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Methodenartikel

Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie: Bildgebung der Selbstorganisation von DNA-Drei-Punkt-Stern-Motiven mittels photothermischem Off-Resonanz-Klopfen

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DOI:

10.3791/66470

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22. März 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier zeigen wir das Bildgebungsprotokoll zur Beobachtung biomolekularer Wechselwirkungen mit photothermischem Off-Resonance-Klopfen (PORT), bei dem wir Bildgebungsparameter optimiert, Systemgrenzen identifiziert und potenzielle Verbesserungen bei der Bildgebung von Drei-Punkt-Stern-DNA-Motiven untersucht haben.

Zusammenfassung

Die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM) ist ein beliebtes molekulares Bildgebungsverfahren zur Visualisierung biologischer Prozesse von Einzelmolekülen in Echtzeit, da es unter physiologischen Bedingungen in flüssigen Umgebungen abgebildet werden kann. Der photothermische Off-Resonance-Tapping-Modus (PORT) verwendet einen Antriebslaser, um den Ausleger kontrolliert zu oszillieren. Diese direkte Cantilever-Betätigung ist im MHz-Bereich wirksam. In Kombination mit der Steuerung der Rückkopplungsschleife auf der Kraftkurve im Zeitbereich und nicht auf der Resonanzamplitude ermöglicht PORT eine Hochgeschwindigkeitsbildgebung mit bis zu zehn Bildern pro Sekunde mit direkter Kontrolle über die Tip-Sample-Kräfte. Es hat sich gezeigt, dass PORT die Abbildung empfindlicher Assemblierungsdynamiken und die präzise Überwachung von Mustern, die von Biomolekülen gebildet werden, ermöglicht. Bisher wurde die Technik für eine Vielzahl dynamischer In-vitro-Studien verwendet, einschließlich der in dieser Arbeit gezeigten Assemblierungsmuster des DNA-3-Punkt-Stern-Motivs. Durch eine Reihe von Experimenten identifiziert dieses Protokoll systematisch die optimalen Einstellungen der Bildgebungsparameter und die ultimativen Grenzen des HS-PORT AFM-Bildgebungssystems und wie sie die biomolekularen Assemblierungsprozesse beeinflussen. Darüber hinaus untersucht es mögliche unerwünschte thermische Effekte, die durch den Antriebslaser auf die Probe und die umgebende Flüssigkeit induziert werden, insbesondere wenn das Scannen auf kleine Bereiche beschränkt ist. Diese Ergebnisse liefern wertvolle Erkenntnisse, die die Weiterentwicklung der Anwendung des PORT-Modus bei der Untersuchung komplexer biologischer Systeme vorantreiben werden.

Einleitung

Die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie (HS-AFM) ist ein schnell wachsendes bildgebendes Verfahren 1,2,3,4. Es arbeitet mit Geschwindigkeiten, die es Forschern ermöglichen, biomolekulare Wechselwirkungen in Echtzeit zu visualisieren 5,6,7,8,9. Das photothermische Off-Resonance-Tapping (PORT) ist ein Off-Resonance-Bildgebungsmodus, der dem Spitzenkraft-Tapping10,11, dem Puls-Force-Modus12,13 oder dem Sprungmodus14 ähnelt. Anstatt den Scanner jedoch vertikal zu oszillieren, oszilliert PORT vertikal nur den Ausleger durch einen Anregungslaser, der auf den Ausleger fokussiert ist (normalerweise in der Nähe des Klemmpunkts). Der Cantilever verformt sich aufgrund des Bimorph-Effekts: Ein leistungsmodulierter Anregungslaser erhitzt periodisch den beschichteten Cantilever, der sich aufgrund der unterschiedlichen Wärmeausdehnungskoeffizienten des Cantilevers und der Beschichtungsmaterialien15 biegt. Die Cantilever- und Probenerwärmung kann minimiert werden, indem ein Antriebslaser verwendet wird, der während jedes Oszillationszyklus periodisch aus- und wieder eingeschaltet wird, anstatt ein vollständig sinusförmiger Antrieb5 zu verwenden.

DNA wird seit einigen Jahren verwendet, um biologisch relevante, strukturell interessante und biochemisch nützliche Motive zu bilden 16,17,18,19,20. Darüber hinaus haben sich DNA-Strukturen als ideal geeignet erwiesen, um die Bildqualität von AFM21 zu charakterisieren und den Tip-Effekt von Hochgeschwindigkeits-AFM22 zu bewerten. Drei-Punkt-Sterne (3PS) der DNA mit stumpfen Enden wurden als programmierbares Modellsystem zur Untersuchung der supramolekularen Organisation ähnlich strukturierter Moleküle in ansonsten komplexen biologischen Systemen praktisch19. Bisher wurde die Selbstorganisation von Gittern, die aus stumpfen trimeren DNA-Monomeren gebildet werden, mit HS-AFM23 verfolgt. Schließlich organisieren sich diese in großen Netzwerken mit hexagonaler Ordnung. Hier wird die Selbstorganisation von DNA-3-Punkt-Sternen19 mit der PORT-Technik bei Scangeschwindigkeiten abgebildet, die schnell genug sind, um die Selbstorganisation und ihre Korrekturmechanismen24 zu verfolgen und gleichzeitig eine minimale Unterbrechung des Prozesses oder Probenschäden zu gewährleisten. Wie bei jedem HS-AFM-Modus gibt es einen Kompromiss zwischen der erreichbaren Bildqualität, der Bildgeschwindigkeit und der unerwünschten Störung der Probe. Durch die Wahl des richtigen Kompromisses kann man die Selbstorganisationsmuster supramolekularer Anordnungen besser verstehen. Dieses Protokoll wird daher einen ähnlichen Aufbau mit DNA 3PS als Modellsystem verwenden, um die für PORT spezifischen Parameter zu optimieren. Dies ermöglicht den Betrieb mit hohen Bildgebungsgeschwindigkeiten bei ausreichend großen Scangrößen bei gleichzeitiger Minimierung von Probenschäden.

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Protokoll

1. Probe und Puffer

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendete DNA-Kachel ist das 3-Punkt-Stern-Motiv, das im Mao-Labor an der Purdue University entwickelt wurde19,25. Alle Oligonukleotide, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von Integrated DNA Technologies, Inc. erworben. Sammeln Sie die erforderlichen Materialien und Reagenzien.

  1. Mischen Sie die einzelsträngigen DNAs (ssDNAs) in einem molaren Verhältnis von 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM für S2 und 1,8 μM für S3) im Annealing-Puffer (5 mM TRIS, 1 mM EDTA und 10 mMMgAc 2). Die Endkonzentration des DNA-Motivs muss 0,6 μM betragen (49 ng/μL, wobei das Molekulargewicht von 3PS 82020,3 g/mol beträgt).
  2. Geben Sie die DNA-Lösung in ein hitzebeständiges Gefäß und erhitzen Sie es auf 80 °C. Die DNA-Lösung wird 4 h lang langsam von 80 °C auf 20 °C abgekühlt. Dieser Annealing-Prozess hilft den ssDNA-Oligonukleotiden, das gewünschte doppelsträngige DNA-Motiv zu bilden.
  3. Laden Sie zur Reinigung die getemperte DNA-Lösung auf ein 3%iges Agarosegel, um die überschüssigen ssDNAs und alle unerwünschten Nebenprodukte zu entfernen. Das 3%ige Gel bei 60 V für ca. 2,5 h in einem Laufpuffer mit 0,5x Tris-Borat-EDTA (TBE) und 10 mM Mg(CH3COO)2 laufen lassen.
  4. Identifizieren und lokalisieren Sie die Bande auf dem Gel, die das DNA-Motiv enthält. Stellen Sie sicher, dass das Band basierend auf seiner Größe an eine bestimmte Position migriert wurde.
  5. Schneiden Sie die Bande mit dem DNA-Motiv vorsichtig aus dem Gel heraus. Extrahieren Sie das DNA-Motiv aus dem exzidierten Gelfragment, indem Sie es in eine Gelextraktions-Spin-Säule geben und 10 Minuten lang bei 3.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
  6. Ersetzen Sie den Puffer im extrahierten DNA-Motiv mit einem Zentrifugalkonzentrator durch den Annealing-Puffer. Zentrifugieren Sie bei 3000 x g bei Raumtemperatur (oder niedriger), bis die konzentrierte Lösung weniger als 100 μl beträgt. Fügen Sie dann 300 μl Glühpuffer hinzu und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um sicherzustellen, dass der Puffer ausgetauscht wird.
  7. Verdünnen Sie das DNA-Motiv zu Bildgebungszwecken auf 6 nM. Verwenden Sie ein Spektralphotometer oder andere geeignete Methoden, um die Konzentration genau zu bestimmen und einzustellen. Das DNA-Motiv ist nun bereit für die Bildgebung.
    HINWEIS: Alle Puffer im Protokoll haben einen pH-Wert von 8,0. Die Sequenzinformationen für die drei jeweiligen Banden lauten wie folgt:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Wachstum der freitragenden Spitze

  1. Auslegermontage am REM-Auslegerhalter: Stellen Sie sicher, dass die Ausleger sauber und frei von Verunreinigungen sind. Montieren Sie die Ausleger auf eine geeignete Halterung, die mit dem REM-System kompatibel ist. Das maßgefertigte Design des Auslegerhalters kann auf Anfrage geteilt werden.
  2. Gasinjektion: Erhitzen Sie das Vorläufergas (z. B. Phenanthren C14H10 Vorläufer für amorphe Kohlenstoffspitzen), das für das Gasinjektionssystem verwendet werden soll, um die neue Spitze wachsen zu lassen. Sobald das Vakuum unter 10-5 mbar liegt, spülen Sie die Gaseinspritzleitung 10 Mal für 2 s, um sicherzustellen, dass sich keine unerwünschten Luftreste in der Düsenleitung befinden (dies muss bei geschlossenem Ventil zur Pistolenkammer erfolgen).
  3. Einstellung der Spitzenposition: Verwenden Sie die Rasterelektronenmikroskopie (REM), um das Ende des Auslegers zu lokalisieren. Kippen Sie den Auslegerhalter in einen Winkel (z. B. 11° in diesem Fall), der dem Winkel entspricht, den der Ausleger aufweist, wenn er auf dem AFM-Auslegerhalter in Bezug auf die Oberfläche platziert wird, sodass die gewachsene Spitze während der Bildgebung senkrecht zur Oberfläche steht. Passen Sie die Position und den Fokus des REM an, um eine klare Sicht auf die Spitze des Cantilevers zu erhalten, an der eine scharfe Kohlenstoff-Nanospitze gezüchtet wird.
  4. Fokussierte elektronenstrahlinduzierte Abscheidung (FEBID):
    1. Stellen Sie die Abscheidungsparameter in der ausgewählten Software (in diesem Fall SmartFIB) ein, z. B. Strahlstrom (I) und Beschleunigungsspannung (V), Arbeitsabstand (WD), Vergrößerung, belichtete Form, Dosis-/Abscheidungszeit und Verweilzeit. Die folgenden Parameter wurden verwendet, um amorphe Kohlenstoffspitzen zu züchten, die gute mechanische Eigenschaften für die AFM-Bildgebung aufweisen, was zu Längen um 130 nm und Radien im Bereich von 2-4 nm führt:
      Spot/Punkt als freiliegende Form auswählen
      WD = 5 mm
      I = 78 pA und V = 5 kV
      Verweilzeit = 1 μs
      Dosis = 0,05 nC und Abscheidezeit = 0,64 s
      Vergrößerung = 20000x
    2. Beginnen Sie den Abscheidungsprozess, um die Spitze wachsen zu lassen, indem Sie den Elektronenstrahl an einer Stelle auf die Cantilever-Spitze bestrahlen, während gleichzeitig das Vorläufergas injiziert wird, wodurch das Gas geschlossen wird, wenn die Abscheidung abgeschlossen ist. In diesem Fall führt die SmartFIB-Software dies nach dem Einrichten des oben erwähnten Rezepts automatisch durch.
  5. Analyse nach dem Wachstum: Führen Sie eine REM-Bildgebung nach dem Wachstum durch, um die neu gewachsene Spitze zu untersuchen und ihre Qualität und Eigenschaften (Spitzenradius und -länge) sicherzustellen. Warten Sie 1-2 Minuten nach dem Spitzenwachstum, um sicherzustellen, dass das gesamte Vorläufergas abgepumpt wird, um eine erneute Ablagerung während der REM-Bildgebung zu vermeiden. Entfernen Sie den Probenhalter aus der REM-Kammer.
  6. Cantilever-Recycling: Falls im REM-System auch ein kombinierter fokussierter Ionenstrahl (FIB) installiert ist, entfernen Sie eine beschädigte oder verschmutzte, zuvor gewachsene Spitze, indem Sie sie mit dem FIB-System unter Verwendung niedriger FIB-Ströme (z. B. 1 pA, um Cantilever-Schäden zu vermeiden) fräsen. Führen Sie das Entfernen der Spitze durch, indem Sie vom Ende der Spitze bis zur Basis in Querschnittsform fräsen, um ein Zusammenklappen der Spitze zu vermeiden. So kann ein neuer nachwachsen.

3. HS-AFM-Hardware

  1. Der Bildgebungsaufbau besteht aus dem speziell angefertigten PORT-Kopf5, 26 (Figur 1A), dem Hochgeschwindigkeitsscanner26 mit einer Probenscheibe mit Glimmer darauf, dem kompatiblen Controller27, dem Hochspannungsverstärker mit der hohen Bandbreite, die für die Hochgeschwindigkeitsbildgebung erforderlich ist, der AFM-Basis und dem PC mit der erforderlichen Software zur Steuerung der zuvor erwähnten Ausrüstung27.
    HINWEIS: In diesem Fall handelt es sich um Open-Source-Komponenten, für die Pläne beim Labor für Bio- und Nanoinstrumente der EPFL27, 28 erhältlich sind. Es ist auch möglich, an Workshops zum Bau des PORT-Kopfes und der Steuerung29 teilzunehmen sowie die LabView-basierte Software herunterzuladen und zu verwenden.
  2. Platzieren Sie mit einer Pinzette vorsichtig einen ultrakurzen Ausleger (z. B. AC10DS oder gleichwertig) unter der Federklammer am Auslegerhalter. Stellen Sie sicher, dass der Cantilever-Chip fest und stabil ist.
  3. Geben Sie 50 μl Flüssigkeit mit einer Spritze durch die linke Flüssigkeitszugangsöffnung, wie in Abbildung 1B gezeigt. Richten Sie bei ausgeschaltetem Anregungslaser den Ausleselaser mit den drei entsprechenden Knöpfen am AFM-Kopf aus, die in Abbildung 1A gezeigt sind. Beobachten Sie dazu den Schatten des Auslegers auf einem weißen Papier, während Sie die Summe maximieren (Schattenmethode). Zentrieren Sie dann den Laserpunkt mit den beiden dafür vorgesehenen Knöpfen auf der Fotodiode.
  4. Schalten Sie den Antriebslaser ein und richten Sie ihn aus, indem Sie das Kontrollkästchen "Excitation Enable" in "Excitation VI" aktivieren, sodass er den Ausleger betätigt und oszilliert. Zeigen Sie das Cantilever-Anregungssignal und das Cantilever-Ablenksignal auf einem angeschlossenen Oszilloskop an. Wenn die Ablenkschwingung zu gering (oder nicht vorhanden) ist, kann es sein, dass der Antriebslaser sehr weit vom Ausleger entfernt ist. Verwenden Sie in diesem Fall die Schattenmethode und schalten Sie den Ablenkungslaser aus, um die Ausrichtung zu erleichtern. Maximieren Sie die Schwingungsamplitude mit den Einstellknöpfen des Antriebslasers, die in Abbildung 1A gezeigt sind.
  5. Um die Cantilever-Schwingungsamplitude in PORT einzustellen, geben Sie in der entsprechenden Steuerung der Software die Spitze-Spitze-Spannung ein, die an den Steuerkreis der Laserdiode gesendet wird (von nun an Spitze-Spitze-AC-Eingang) in Anregung VI. Um die Laserdiode im Leitungsbereich zu halten und somit zu lasern, fügen Sie der Steuerschaltung der Laserdiode eine Gleichspannung hinzu (ab sofort DC-Offset-Eingang), was ebenfalls über eine Konfigurationsbox in Excitation VI erfolgt. Beides wirkt sich auch auf die Laserleistung aus, die mit einem Laserleistungsmesser gemessen werden kann und zur Abstimmung der Auslegerschwingungsamplitude verwendet wird.
  6. Bestimmen Sie die maximale photothermische Anregungsfrequenz, die an den Ausleger angelegt werden kann, die unter der Resonanzfrequenz des Auslegers liegen muss. Bestimmen Sie die Resonanzfrequenz durch eine thermische Abstimmung oder einen Frequenzdurchlauf. Die in dieser Studie verwendeten Ausleger (AC10DS), deren Resonanzfrequenz in Flüssigkeiten bei etwa 400 kHz (1 MHz in Luft)30 liegt, haben einen quasistatischen Biegebereich unterhalb von 300 kHz5. Daher müssen PORT-Frequenzen unterhalb dieser Grenze (ca. 100-200 kHz) verwendet werden.
  7. Passen Sie die Bildgebungsparameter und Einstellungen für die PORT-Rate und die Scan-Rate auf die erforderlichen Werte in den Anregungs- bzw. Scan-Vis-Werten an (die in diesem Artikel verwendeten Parameter sind in den Abbildungsbeschreibungen angegeben). Sobald die Setup- und Bildgebungsparameter konfiguriert sind, führen Sie die erforderlichen Bildgebungsexperimente durch, um die molekularen Wechselwirkungen zu beobachten und zu verfolgen.
    HINWEIS: Da AC10DS-Ausleger nicht mehr verkauft werden, muss möglicherweise eine Alternative wie Fastscan D oder BioLever31 verwendet werden, bis ein Äquivalent verfügbar ist.

4. Ermitteln der richtigen Wechselwirkungskurven

  1. Nähern Sie sich zunächst der Probenoberfläche im Kontaktmodus, indem Sie auf dem Z-Controller-VI, das auf Kontaktmodus eingestellt ist, auf Start klicken.
    1. In diesem Modus kommt die AFM-Spitze in direkten Kontakt mit der Probe. Sobald die Oberfläche erreicht ist, führen Sie in Rampe VI eine Kraft-Abstand-Kurve durch, um die Kalibrierung der Auslenkungsempfindlichkeit zu erhalten.
    2. Schätzen Sie außerdem die Cantilever-Federkonstante, entweder aus den Spezifikationen des Cantilever-Anbieters (weniger genau), die mit einem Interferometer erhalten wurden, oder durch eine auf thermischer Abstimmung basierende Kalibrierung nach der Kalibrierung der Ablenkempfindlichkeit. Eine präzise Cantilever-Kalibrierung ist für eine genaue Kraftregelung der Spitze und Probe unerlässlich.
  2. Nachdem Sie den Z-Piezo vollständig von der Oberfläche zurückgezogen haben, an der die Spitze die Oberfläche nicht erreichen kann, indem Sie im Z-Controller-VI auf "Up " geklickt haben, wechseln Sie in den PORT-Modus im Z-Controller-VI und aktivieren Sie den Anregungslaser im Kontrollkästchen "Anregungs-VI". Stellen Sie zunächst den PORT-Modus mit einem AC10DS-Ausleger so ein, dass er mit der gewünschten Frequenz in Anregung VI arbeitet, die in diesem experimentellen Fall 100 kHz beträgt.
  3. Nehmen Sie die freitragende Schwingung nah auf, ohne jedoch die Oberfläche zu berühren. Schalten Sie dann das Feedback im Z-Controller in Kontakt mit der Oberfläche ein, um aufzunehmen, und klicken Sie auf Korrigieren , um die Schwingung des Cantilevers zu erhalten, wenn der Cantilever intermittierend mit der Oberfläche in Kontakt kommt, beides in Nanometern. Subtrahieren Sie die freie Schwingungskurve von der intermittierenden Kontaktkurve, um die wahre Wechselwirkungskurve zu erhalten, und wandeln Sie sie mit der Cantilever-Federkonstante (in diesem Fall 0,1 N/m) in pN um.

5. HS-AFM-Bildgebung

  1. Bereiten Sie eine Lösung von Mg(CH3COO)2 in einer Konzentration von 10 mM vor. Mit einer Hamilton-Spritze werden 50 μl der vorbereiteten 10 mM Mg(CH3COO)2-Lösung in den Fluidikkanal des Cantilever-Halters injiziert, wodurch ein Flüssigkeitstropfen entsteht, der den Ausleger umschließt.
  2. Nähern Sie sich dem Ausleger allmählich der Fläche, indem Sie auf dem Z-Controller VI auf Start klicken. Sobald die Oberfläche erkannt wurde, schalten Sie das Feedback ein und suchen Sie den Spitzenwert der Wechselwirkungskurve in den ORT-Kraftkurven VI. Finden Sie den niedrigsten Kraftsollwert, der eine korrekte Nachführung ermöglicht (unter 300 pN, um die Beschädigung empfindlicher Bioproben zu vermeiden).
  3. Legen Sie die Scangröße im Scan-VI auf 800 nm x 800 nm und die Zeilenrate auf 100 Hz fest. Scannen Sie die Oberfläche, indem Sie in Scan VI auf den Pfeil Frame (nach unten) klicken, um die Oberflächenqualität zu überprüfen. Wenn Verunreinigungen festgestellt werden, beheben Sie das Problem, indem Sie die Oberfläche, den Ausleger und/oder den Auslegerhalter reinigen, bevor Sie fortfahren.
  4. Ziehen Sie nach dem Scannen den Ausleger von der Oberfläche zurück, indem Sie im Z-Controller-VI auf Zurückziehen klicken. Entfernen Sie die Pufferlösung mit einer Hamilton-Spritze aus dem Loch im Auslegerhalter, um Probleme mit dem Totvolumen zu vermeiden.
  5. Bereiten Sie eine verdünnte DNA-3PS-Lösung aus Teil 1 des Protokolls vor. Injizieren Sie 50 μl der verdünnten DNA-3PS-Lösung in den dafür vorgesehenen Kanal des Cantilever-Halters.
  6. Starten Sie den Imaging-Prozess, indem Sie die Schritte 5.2 bis 5.3 wiederholen und einen Bereich von 800 nm x 800 nm mit einer Standardzeilenrate von 100 Hz (256 Zeilen × 256 Pixel) scannen. Passen Sie nach dem ersten Scan die Bildgröße und -geschwindigkeit in Scan VI für die weitere Datenerfassung auf die angegebenen Werte an.
  7. Halten Sie den Eingangskraft-Sollwert der Tip-Sample-Wechselwirkung im Feld Z Controller VI Setpoint während des gesamten Bildgebungsprozesses auf dem niedrigsten Niveau, das für eine ordnungsgemäße Abführung erforderlich ist (unter 300 pN), um Probenbeschädigungen/-störungen zu minimieren, sofern nicht anders angegeben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle erforderlichen Probenbereiche.

6. Bildbearbeitung

  1. Richten Sie die Umgebung für die Ausführung des angepassten Pygwy-Batchverarbeitungscodes (Python für Gwyddion) ein, und stellen Sie sicher, dass Python und alle erforderlichen Bibliotheken vorhanden sind. Weitere Informationen finden Sie auf der Website von Gwyddion.32 sind ordnungsgemäß auf dem System installiert. Dadurch wird sichergestellt, dass der Code reibungslos läuft und auf die erforderlichen Funktionalitäten zugreifen kann.
  2. Öffnen Sie den angepassten Pygwy-Batch-Verarbeitungscode (auf Anfrage verfügbar). Dadurch erhalten Sie Zugang zu den Werkzeugen und Funktionen, die für die Bildverarbeitung und -analyse benötigt werden.
  3. Beginnen Sie die Bildverarbeitung, indem Sie die horizontale Mittellinienkorrektur an den Bildern durchführen. Dieser Schritt zielt darauf ab, Unregelmäßigkeiten oder Artefakte in den Scanlinien zu beseitigen und sicherzustellen, dass nachfolgende Verarbeitungsschritte auf genauen Daten basieren. Wenden Sie nach dem Entfernen des Flugzeughintergrunds die Linienkorrektur an. Verwenden Sie die Narbenentfernung, um die Bilder weiter zu verbessern, indem Sie unerwünschte Flecken oder Unvollkommenheiten entfernen, die durch äußere Faktoren verursacht wurden. Dieser Schritt verbessert das visuelle Erscheinungsbild der Bilder.
  4. Verbessern Sie die Sichtbarkeit und den Kontrast der Bilder, indem Sie die Farbhöhenkarte anpassen. Dadurch wird sichergestellt, dass interessante Merkmale klar visualisiert werden und sich in den Bildern abheben.
  5. Wählen Sie die verarbeiteten Bilder aus, die zu einem Video kombiniert werden sollen. Bestimmen Sie die gewünschte Bildrate für das Video. Stellen Sie in diesem Fall die Geschwindigkeit auf 7 Bilder pro Sekunde (fps) ein.
  6. Berechnen Sie die Dauer jedes Frames. Verwenden Sie Fiji (ImageJ), um die bearbeiteten Bilder zu einem Video zusammenzufassen. Stellen Sie sicher, dass die Bildrate und die Bilddauer korrekt eingestellt sind.

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Ergebnisse

In dieser Untersuchung wurde der dynamische Assemblierungsprozess von DNA-3-Punkt-Stern-Motiven zu stabilen Inseln unter Ausnutzung der Fähigkeiten des HS-PORT AFM erfolgreich beobachtet. Diese Technik ermöglichte es uns, den Zusammenbau dieser Strukturen in Echtzeit zu erfassen. In Abbildung 2A,B erhalten wir eine klare Bildabtastung bei 100 Hz bzw. 200 Hz Zeilenraten für eine PORT-Rate von 100 kHz (800 nm x 800 nm Scangröße). Dies entspricht 3,9 bzw. 1,95 Oszillationszykle...

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Diskussion

Bei der Bildgebung empfindlicher biologischer Proben sind Off-Resonanz-Klopf-Bildgebungsmodi im AFM besonders nützlich, da sie die Tip-Sample-Wechselwirkungskräfte10 direkt steuern können. Unter ihnen zeichnet sich der PORT-Modus durch die höheren Oszillationsraten aus, die er erreichen kann, was höhere Scanraten ermöglicht. Da PORT den Cantilever direkt und nur mit einem Laser betätigt, ermöglicht es eine Anregung bei wesentlich höheren Frequenzen als herkömmlich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Danksagungen

Die Autoren danken Raphael Zingg für die Hilfe bei der Programmierung des Python-Skripts für die Verarbeitung von Bildserien. GEF bedankt sich für die Finanzierung durch H2020 - EU-Rahmenprogramm für Forschung und Innovation (2014-2020); ERC-2017-CoG; InZelle; Projektnummer 773091. VC nimmt zur Kenntnis, dass dieses Projekt eine Finanzierung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 754354 erhalten hat. Diese Forschung wurde vom Schweizerischen Nationalfonds im Rahmen des Stipendiums 200021_182562 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Abgekündigt 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Elektrophorese  Einheit
Biometra TRIOBiometra GmbH207072XThermocycler zum Glühen
Kundenspezifischer AFM-AufbauLabor für Bio-Nano-Instrumentierung, Interfakultäres Bioengineering Institut, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fé dé rale LausanneErhältlich über das Labor für Bio-Nano-Instrumentierung
EDTAITW ReagenzienA5097Im Glühpuffer
Laser Power MeterThorlabsPM100DDigital Handheld Optik  Leistungs- und Energiezählerkonsole
Lively 3AP Netzteil, MP-310Major ScienceMP-310Elektrophorese Netzteil
MgAc2ABCR GmbHAB544692In Glühpuffer
TBEThermo Scientific327330010Laufpuffer für die Elektrophorese
TRISBio-Rad1610719In Glühpuffer

Referenzen

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