der Extremitäten geschehen ist.

Diese Studie definiert die kritische Größenverletzung bei VML nicht formell, der genaue Punkt, an dem endogene Reparaturmechanismen den Muskel nicht mehr regenerieren können, bleibt unklar. Es liegt zwar auf der Hand, dass die Definition die Entfernung eines bestimmten Prozentsatzes des Muskelvolumens beinhalten kann, und tatsächlich werden oft 20 % genannt, aber es gibt widersprüchliche Beweise, und die Daten deuten darauf hin, dass andere Faktoren, einschließlich des Ortes und der Geometrie der Verletzung, des Alters des Tieres und anderer Faktoren, ebenfalls dazu beitragen können 16,21,22,23. Trotzdem zeigt die Beobachtung einer fibrösen Narbe und einer sichtbaren Kontraktion der Muskelgrenze, die 12 Wochen nach der Verletzung beobachtet wurde (Abbildung 4A), dass ein pathologischer Umbau stattgefunden hat, was stark darauf hindeutet, dass die hier verwendeten Verletzungen in Bezug auf die Standarddefinition von kritischer Größe sind.

Da die kraniofazialen Muskeln des Menschen, wie die intrinsischen Handmuskeln, im Vergleich zu den proximalen Gliedmaßenmuskeln klein sind und präzisere Bewegungen ausführen, sind sie anfälliger dafür, dass ihre Funktion durch VML beeinträchtigt wird. Der Kaumuskel wurde in diesem Protokoll aufgrund des ausreichenden Volumens für die Tests und des einfachen Zugangs ausgewählt. Die Geometrie und der Ort der Verletzung sind jedoch wichtige Faktoren bei der Bewertung der VML, und die mit diesem Modell gezogenen Schlussfolgerungen lassen sich möglicherweise nicht direkt auf andere kraniofaziale Muskeln übertragen. Der Kaumuskel ist ein Kaumuskel, und während er bei Kindern zum Gesichtsausdruck beiträgt24, nimmt seine Rolle im Gesichtsausdruck im Erwachsenenalter ab24. Verletzungen anderer Muskeln des Gesichts, wie z. B. des Zygomaticus major, können zu größeren psychischen Beschwerden nach VML führen, da sie im Vergleich zum Kaumuskel eine direktere Rolle im Gesichtsausdruck während des gesamten Lebens spielen2 5,26. Darüber hinaus wurde in dieser Studie die In-vivo-Kraftproduktion nicht untersucht, eine Einschränkung, die in diesem Bereich erforderlich ist. Bisher wurde über keine reproduzierbare Methode zur Funktionstestung der kraniofazialen Muskeln mit ausreichender Sensitivität zum Vergleich von Behandlungsgruppen berichtet, und dies wird durch die ausgedehnten kompensatorischen Muskeln im Gesicht erschwert. Zukünftige Entwicklungen dieses Protokolls zielen darauf ab, Ansätze zur direkten Messung der Kraft in einzelnen Gesichtsmuskeln einzuführen.

Alternative Methoden zur histologischen Analyse der Masseter-VML im Nagetiermodell sind sehr begrenzt. Kim et al. entwickelten ein tragbares EMG-System, um die Funktionalität von VML-verletzten Kaumuskeln bei Mäusen zu bewerten. Ihr Endpunkt betrug jedoch 4 Wochen, sie zeigten nicht die Visualisierung von Biomaterial in histologischen Bildern, beschrieben keinen Faszienverschluss und konzentrierten sich hauptsächlich auf die Validierung ihres EMG-Systems im Vergleich zur Analyse der Muskelregeneration und Biokompatibilität von Biomaterial-basierten Behandlungen17. Neue Behandlungen für den kraniofazialen volumetrischen Muskelverlust sind erforderlich, und dieses Masseur-VML-Modell ist ausreichend reproduzierbar, um die Muskelreaktion auf VML-Verletzungen zu beurteilen und die Auswirkungen von Behandlungen auf Regeneration, Fibrose und Kontraktur zu bewerten, insbesondere in den ersten 3 Monaten nach der Verletzung.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wird durch das UCSF Yearlong Research Fellowship Program und das C-Doctor Interdisciplinary Translational Project Program unterstützt. Vielen Dank an die Mitglieder des Pomerantz Lab and Craniofacial Biology Program an der University of California San Francisco für ihre Beiträge.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
F1.652 Myosin-schwerkettiger (embryonaler) monoklonaler AntikörperDSHBF1.652
Ziegen-Anti-Maus-IgG2b-kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Integra Standard-Biopsie-Stanzen, Einweg-Standard-Biopsie-Stanze; 5 mm, Durchmesser: 0,19 Zoll, 0,5 cmIntegra12460411
Eindeckmedium mit DAPI - wässrig, FluoroshieldAbcamab104139
Kaninchen Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 647) präadsorbiertesAbcamab150127
Sulfamethoxazol/Trimethoprim Suspension zum Einnehmen, Kirschgeschmack, 473 mLMed-Vet InternationalArtikelnummer: RXBAC-SUSP

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Nagetiermodell des volumetrischen Muskelverlusts von Masseter zur Untersuchung von Bioengineering-Materialien
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