Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir das Bildgebungsprotokoll zur Beobachtung biomolekularer Wechselwirkungen mit photothermischem Off-Resonance-Klopfen (PORT), bei dem wir Bildgebungsparameter optimiert, Systemgrenzen identifiziert und potenzielle Verbesserungen bei der Bildgebung von Drei-Punkt-Stern-DNA-Motiven untersucht haben.

Zusammenfassung

Die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM) ist ein beliebtes molekulares Bildgebungsverfahren zur Visualisierung biologischer Prozesse von Einzelmolekülen in Echtzeit, da es unter physiologischen Bedingungen in flüssigen Umgebungen abgebildet werden kann. Der photothermische Off-Resonance-Tapping-Modus (PORT) verwendet einen Antriebslaser, um den Ausleger kontrolliert zu oszillieren. Diese direkte Cantilever-Betätigung ist im MHz-Bereich wirksam. In Kombination mit der Steuerung der Rückkopplungsschleife auf der Kraftkurve im Zeitbereich und nicht auf der Resonanzamplitude ermöglicht PORT eine Hochgeschwindigkeitsbildgebung mit bis zu zehn Bildern pro Sekunde mit direkter Kontrolle über die Tip-Sample-Kräfte. Es hat sich gezeigt, dass PORT die Abbildung empfindlicher Assemblierungsdynamiken und die präzise Überwachung von Mustern, die von Biomolekülen gebildet werden, ermöglicht. Bisher wurde die Technik für eine Vielzahl dynamischer In-vitro-Studien verwendet, einschließlich der in dieser Arbeit gezeigten Assemblierungsmuster des DNA-3-Punkt-Stern-Motivs. Durch eine Reihe von Experimenten identifiziert dieses Protokoll systematisch die optimalen Einstellungen der Bildgebungsparameter und die ultimativen Grenzen des HS-PORT AFM-Bildgebungssystems und wie sie die biomolekularen Assemblierungsprozesse beeinflussen. Darüber hinaus untersucht es mögliche unerwünschte thermische Effekte, die durch den Antriebslaser auf die Probe und die umgebende Flüssigkeit induziert werden, insbesondere wenn das Scannen auf kleine Bereiche beschränkt ist. Diese Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse, die die Weiterentwicklung der Anwendung des PORT-Modus bei der Untersuchung komplexer biologischer Systeme vorantreiben werden.

Einleitung

Die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM) ist ein schnell wachsendes bildgebendes Verfahren 1,2,3,4. Es arbeitet mit Geschwindigkeiten, die es Forschern ermöglichen, biomolekulare Wechselwirkungen in Echtzeit zu visualisieren 5,6,7,8,9. Das photothermische Off-Resonance-Tapping (PORT) ist ein Off-Resonance-Bildgebungsmodus, der dem Spitzenkraft-Tapping^10,11, dem Puls-Force-Modus^12,13 oder dem Sprungmodus¹⁴ ähnelt. Anstatt den Scanner jedoch vertikal zu oszillieren, oszilliert PORT vertikal nur den Ausleger durch einen Anregungslaser, der auf den Ausleger fokussiert ist (normalerweise in der Nähe des Klemmpunkts). Der Cantilever verformt sich aufgrund des Bimorph-Effekts: Ein leistungsmodulierter Anregungslaser erhitzt periodisch den beschichteten Cantilever, der sich aufgrund der unterschiedlichen Wärmeausdehnungskoeffizienten des Cantilevers und der Beschichtungsmaterialien¹⁵ biegt. Die Cantilever- und Probenerwärmung kann minimiert werden, indem ein Antriebslaser verwendet wird, der während jedes Oszillationszyklus periodisch aus- und wieder eingeschaltet wird, anstatt ein vollständig sinusförmiger Antrieb⁵ zu verwenden.

DNA wird seit einigen Jahren verwendet, um biologisch relevante, strukturell interessante und biochemisch nützliche Motive zu bilden 16,17,18,19,20. Darüber hinaus haben sich DNA-Strukturen als ideal geeignet erwiesen, um die Bildqualität von AFM²¹ zu charakterisieren und den Tip-Effekt von Hochgeschwindigkeits-AFM²² zu bewerten. Drei-Punkt-Sterne (3PS) der DNA mit stumpfen Enden wurden als programmierbares Modellsystem zur Untersuchung der supramolekularen Organisation ähnlich strukturierter Moleküle in ansonsten komplexen biologischen Systemen praktisch¹⁹. Bisher wurde die Selbstorganisation von Gittern, die aus stumpfen trimeren DNA-Monomeren gebildet werden, mit HS-AFM²³ verfolgt. Schließlich organisieren sich diese in großen Netzwerken mit hexagonaler Ordnung. Hier wird die Selbstorganisation von DNA-3-Punkt-Sternen¹⁹ mit der PORT-Technik bei Scangeschwindigkeiten abgebildet, die schnell genug sind, um die Selbstorganisation und ihre Korrekturmechanismen²⁴ zu verfolgen und gleichzeitig eine minimale Unterbrechung des Prozesses oder Probenschäden zu gewährleisten. Wie bei jedem HS-AFM-Modus gibt es einen Kompromiss zwischen der erreichbaren Bildqualität, der Bildgeschwindigkeit und der unerwünschten Störung der Probe. Durch die Wahl des richtigen Kompromisses kann man die Selbstorganisationsmuster supramolekularer Anordnungen besser verstehen. Dieses Protokoll wird daher einen ähnlichen Aufbau mit DNA 3PS als Modellsystem verwenden, um die für PORT spezifischen Parameter zu optimieren. Dies ermöglicht den Betrieb mit hohen Bildgebungsgeschwindigkeiten bei ausreichend großen Scangrößen bei gleichzeitiger Minimierung von Probenschäden.

Protokoll

1. Probe und Puffer

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete DNA-Kachel ist das 3-Punkt-Stern-Motiv, das im Mao-Labor an der Purdue University entwickelt wurde^19,25. Alle Oligonukleotide, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Integrated DNA Technologies, Inc. erworben. Sammeln Sie die erforderlichen Materialien und Reagenzien.

1. Mischen Sie die einzelsträngigen DNAs (ssDNAs) in einem molaren Verhältnis von 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM für S2 und 1,8 μM für S3) im Annealing-Puffer (5 mM TRIS, 1 mM EDTA und 10 mM_{MgAc 2}). Die Endkonzentration des DNA-Motivs muss 0,6 μM betragen (49 ng/μL, wobei das Molekulargewicht von 3PS 82020,3 g/mol beträgt).
2. Geben Sie die DNA-Lösung in ein hitzebeständiges Gefäß und erhitzen Sie es auf 80 °C. Die DNA-Lösung wird 4 h lang langsam von 80 °C auf 20 °C abgekühlt. Dieser Annealing-Prozess hilft den ssDNA-Oligonukleotiden, das gewünschte doppelsträngige DNA-Motiv zu bilden.
3. Laden Sie zur Reinigung die getemperte DNA-Lösung auf ein 3%iges Agarosegel, um die überschüssigen ssDNAs und alle unerwünschten Nebenprodukte zu entfernen. Das 3%ige Gel bei 60 V für ca. 2,5 h in einem Laufpuffer mit 0,5x Tris-Borat-EDTA (TBE) und 10 mM Mg(CH₃COO)₂ laufen lassen.
4. Identifizieren und lokalisieren Sie die Bande auf dem Gel, die das DNA-Motiv enthält. Stellen Sie sicher, dass das Band basierend auf seiner Größe an eine bestimmte Position migriert wurde.
5. Schneiden Sie die Bande mit dem DNA-Motiv vorsichtig aus dem Gel heraus. Extrahieren Sie das DNA-Motiv aus dem exzidierten Gelfragment, indem Sie es in eine Gelextraktions-Spin-Säule geben und 10 Minuten lang bei 3.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
6. Ersetzen Sie den Puffer im extrahierten DNA-Motiv mit einem Zentrifugalkonzentrator durch den Annealing-Puffer. Zentrifugieren Sie bei 3000 x g bei Raumtemperatur (oder niedriger), bis die konzentrierte Lösung weniger als 100 μl beträgt. Fügen Sie dann 300 μl Glühpuffer hinzu und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um sicherzustellen, dass der Puffer ausgetauscht wird.
7. Verdünnen Sie das DNA-Motiv zu Bildgebungszwecken auf 6 nM. Verwenden Sie ein Spektralphotometer oder andere geeignete Methoden, um die Konzentration genau zu bestimmen und einzustellen. Das DNA-Motiv ist nun bereit für die Bildgebung.
   HINWEIS: Alle Puffer im Protokoll haben einen pH-Wert von 8,0. Die Sequenzinformationen für die drei jeweiligen Banden lauten wie folgt:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Wachstum der freitragenden Spitze

1. Auslegermontage am REM-Auslegerhalter: Stellen Sie sicher, dass die Ausleger sauber und frei von Verunreinigungen sind. Montieren Sie die Ausleger auf eine geeignete Halterung, die mit dem REM-System kompatibel ist. Das maßgefertigte Design des Auslegerhalters kann auf Anfrage geteilt werden.
2. Gasinjektion: Erhitzen Sie das Vorläufergas (z. B. Phenanthren C₁₄H₁₀ Vorläufer für amorphe Kohlenstoffspitzen), das für das Gasinjektionssystem verwendet werden soll, um die neue Spitze wachsen zu lassen. Sobald das Vakuum unter ^10-5 mbar liegt, spülen Sie die Gaseinspritzleitung 10 Mal für 2 s, um sicherzustellen, dass sich keine unerwünschten Luftreste in der Düsenleitung befinden (dies muss bei geschlossenem Ventil zur Pistolenkammer erfolgen).
3. Einstellung der Spitzenposition: Verwenden Sie die Rasterelektronenmikroskopie (REM), um das Ende des Auslegers zu lokalisieren. Kippen Sie den Auslegerhalter in einen Winkel (z. B. 11° in diesem Fall), der dem Winkel entspricht, den der Ausleger aufweist, wenn er auf dem AFM-Auslegerhalter in Bezug auf die Oberfläche platziert wird, sodass die gewachsene Spitze während der Bildgebung senkrecht zur Oberfläche steht. Passen Sie die Position und den Fokus des REM an, um eine klare Sicht auf die Spitze des Cantilevers zu erhalten, an der eine scharfe Kohlenstoff-Nanospitze gezüchtet wird.
4. Fokussierte elektronenstrahlinduzierte Abscheidung (FEBID):
   1. Stellen Sie die Abscheidungsparameter in der ausgewählten Software (in diesem Fall SmartFIB) ein, z. B. Strahlstrom (I) und Beschleunigungsspannung (V), Arbeitsabstand (WD), Vergrößerung, belichtete Form, Dosis-/Abscheidungszeit und Verweilzeit. Die folgenden Parameter wurden verwendet, um amorphe Kohlenstoffspitzen zu züchten, die gute mechanische Eigenschaften für die AFM-Bildgebung aufweisen, was zu Längen um 130 nm und Radien im Bereich von 2-4 nm führt:
      Spot/Punkt als freiliegende Form auswählen
      WD = 5 mm
      I = 78 pA und V = 5 kV
      Verweilzeit = 1 μs
      Dosis = 0,05 nC und Abscheidezeit = 0,64 s
      Vergrößerung = 20000x
   2. Beginnen Sie den Abscheidungsprozess, um die Spitze wachsen zu lassen, indem Sie den Elektronenstrahl an einer Stelle auf die Cantilever-Spitze bestrahlen, während gleichzeitig das Vorläufergas injiziert wird, wodurch das Gas geschlossen wird, wenn die Abscheidung abgeschlossen ist. In diesem Fall führt die SmartFIB-Software dies nach dem Einrichten des oben erwähnten Rezepts automatisch durch.
5. Analyse nach dem Wachstum: Führen Sie eine REM-Bildgebung nach dem Wachstum durch, um die neu gewachsene Spitze zu untersuchen und ihre Qualität und Eigenschaften (Spitzenradius und -länge) sicherzustellen. Warten Sie 1-2 Minuten nach dem Spitzenwachstum, um sicherzustellen, dass das gesamte Vorläufergas abgepumpt wird, um eine erneute Ablagerung während der REM-Bildgebung zu vermeiden. Entfernen Sie den Probenhalter aus der REM-Kammer.
6. Cantilever-Recycling: Falls im REM-System auch ein kombinierter fokussierter Ionenstrahl (FIB) installiert ist, entfernen Sie eine beschädigte oder verschmutzte, zuvor gewachsene Spitze, indem Sie sie mit dem FIB-System unter Verwendung niedriger FIB-Ströme (z. B. 1 pA, um Cantilever-Schäden zu vermeiden) fräsen. Führen Sie das Entfernen der Spitze durch, indem Sie vom Ende der Spitze bis zur Basis in Querschnittsform fräsen, um ein Zusammenklappen der Spitze zu vermeiden. So kann ein neuer nachwachsen.

3. HS-AFM-Hardware

1. Der Bildgebungsaufbau besteht aus dem speziell angefertigten PORT-Kopf^{5, 26} (Figur 1A), dem Hochgeschwindigkeitsscanner²⁶ mit einer Probenscheibe mit Glimmer darauf, dem kompatiblen Controller²⁷, dem Hochspannungsverstärker mit der hohen Bandbreite, die für die Hochgeschwindigkeitsbildgebung erforderlich ist, der AFM-Basis und dem PC mit der erforderlichen Software zur Steuerung der zuvor erwähnten Ausrüstung²⁷.
   HINWEIS: In diesem Fall handelt es sich um Open-Source-Komponenten, für die Pläne beim Labor für Bio- und Nanoinstrumente der EPFL^{27, 28} erhältlich sind. Es ist auch möglich, an Workshops zum Bau des PORT-Kopfes und der Steuerung²⁹ teilzunehmen sowie die LabView-basierte Software herunterzuladen und zu verwenden.
2. Platzieren Sie mit einer Pinzette vorsichtig einen ultrakurzen Ausleger (z. B. AC10DS oder gleichwertig) unter der Federklammer am Auslegerhalter. Stellen Sie sicher, dass der Cantilever-Chip fest und stabil ist.
3. Geben Sie 50 μl Flüssigkeit mit einer Spritze durch die linke Flüssigkeitszugangsöffnung, wie in Abbildung 1B gezeigt. Richten Sie bei ausgeschaltetem Anregungslaser den Ausleselaser mit den drei entsprechenden Knöpfen am AFM-Kopf aus, die in Abbildung 1A gezeigt sind. Beobachten Sie dazu den Schatten des Auslegers auf einem weißen Papier, während Sie die Summe maximieren (Schattenmethode). Zentrieren Sie dann den Laserpunkt mit den beiden dafür vorgesehenen Knöpfen auf der Fotodiode.
4. Schalten Sie den Antriebslaser ein und richten Sie ihn aus, indem Sie das Kontrollkästchen "Excitation Enable" in "Excitation VI" aktivieren, sodass er den Ausleger betätigt und oszilliert. Zeigen Sie das Cantilever-Anregungssignal und das Cantilever-Ablenksignal auf einem angeschlossenen Oszilloskop an. Wenn die Ablenkschwingung zu gering (oder nicht vorhanden) ist, kann es sein, dass der Antriebslaser sehr weit vom Ausleger entfernt ist. Verwenden Sie in diesem Fall die Schattenmethode und schalten Sie den Ablenkungslaser aus, um die Ausrichtung zu erleichtern. Maximieren Sie die Schwingungsamplitude mit den Einstellknöpfen des Antriebslasers, die in Abbildung 1A gezeigt sind.
5. Um die Cantilever-Schwingungsamplitude in PORT einzustellen, geben Sie in der entsprechenden Steuerung der Software die Spitze-Spitze-Spannung ein, die an den Steuerkreis der Laserdiode gesendet wird (von nun an Spitze-Spitze-AC-Eingang) in Anregung VI. Um die Laserdiode im Leitungsbereich zu halten und somit zu lasern, fügen Sie der Steuerschaltung der Laserdiode eine Gleichspannung hinzu (ab sofort DC-Offset-Eingang), was ebenfalls über eine Konfigurationsbox in Excitation VI erfolgt. Beides wirkt sich auch auf die Laserleistung aus, die mit einem Laserleistungsmesser gemessen werden kann und zur Abstimmung der Auslegerschwingungsamplitude verwendet wird.
6. Bestimmen Sie die maximale photothermische Anregungsfrequenz, die an den Ausleger angelegt werden kann, die unter der Resonanzfrequenz des Auslegers liegen muss. Bestimmen Sie die Resonanzfrequenz durch eine thermische Abstimmung oder einen Frequenzdurchlauf. Die in dieser Studie verwendeten Ausleger (AC10DS), deren Resonanzfrequenz in Flüssigkeiten bei etwa 400 kHz (1 MHz in Luft)³⁰ liegt, haben einen quasistatischen Biegebereich unterhalb von 300 kHz⁵. Daher müssen PORT-Frequenzen unterhalb dieser Grenze (ca. 100-200 kHz) verwendet werden.
7. Passen Sie die Bildgebungsparameter und Einstellungen für die PORT-Rate und die Scan-Rate auf die erforderlichen Werte in den Anregungs- bzw. Scan-Vis-Werten an (die in diesem Artikel verwendeten Parameter sind in den Abbildungsbeschreibungen angegeben). Sobald die Setup- und Bildgebungsparameter konfiguriert sind, führen Sie die erforderlichen Bildgebungsexperimente durch, um die molekularen Wechselwirkungen zu beobachten und zu verfolgen.
   HINWEIS: Da AC10DS-Ausleger nicht mehr verkauft werden, muss möglicherweise eine Alternative wie Fastscan D oder BioLever³¹ verwendet werden, bis ein Äquivalent verfügbar ist.

4. Ermitteln der richtigen Wechselwirkungskurven

1. Nähern Sie sich zunächst der Probenoberfläche im Kontaktmodus, indem Sie auf dem Z-Controller-VI, das auf Kontaktmodus eingestellt ist, auf Start klicken.
   1. In diesem Modus kommt die AFM-Spitze in direkten Kontakt mit der Probe. Sobald die Oberfläche erreicht ist, führen Sie in Rampe VI eine Kraft-Abstand-Kurve durch, um die Kalibrierung der Auslenkungsempfindlichkeit zu erhalten.
   2. Schätzen Sie außerdem die Cantilever-Federkonstante, entweder aus den Spezifikationen des Cantilever-Anbieters (weniger genau), die mit einem Interferometer erhalten wurden, oder durch eine auf thermischer Abstimmung basierende Kalibrierung nach der Kalibrierung der Ablenkempfindlichkeit. Eine präzise Cantilever-Kalibrierung ist für eine genaue Kraftregelung der Spitze und Probe unerlässlich.
2. Nachdem Sie den Z-Piezo vollständig von der Oberfläche zurückgezogen haben, an der die Spitze die Oberfläche nicht erreichen kann, indem Sie im Z-Controller-VI auf "Up " geklickt haben, wechseln Sie in den PORT-Modus im Z-Controller-VI und aktivieren Sie den Anregungslaser im Kontrollkästchen "Anregungs-VI". Stellen Sie zunächst den PORT-Modus mit einem AC10DS-Ausleger so ein, dass er mit der gewünschten Frequenz in Anregung VI arbeitet, die in diesem experimentellen Fall 100 kHz beträgt.
3. Nehmen Sie die freitragende Schwingung nah auf, ohne jedoch die Oberfläche zu berühren. Schalten Sie dann das Feedback im Z-Controller in Kontakt mit der Oberfläche ein, um aufzunehmen, und klicken Sie auf Korrigieren , um die Schwingung des Cantilevers zu erhalten, wenn der Cantilever intermittierend mit der Oberfläche in Kontakt kommt, beides in Nanometern. Subtrahieren Sie die freie Schwingungskurve von der intermittierenden Kontaktkurve, um die wahre Wechselwirkungskurve zu erhalten, und wandeln Sie sie mit der Cantilever-Federkonstante (in diesem Fall 0,1 N/m) in pN um.

5. HS-AFM-Bildgebung

1. Bereiten Sie eine Lösung von Mg(CH₃COO)₂ in einer Konzentration von 10 mM vor. Mit einer Hamilton-Spritze werden 50 μl der vorbereiteten 10 mM Mg(CH₃COO)_2-Lösung in den Fluidikkanal des Cantilever-Halters injiziert, wodurch ein Flüssigkeitstropfen entsteht, der den Ausleger umschließt.
2. Nähern Sie sich dem Ausleger allmählich der Fläche, indem Sie auf dem Z-Controller VI auf Start klicken. Sobald die Oberfläche erkannt wurde, schalten Sie das Feedback ein und suchen Sie den Spitzenwert der Wechselwirkungskurve in den ORT-Kraftkurven VI. Finden Sie den niedrigsten Kraftsollwert, der eine korrekte Nachführung ermöglicht (unter 300 pN, um die Beschädigung empfindlicher Bioproben zu vermeiden).
3. Legen Sie die Scangröße im Scan-VI auf 800 nm x 800 nm und die Zeilenrate auf 100 Hz fest. Scannen Sie die Oberfläche, indem Sie in Scan VI auf den Pfeil Frame (nach unten) klicken, um die Oberflächenqualität zu überprüfen. Wenn Verunreinigungen festgestellt werden, beheben Sie das Problem, indem Sie die Oberfläche, den Ausleger und/oder den Auslegerhalter reinigen, bevor Sie fortfahren.
4. Ziehen Sie nach dem Scannen den Ausleger von der Oberfläche zurück, indem Sie im Z-Controller-VI auf Zurückziehen klicken. Entfernen Sie die Pufferlösung mit einer Hamilton-Spritze aus dem Loch im Auslegerhalter, um Probleme mit dem Totvolumen zu vermeiden.
5. Bereiten Sie eine verdünnte DNA-3PS-Lösung aus Teil 1 des Protokolls vor. Injizieren Sie 50 μl der verdünnten DNA-3PS-Lösung in den dafür vorgesehenen Kanal des Cantilever-Halters.
6. Starten Sie den Imaging-Prozess, indem Sie die Schritte 5.2 bis 5.3 wiederholen und einen Bereich von 800 nm x 800 nm mit einer Standardzeilenrate von 100 Hz (256 Zeilen × 256 Pixel) scannen. Passen Sie nach dem ersten Scan die Bildgröße und -geschwindigkeit in Scan VI für die weitere Datenerfassung auf die angegebenen Werte an.
7. Halten Sie den Eingangskraft-Sollwert der Tip-Sample-Wechselwirkung im Feld Z Controller VI Setpoint während des gesamten Bildgebungsprozesses auf dem niedrigsten Niveau, das für eine ordnungsgemäße Abführung erforderlich ist (unter 300 pN), um Probenbeschädigungen/-störungen zu minimieren, sofern nicht anders angegeben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle erforderlichen Probenbereiche.

6. Bildbearbeitung

1. Richten Sie die Umgebung für die Ausführung des angepassten Pygwy-Batchverarbeitungscodes (Python für Gwyddion) ein, und stellen Sie sicher, dass Python und alle erforderlichen Bibliotheken vorhanden sind. Weitere Informationen finden Sie auf der Website von Gwyddion.³² sind ordnungsgemäß auf dem System installiert. Dadurch wird sichergestellt, dass der Code reibungslos läuft und auf die erforderlichen Funktionalitäten zugreifen kann.
2. Öffnen Sie den angepassten Pygwy-Batch-Verarbeitungscode (auf Anfrage verfügbar). Dadurch erhalten Sie Zugang zu den Werkzeugen und Funktionen, die für die Bildverarbeitung und -analyse benötigt werden.
3. Beginnen Sie die Bildverarbeitung, indem Sie die horizontale Mittellinienkorrektur an den Bildern durchführen. Dieser Schritt zielt darauf ab, Unregelmäßigkeiten oder Artefakte in den Scanlinien zu beseitigen und sicherzustellen, dass nachfolgende Verarbeitungsschritte auf genauen Daten basieren. Wenden Sie nach dem Entfernen des Flugzeughintergrunds die Linienkorrektur an. Verwenden Sie die Narbenentfernung, um die Bilder weiter zu verbessern, indem Sie unerwünschte Flecken oder Unvollkommenheiten entfernen, die durch äußere Faktoren verursacht wurden. Dieser Schritt verbessert das visuelle Erscheinungsbild der Bilder.
4. Verbessern Sie die Sichtbarkeit und den Kontrast der Bilder, indem Sie die Farbhöhenkarte anpassen. Dadurch wird sichergestellt, dass interessante Merkmale klar visualisiert werden und sich in den Bildern abheben.
5. Wählen Sie die verarbeiteten Bilder aus, die zu einem Video kombiniert werden sollen. Bestimmen Sie die gewünschte Bildrate für das Video. Stellen Sie in diesem Fall die Geschwindigkeit auf 7 Bilder pro Sekunde (fps) ein.
6. Berechnen Sie die Dauer jedes Frames. Verwenden Sie Fiji (ImageJ), um die bearbeiteten Bilder zu einem Video zusammenzufassen. Stellen Sie sicher, dass die Bildrate und die Bilddauer korrekt eingestellt sind.

Ergebnisse

In dieser Untersuchung wurde der dynamische Assemblierungsprozess von DNA-3-Punkt-Stern-Motiven zu stabilen Inseln unter Ausnutzung der Fähigkeiten des HS-PORT AFM erfolgreich beobachtet. Diese Technik ermöglichte es uns, den Zusammenbau dieser Strukturen in Echtzeit zu erfassen. In Abbildung 2A,B erhalten wir eine klare Bildabtastung bei 100 Hz bzw. 200 Hz Zeilenraten für eine PORT-Rate von 100 kHz (800 nm x 800 nm Scangröße). Dies entspricht 3,9 bzw. 1,95 Oszillationszyklen pro Pixel. Die Bildgebung mit höheren Geschwindigkeiten ohne gleichzeitige Erhöhung der PORT-Rate, die mindestens einen Oszillationszyklus pro Pixel ermöglichen würde, wird die Bildqualität jedoch drastisch reduzieren, wie in Abbildung 2C zu sehen ist (0,78 eines Oszillationszyklus pro Pixel). Die Abbildungsgeschwindigkeit wird durch die Geschwindigkeit begrenzt, mit der der Cantilever-Abtaster die Oberfläche mit geeigneter Spitzen-Abtast-Kraftregelung abtastet, da die Rate der Topographieänderung zu schnell wird, um sie mit der Oberflächenabtastrate zu verfolgen.

Neben der Einstellung einer ausreichend hohen PORT-Rate ist es wichtig, dass die PORT-Kurven die Informationen enthalten, die zur Steuerung der Kräfte erforderlich sind. Insbesondere der hydrodynamische Widerstand und die geringe Detektionsbandbreite können die aufgebrachte Kraft verschleiern. Abbildung 3 zeigt die Auslenkung des Cantilevers in unterschiedlichen Abständen von der Oberfläche der Probe und die Anregungsfrequenzraten unter Verwendung eines Durchschnitts von 4096 Kurven, um das Rauschen zu reduzieren. Die blauen Kurven in Abbildung 3A (für 100 kHz PORT-Rate) und Abbildung 3D (für 500 Hz PORT-Rate) stellen die Cantilever-Bewegung dar, wenn der Cantilever weit von der Oberfläche entfernt ist und frei oszilliert (ohne die Oberfläche während eines Oszillationszyklus zu berühren). Die roten Kurven zeigen die Auslenkung des Auslegers, wenn der Ausleger nahe der Oberfläche schwingt und intermittierend die Oberfläche berührt, um die Probe zu untersuchen. Um die wahre Wechselwirkungskurve und damit die Tip-Sample-Wechselwirkung zu erhalten, subtrahieren wir die blaue Kurve von der roten Kurve, um jeweils Abbildung 3B,E zu erhalten. Ein Beispiel für eine klare Wechselwirkungskurve, die für die zerstörungsfreie Bildgebung von Bioproben erforderlich ist, ist in Abbildung 3B dargestellt. Diese Konfiguration führt zu der guten Bildqualität in Abbildung 3C, wo die PORT-Rate 100 kHz beträgt. Wenn wir die Anregungsfrequenz in der Nähe der Cantilever-Resonanz erhöhen, verschlechtert sich die Rückkopplungsregelung irgendwann, selbst wenn der Cantilever-Generator eine ausreichende Amplitudenschwingung aufweist, um sich nach Erhöhung der Anregungslaserleistung von der Oberfläche zu lösen (Abbildung 3E). Liegt die PORT-Frequenz zu nahe an der Cantilever-Resonanzfrequenz, begrenzt die Cantilever-Resonanz das Zeitverhalten der Cantilever-Dynamik. Die Auslegerbiegung stellt daher die Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe nicht mehr genau dar, und die Wechselwirkungskurve, die wir erhalten, ist verdeckt. Dies führt zu einer Verschlechterung der Bildqualität, wie in Abbildung 3F dargestellt.

Eine beeinträchtigte Wechselwirkungskurve bei höheren PORT-Frequenzen könnte auch aufgrund der verringerten Betätigungseffizienz bei höheren Frequenzen³³ auftreten, die derzeit einer der limitierenden Faktoren kommerzieller Hochgeschwindigkeits-AFM-Ausleger ist. Diese Abnahme erreicht schließlich einen Schwellenwert im Roll-off, bei dem eine ordnungsgemäße Abbildung behindert wird: Die Schwingungsamplitude kann nicht ausreichen, um sich von der Oberfläche zu lösen, und die Spitze ist immer in Kontakt, wodurch die Probenstrukturen beschädigt werden. Um der Abnahme der Amplitude entgegenzuwirken, die bei höheren PORT-Raten verursacht wird, haben wir eine Erhöhung der Laserleistung untersucht. Wir haben einen PORT-Kopf verwendet, der höhere Laserleistungen erreichen kann, um diesen Effekt besser beobachten zu können. Die Laserleistung des Anregungslasers, die wir mit einem Leistungsmesser gemessen haben, wurde in die DC- und AC-Komponenten aufgeteilt. Die Gesamtleistung wird gesteuert, indem in der Software die Spitze-Spitze-Spannung (Spitze-Spitze-AC-Eingang) und die Gleichspannung (DC-Offset-Eingang) eingestellt werden, die an den Steuerkreis der Laserdiode gesendet wird. Abbildung 4A zeigt die Peak-to-Peak-Cantilever-Schwingungsamplitude, die sich aus einem erhöhten Peak-to-Peak-AC-Eingang ergibt. Erwartungsgemäß korreliert die Schwingungsamplitude gut mit dem AC-Eingangswert. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Peak-to-Peak-Amplituden höher sind als das, was normalerweise in der PORT-Bildgebung verwendet wird. Bei der Abbildung fragiler Proben liegt die AC-Amplitude in der Größenordnung von 10-30 nm. Abbildung 4B zeigt die Peak-to-Peak-Cantilever-Schwingungsamplitude für erhöhte DC-Offset-Eingänge. Die Schwingungsamplitude von Spitze zu Spitze bleibt über den DC-Offset-Spannungsbereich ziemlich konstant. Wir führen die kleinen Schwankungen auf Nichtlinearitäten in der Detektion zurück. Abbildung 4C zeigt die Zunahme der AC- und DC-Laserleistungskomponenten, die sich aus dem zunehmenden Spitze-Spitze-Wechselstrom ergibt. Abbildung 4D zeigt die Zunahme der AC- und DC-Laserleistungskomponenten, die sich aus dem zunehmenden DC-Eingangsoffset ergibt.

Die Auswirkungen einer Erhöhung des Spitze-Spitze-AC-Eingangs und des DC-Offset-Eingangs wurden separat getestet, um die jeweiligen Auswirkungen auf die Gesamtleistung und die Schwingungsamplitude zu bestimmen. Eine Erhöhung der Laserleistung führt dazu, dass die Probe gestört wird, wahrscheinlich durch Temperaturerhöhung, während eine Erhöhung der Schwingungsamplitude die Aufprallkraft auf die Probe^{erhöht 5}. Wenn Sie ausschließlich den Spitze-Spitze-AC-Eingang erhöhen, hat dies einen geringeren Einfluss auf die Gesamtzunahme der Laserleistung, wie in Abbildung 4C gezeigt, und erhöht überwiegend die Auslegerschwingungsamplitude (und damit die Aufprallkraft), wie in Abbildung 4A gezeigt. Eine Erhöhung des DC-Offset-Eingangs hat einen größeren Effekt auf die Erhöhung der Laserleistung, wie in Abbildung 4D gezeigt, wodurch die Probe erwärmt wird, aber ein vernachlässigbarer Einfluss auf die Ablenkungsamplitude hat, wie in Abbildung 4B zu sehen ist. Die Bildergebnisse sind in Abbildung 4E,F dargestellt. Abbildung 4E zeigt DNA 3PS für den niedrigsten Spitze-Spitze-AC-Eingang (linkes Bild, blau eingekreist) und den höchsten Spitze-Spitze-AC-Eingang (rechtes Bild, rot eingekreist), was vermutlich durch die höheren Kräfte zu einer Beschädigung der Probe führt. Abbildung 4F zeigt DNA 3PS für den niedrigsten DC-Offset-Eingang (linkes Bild, blau eingekreist) und den höchsten DC-Offset-Eingang (rechtes Bild, rot eingekreist), bei dem Strukturen beschädigt werden.

Abbildung 1: Der Aufbau des HS-AFM. (A) Der PORT-Kopf am Scanner und die Basis des AFM mit dem (i) Knopf zum Einstellen des ausgelesenen Laserfokus am Ausleger, (ii) dem Knopf zum Einstellen der Position des ausgelesenen Lasers am Ausleger, (iii) dem Knopf zum Einstellen der horizontalen Position des Lasers auf der Fotodiode, (iv) dem Knopf zum Einstellen der vertikalen Position des Lasers auf der Fotodiode, und (v) Knöpfe zum Einstellen der Position des photothermischen Antriebslasers auf dem Ausleger. (B) Eine Nahaufnahme des Auslegers in der Querschnittsansicht des Kopfes mit dem Probentisch, wobei (vi) die Federklammer ist, die den Ausleger hält. Der Kanal für die Flüssigkeitsinjektion ist rot markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: DNA-3PS-Probe, die mit AC10 bei einer PORT-Rate von 100 kHz und unterschiedlichen Zeilenraten abgebildet wurde. (A) 100 Hz (3,9 Oszillationszyklen pro Pixel), (B) 200 Hz (1,95 Oszillationszyklen pro Pixel) und (C) 500 Hz (0,78 Oszillationszyklen pro Pixel). Die Bilder wurden bei Sollwerten von 350 pN oder weniger aufgenommen. Maßstabsleiste 200 nm. Nach der Bildgebung wurde eine Kraftkurve zur Ermittlung der Ablenkungsempfindlichkeit erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Cantilever-Ablenkung, Wechselwirkungskurve und Bildqualität bei 100 KHz und 500 kHz PORT-Raten. (A) Cantilever-Auslenkung (Cantilever-freie Oszillation in blauer Nähe, aber ohne Berührung der Oberfläche und die Oszillation des Cantilevers, wenn der Cantilever intermittierend in Kontakt mit der Oberfläche in Rot ist), (B) Wechselwirkungskurve und (C) entsprechende Bildqualität für 100 kHz PORT-Rate. (D) Cantilever-Auslenkung (Cantilever-freie Oszillation in der Nähe, aber ohne Berührung der Oberfläche in blau, und die Oszillation des Cantilevers, wenn der Cantilever intermittierend in Kontakt mit der Oberfläche ist, in rot), (E) Wechselwirkungskurve und (F) entsprechende Bildqualität für 500 kHz PORT-Rate. Die Bilder wurden mit einer Zeilenrate von 100 Hz aufgenommen. Maßstabsbalken 200 nm. Nach der Bildgebung wurde eine Kraftkurve zur Ermittlung der Ablenkungsempfindlichkeit erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Auswirkung der Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und der DC-Offset-Eingangsspannung. Auswirkung der Erhöhung der (A) Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und der (B) DC-Offset-Eingangsspannung auf die Spitze-Spitze-Schwingung des Cantilevers. Auswirkung der Erhöhung der (C) Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und der (D) DC-Offset-Eingangsspannung auf die AC- und DC-Laserleistung. Bildqualität bei minimaler (blau eingekreister) und maximaler (rot eingekreister) (E) Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung und (F) DC-Offset-Eingangsspannung. Beim Erhöhen der Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung wurde die DC-Offset-Eingangsspannung bei 600 mV gehalten. Beim Erhöhen der DC-Offset-Eingangsspannung wurde die Spitze-Spitze-AC-Eingangsspannung bei 200 mV gehalten. Die Integrität der Probe ist bei der Hochleistungskonfiguration beeinträchtigt. Die PORT-Rate wurde bei 100 kHz und die Zeilenrate bei 100 Hz gehalten. Maßstabsleiste 200 nm. Nach der Bildgebung wurde eine Kraftkurve zur Ermittlung der Ablenkungsempfindlichkeit erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Bei der Bildgebung empfindlicher biologischer Proben sind Off-Resonanz-Klopf-Bildgebungsmodi im AFM besonders nützlich, da sie die Tip-Sample-Wechselwirkungskräfte¹⁰ direkt steuern können. Unter ihnen zeichnet sich der PORT-Modus durch die höheren Oszillationsraten aus, die er erreichen kann, was höhere Scanraten ermöglicht. Da PORT den Cantilever direkt und nur mit einem Laser betätigt, ermöglicht es eine Anregung bei wesentlich höheren Frequenzen als herkömmliche Off-Resonance-Anklopfmodi, insbesondere bei der Verwendung von ultrakurzen Auslegern mit hohen Resonanzfrequenzen⁵. Bei der Verwendung von PORT für HS-AFM muss man jedoch auf die Abbildungsparameter achten, um eine gute Abbildungsqualität zu erzielen.

Wie in Abbildung 2 dargestellt, führt eine Erhöhung der Scanraten ohne gleichzeitige Erhöhung der PORT-Raten zu einer schlechten Bildgebungsqualität. Erstens verringern PORT-Raten, die zu weniger als einem Oszillationszyklus pro Pixel führen, die Bildqualität drastisch. Die Abbildungsgeschwindigkeit wird von Natur aus durch die Geschwindigkeit begrenzt, mit der der Cantilever-Abtaster die Oberfläche mit einer geeigneten Spitzen-Proben-Kraftregelung abtastet. In PORT wirkt die Rückkopplungssteuerung diskret am Ende jedes Schwingungszyklus³⁴. Diese begrenzte Abtastrate induziert eine reine Verzögerung in der Rückkopplungsschleife, wodurch die erzielbare Rückkopplungsbandbreite begrenzt wird. Wenn die Rate der Topografieänderung zu schnell wird, um sie mit der PORT-Abtastrate zu verfolgen, kann die Topografie von der Rückkopplungsschleife nicht mehr genau erkannt oder verfolgt werden. Die PORT-Rate muss daher erhöht werden, um die Probe bei höheren Oberflächengeschwindigkeiten originalgetreu aufzulösen. Die Resonanzfrequenz des Cantilevers begrenzt jedoch die maximale PORT-Rate, die wir verwenden können. Liegt die PORT-Rate nahe an der Resonanzfrequenz des Cantilevers, stellt die mit der optischen Hebelmethode gemessene Auslenkung die Spitzen-Abtast-Kräfte nicht mehr originalgetreu dar. Um eine korrekte Tip-Sample-Wechselwirkungskurve zu erhalten, müssen sowohl die mechanische Bandbreite des Cantilevers als auch die elektrische Bandbreite des AFM-Systems groß genug sein, um Fourier-Komponenten der Ablenkkurve zu erkennen, die ein Vielfaches der PORT-Frequenz betragen. Ist eine dieser Bandbreiten zu gering, zeigt die Wechselwirkungskurve nicht mehr den einseitigen Cut-Off (Abbildung 3A), sondern ein sinusförmiges Verhalten (Abbildung 3D), das die tatsächliche Wechselwirkung der Spitzenprobe verschleiert (Abbildung 3E). Dies führt zu einer schlechten Kraftkontrolle in der Bildgebung (Abbildung 3F). Auch kleinere Ausleger mit hoher Resonanzfrequenz, die gleichzeitig niedrige Federkonstanten besitzen, sind daher erforderlich, um die PORT-Rate weiter zu erhöhen. Solch hohe PORT-Raten und Scan-Geschwindigkeiten stellen eine Herausforderung für die AFM-Elektronik dar und erfordern ein sorgfältiges Software- und Elektronikdesign, das die erforderlichen hohen Bandbreiten und optimierte digitale Signalverarbeitungsstrategien bietet.

Einer der Vorteile von PORT im Vergleich zum Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskop besteht darin, dass die Geschwindigkeit der Oberflächenabtastung abgestimmt werden kann. Im Anklopfmodus AFM ist die Oberflächenabtastrate durch die Resonanzfrequenz des Auslegers gegeben. Wenn wir in PORT weit unterhalb der Cantilever-Resonanzfrequenz arbeiten, gehen wir davon aus, dass jede Oberflächenabtastung einen gültigen Datenpunkt liefert. Daher wird die PORT-Erkennungsbandbreite durch die Nyquist-Frequenz bei halber PORT-Rate angegeben. Im Tapping-Modus wird die Detektionsbandbreite durch f₀/2Q³⁵ angegeben. Mit den neuesten Entwicklungen im Bereich PORT können wir die PORT-Rate schrittweise bis zur Resonanzfrequenz erhöhen. In dieser Situation werden PORT und der Tapping-Modus nahezu identisch, da PORT bei diesen Frequenzen die Wechselwirkung zwischen Cantilever und Spitze nicht genau erkennen kann, wie in Abbildung 3E gezeigt. Beim Betrieb mit der Resonanzfrequenz wird die größere Schwingungsamplitude von PORT im Vergleich zum Abklopfmodus zum Nachteil. Das Ziel für die Erhöhung der PORT-Abbildungsrate bleibt daher, die Cantilever-Resonanzfrequenz zu erhöhen, um den Betrieb mit der PORT-Rate weit genug unter der Resonanzfrequenz zu halten.

Wenn wir die PORT-Rate erhöhen, um schnellere Scanraten zu ermöglichen, werden wir mit einem weiteren Problem konfrontiert, das der photothermischen Cantilever-Anregung inhärent ist: Bei höheren Frequenzen verringert sich die Schwingungsamplitude aufgrund einer Abnahme der photothermischen Anregungseffizienz, schließlich bis zu dem Punkt, an dem wir die Laserleistung erhöhen müssen, was zu einem Anstieg der Probentemperatur führt. Eine Erhöhung der PORT-Rate erschwert den Ausgleich von Laserleistung und Schwingungsamplitude, da eine höhere Anregungsleistung erforderlich ist, um eine verringerte Betätigungseffizienz zu kompensieren, die zu einer Beschädigung der Probe führt. Bei höherer Laserleistung konnten wir die Probe nicht mehr beobachten, obwohl wir den geringstmöglichen Kraftsollwert verwendeten (rechte Felder in den Abbildungen 4E, F). Wir müssen vorsichtig sein, wie wir die Amplitude der Cantilever-Oszillation erhöhen und die Laserleistung erhöhen. Es gibt zwei Parameter, die wir einstellen können, um die Laserleistung zu erhöhen. Zunächst der Spitze-Spitze-AC-Eingang, der das an die Laserdiode gesendete sinusförmige Signal steuert, um die abgegebene Laserleistungsintensität sinusförmig zu variieren. Zweitens die DC-Offset-Eingangsspannung, die die Laserdiode im Leitungsbereich hält und daher lasert. Eine Erhöhung der ersten muss mit einer Erhöhung der zweiten Kombination kombiniert werden, da eine Erhöhung der Amplitude des an den Laser gesendeten AC-Signals eine Erhöhung der Gleichspannung erfordert, um eine Überschreitung der Laserschwelle zu vermeiden. Allerdings beeinflusst nur der Spitze-Spitze-AC-Eingang die Cantilever-Schwingungsamplitude, wie in Abbildung 4A dargestellt. Gleichspannungen führen nicht zu Schwankungen der Schwingungsamplituden (Abbildung 4B). Wenn wir also eine sinusförmige Betätigung wünschen, müssen wir die Gleichspannung auf die minimale Spannung einstellen, die es dem Diodenlaser ermöglicht, sich im Laserbereich zu befinden. Alternativ können wir die Erwärmung minimieren, indem wir die Laserdiode während jedes Schwingungszyklus periodisch aus- und wieder einschalten, anstatt einen vollständigen sinusförmigen Antrieb zu verwenden⁵. Die Temperaturschwingung, die erforderlich ist, um den Cantilever-Motor bei photothermischer Anregung zu betätigen, kann effizienter erreicht werden, indem der Laser während eines Teils des Zyklus abgeschaltet wird, wodurch die Temperatur des Cantilevers sinkt und daher eine Cantilever-Biegung entsteht. Dadurch wird die an den Ausleger und die Probe abgegebene Energie minimiert und somit die Gesamttemperatur in der Umgebung gesenkt, wodurch die Hitzeschäden der Probe gemildert werden.

In dieser Studie zeigen wir die Grenzen der bildgebenden Parameter in HS-PORT auf, die eine Schädigung der Wärmeprobe und eine ordnungsgemäße Rückkopplungskontrolle verhindern. Das Verständnis dieser Grenzen wird dazu beitragen, den aktuellen Zustand der PORT AFM-Methode optimal zu nutzen, eine bessere Kontrolle über die Interaktion zwischen Spitze und Probe zu ermöglichen und den nativen Zustand der DNA-Motive in diesen Messungen zu erhalten. Dank der hohen Scan-Raten in Kombination mit einer guten Rückkopplungskontrolle ermöglichte uns PORT, klare und detaillierte Bilder der DNA 3PS und ihrer Wechselwirkungen zu erhalten ^7,8,36. Mit der Möglichkeit einer erhöhten Bildgebungsgeschwindigkeit und einer direkten Steuerung der Spitzen-Proben-Kraft²³ sind wir in der Lage, das Wachstum und die Reorganisation biomolekularer Anordnungen genauer zu verfolgen und die Dynamik im Detail zu beobachten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Abgekündigt
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Elektrophorese  Einheit
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	Thermocycler zum Glühen
Kundenspezifischer AFM-Aufbau	Labor für Bio-Nano-Instrumentierung, Interfakultäres Bioengineering Institut, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fé dé rale Lausanne		Erhältlich über das Labor für Bio-Nano-Instrumentierung
EDTA	ITW Reagenzien	A5097	Im Glühpuffer
Laser Power Meter	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optik  Leistungs- und Energiezählerkonsole
Lively 3AP Netzteil, MP-310	Major Science	MP-310	Elektrophorese Netzteil
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In Glühpuffer
TBE	Thermo Scientific	327330010	Laufpuffer für die Elektrophorese
TRIS	Bio-Rad	1610719	In Glühpuffer