Aufzeichnung und Analyse der multimodalen Dynamik großskaliger neuronaler Ensembles auf einem CMOS-integrierten Mikroelektrodenarray mit hoher Dichte

Neuronale Ensembles, oft als Zellverbände bezeichnet, sind für die neuronale Codierung von zentraler Bedeutung und erleichtern komplizierte Berechnungen zur Verarbeitung neuronaler Informationen^auf mehreren Skalen ^1,2,3. Diese Ensembles untermauern die Bildung ausgedehnter neuronaler Netzwerke und ihrer nuancierten Mikroschaltkreise⁴. Solche Netzwerke und ihre oszillatorischen Muster treiben fortgeschrittene Gehirnfunktionen an, einschließlich Wahrnehmung und Kognition. Während umfangreiche Forschungen bestimmte neuronale Typen und synaptische Wege untersucht haben, bleibt ein tieferes Verständnis dafür, wie Neuronen gemeinsam Zellverbände bilden und die raumzeitliche Informationsverarbeitung über Schaltkreise und Netzwerke hinweg beeinflussen, schwer fassbar⁵.

Akute Ex-vivo-Hirnschnitte sind zentrale elektrophysiologische Werkzeuge zur Untersuchung intakter neuronaler Schaltkreise und bieten eine kontrollierte Umgebung zur Untersuchung oszillatorischer Aktivitätsmuster der neuronalen Funktion, der synaptischen Übertragung und der Konnektivität, mit Auswirkungen auf pharmakologische Tests und Krankheitsmodellierung ^6,7,8. Dieses Studienprotokoll hebt zwei wichtige Gehirnschaltkreise hervor - den Hippocampus-Kortikal-Zyklus (HC), der an Lern- und Gedächtnisprozessen beteiligt ist ^9,10, und den Riechkolben (OB), der für die Geruchsunterscheidung verantwortlich ist 11,12,13. In diesen beiden Regionen werden während des gesamten Lebens in Säugetiergehirnen kontinuierlich neue funktionelle Neuronen durch adulte Neurogenese gebildet¹⁴. Beide Schaltkreise zeigen mehrdimensionale dynamische neuronale Aktivitätsmuster und inhärente Plastizität, die an der Neuverdrahtung des bestehenden neuronalen Netzes beteiligt sind und bei Bedarf alternative Informationsverarbeitungsstrategien ermöglichen^15,16.

Akute Ex-vivo-Hirnschnittmodelle sind unverzichtbar, um in die Gehirnfunktionalität einzutauchen und Krankheitsmechanismen auf der Ebene der Mikroschaltkreise zu verstehen. In-vitro-Zellkulturen, die aus neuronalen Netzwerken menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden, bieten jedoch einen vielversprechenden Weg für die translationale Forschung, der Erkenntnisse aus Tierversuchen nahtlos mit einer potenziellen klinischen Behandlung am Menschen verbindet^17,18. Diese humanzentrierten In-vitro-Assays dienen als zuverlässige Plattform für die Bewertung der pharmakologischen Toxizität, ermöglichen ein präzises Wirkstoffscreening und fördern die Erforschung innovativer zellbasierter therapeutischer Strategien^19,20. In Anerkennung der zentralen Rolle des neuronalen iPSC-Modells haben wir das dritte Modul dieser Protokollstudie der gründlichen Untersuchung der funktionellen Eigenschaften seiner abgeleiteten Netzwerke und der Feinabstimmung der zugehörigen Zellkulturprotokolle gewidmet.

Diese elektrogenen neuronalen Module wurden häufig mit Techniken wie Kalzium (Ca²⁺ Bildgebung), Patch-Clamp-Aufzeichnungen und Mikroelektrodenarrays mit niedriger Dichte (LD-MEA) untersucht. Während die Ca²⁺-Bildgebung eine Kartierung der Einzelzellaktivität ermöglicht, handelt es sich um eine auf Zellmarkierung basierende Methode, die durch ihre geringe zeitliche Auflösung und die Herausforderungen bei Langzeitaufzeichnungen behindert wird. LD-MEAs fehlt es an räumlicher Präzision, während Patch-Clamp als invasive und mühsame Technik an einer einzigen Stelle oft eine niedrige Erfolgsquote aufweist 21,22,23. Um diese Herausforderungen zu bewältigen und die netzwerkweite Aktivität effektiv zu untersuchen, haben sich groß angelegte simultane neuronale Aufzeichnungen als zentraler Ansatz für das Verständnis der Berechnungsprinzipien der neuronalen Dynamik herausgestellt, die der Komplexität des Gehirns zugrunde liegen, und ihrer Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheit^24,25.

In diesem JoVE-Protokoll demonstrieren wir eine groß angelegte neuronale Aufzeichnungsmethode, die auf der High-Density-MEA (HD-MEA) basiert, um die räumlich-zeitliche neuronale Aktivität über verschiedene Gehirnmodalitäten hinweg zu erfassen, einschließlich Hippocampus- und Riechkolbenschaltkreisen aus akuten Ex-vivo-Schnitten des Mausgehirns (Abbildungen 1A-C) und in-vitro-humanen iPSC-abgeleiteten neuronalen Netzwerken (Abbildungen 1D-E), die zuvor von unserer Gruppe und anderen Kollegen berichtet wurden^26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Der HD-MEA, der auf der CMOS-Technologie (Complementary-Metal-Oxide-Semiconductor) basiert, verfügt über On-Chip-Schaltungen und -Verstärkungen, die Aufnahmen im Sub-Millisekunden-Bereich über ein 7 mm² Array der Größe³⁶ ermöglichen. Dieser nicht-invasive Ansatz erfasst markierungsfreie extrazelluläre Feuermuster von Tausenden von neuronalen Ensembles gleichzeitig mit 4096 Mikroelektroden mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung und enthüllt die komplizierte Dynamik von lokalen Feldpotentialen (LFPs) und Multiunit-Spike-Aktivität (MUA)^26,29.

Angesichts des Umfangs der mit dieser Methodik generierten Daten ist ein ausgeklügelter analytischer Rahmen unerlässlich, birgt jedoch Herausforderungen³⁷. Wir haben Berechnungswerkzeuge entwickelt, die automatische Ereigniserkennung, Klassifizierung, Graphentheorie, maschinelles Lernen und andere fortschrittliche Techniken umfassen (Abbildung 1F)26,29,38,39. Durch die Integration der HD-MEA mit diesen Analysewerkzeugen wird ein ganzheitlicher Ansatz entwickelt, um die komplizierte Dynamik von einzelnen Zellverbänden bis hin zu breiteren neuronalen Netzwerken über verschiedene neuronale Modalitäten hinweg zu untersuchen. Dieser kombinierte Ansatz vertieft unser Verständnis der rechnerischen Dynamik normaler Gehirnfunktionen und bietet Einblicke in Anomalien, die bei pathologischen Zuständen vorhanden sind²⁸. Darüber hinaus können die Erkenntnisse aus diesem Ansatz Fortschritte in der vom Gehirn inspirierten Modellierung, dem neuromorphen Computing und neuronalen Lernalgorithmen vorantreiben. Letztendlich ist diese Methode vielversprechend, um die Kernmechanismen hinter Störungen neuronaler Netzwerke aufzudecken, möglicherweise Biomarker zu identifizieren und die Entwicklung präziser Diagnosewerkzeuge und gezielter Behandlungen für neurologische Erkrankungen zu steuern.

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den geltenden europäischen und nationalen Vorschriften (Tierschutzgesetz) durchgeführt und von der Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14 genehmigt.

1. Ex-vivo-Hirnschnitte aus Hippocampus-Kortikal- und Riechkolbenschaltkreisen auf HD-MEA

1. Vorbereitung von experimentellen Schneid- und Aufnahmelösungen (Abbildung 2A)
   1. Bereiten Sie am Versuchstag 0,5 l hochsaccharosereiche Schneidlösung und 1 l künstliche Liquor-Aufnahmelösung (aCSF) vor (Tabelle 1A, B).
      1. Alle festen Chemikalien werden in einen trockenen Messkolben gegeben und dann ein Teil des Weges mit doppelt destilliertem (dd) Wasser gefüllt.
      2. MgCl₂ und CaCl₂ aus 1 M Stammlösungen zugeben und den Rest mit dd Wasser auffüllen. Beginnen Sie mit einem Magnetrührer ständig zu rühren, bis sich die sichtbaren Feststoffe ~5 min aufgelöst haben.
   2. Verwenden Sie ein Gefrierpunktosmometer, um die Osmolarität zwischen 350-360 mOsm für die hochsaccharosehaltige Schneidlösung und 315-325 mOsm für die aCSF-Aufzeichnungslösung zu validieren.
   3. Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert zwischen 7,3 und 7,4 für die hochsaccharosehaltige Schneidlösung und 7,25 bis 7,35 für die aCSF-Aufzeichnungslösung zu validieren. Beginnen Sie mit 95% O₂ und 5% CO₂ kontinuierlich zu sprudeln.
   4. Legen Sie die hochsaccharosereiche Schneidlösung vor dem Schneiden mindestens 30 Minuten lang auf Eis und beginnen Sie mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ kontinuierlich zu sprudeln.
   5. Füllen Sie nach 10 min Carbogenation ein 50-ml-Becherglas mit 30 mL Schneidlösung und lagern Sie es 20-30 min lang im Gefrierschrank (-20 °C) oder bis es teilweise gefroren ist.
      HINWEIS: Alle Lösungen sollten für jedes Experiment frisch zubereitet werden. Das hier verwendete dd-Wasser ist autoklaviertes Reinstwasser, das bei Raumtemperatur (RT) gelagert wird. Die Menge der vorbereiteten Lösung sollte auf die spezifische Studienfrage zugeschnitten sein.
2. Präparation von Brain-Slice-Arbeitsbereichen (Abbildung 2A)
   1. Bringen Sie das Tier in den Versuchsraum.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden weibliche C57BL/J6-Mäuse im Alter von 8 bis 16 Wochen verwendet, wie zuvor beschrieben 26,29,32. Das Tier sollte sich nach dem Transport mindestens 30 Minuten akklimatisieren können. Ferntransfers (d.h. zwischen Instituten) sollten am selben Tag wie das Experiment vermieden werden. Alter, Geschlecht und Stamm des Tieres müssen anhand der spezifischen Studienfrage bestimmt werden.
   2. Während sich das Tier akklimatisiert und die Lösung mit hohem Saccharosegehalt abkühlt, platzieren Sie die erforderlichen Werkzeuge in jedem dafür vorgesehenen Arbeitsbereich (siehe Materialtabelle).
   3. Bereiten Sie den Arbeitsbereich für die Wiederherstellung und Wartung von Gehirnschnitten vor. Füllen Sie die Scheibenrückgewinnungskammer mit carbogenierter aCSF-Aufnahmelösung und stellen Sie die Kammer in das auf 32 °C eingestellte Wasserbad. Behalten Sie während des gesamten Experiments eine kontinuierliche Carbogenation bei.
   4. Bereiten Sie den Arbeitsbereich für die Vorbereitung von Gehirnschnitten vor. Richten Sie das Vibratom ein - legen Sie das Blatt in den Vibratom-Klingenhalter und kalibrieren Sie das Vibratom auf die richtigen Einstellungen (Blattverfahrgeschwindigkeit: 0,20 mm/s, Höhenamplitude: 95 μm, Klingenwinkel: 45°). Füllen Sie die Vibratome-Eisschale mit Eis und die Pufferschale mit einer hochsaccharosehaltigen Schneidlösung und beginnen Sie, die Lösung in der Pufferschale zu carbogenisieren.
   5. Bereiten Sie den Arbeitsbereich für die Gehirnvorbereitung vor. Füllen Sie die 150 mm Glas-Petrischale mit Eis und stellen Sie eine 90 mm Kunststoff-Kulturschale mit Filterpapier hinein. Füllen Sie die Plastikkulturschale mit einer Schneidlösung mit hohem Saccharosegehalt und beginnen Sie mit dem Carbogenieren. Geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf die gekühlte Probenplatte und befestigen Sie die Agaroseform.
      HINWEIS: Die Agaroseform wird mindestens am Vortag mit 3% Agarose in Wasser in einer benutzerdefinierten Maushirnform hergestellt.
   6. Bereiten Sie schließlich den Arbeitsbereich für die Gehirnextraktion vor. Decken Sie Aluminiumfolie mit Seidenpapier ab, nehmen Sie ein 50-ml-Becherglas mit hochsaccharosereichem Schneidlösungsmatsch heraus und geben Sie Isofluran in die Anästhesiekammer.
      HINWEIS: Die Anästhesie wird ~1 Minute vor der Platzierung des Tieres in die Anästhesiekammer gegeben. Ein 50-ml-Becherglas mit 30 ml hochsaccharosereichem Schneidlösungsmatsch wird ~2 min vor der Enthauptung aus dem -20 °C-Gefrierschrank genommen.
3. Extraktion und Schneiden von Mäusegehirn
   HINWEIS: Dieser gesamte Vorgang sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um einen Mangel an Sauerstoffversorgung des Gehirns zu vermeiden. Die Entfernung des Gehirns sollte nur 1-2 Minuten von der Enthauptung bis zum Eintauchen in den Slush mit hoher Saccharose-Schneidlösung dauern.
   1. Betäuben Sie das Tier mit der entsprechenden Dosierung von Isofluran (0,5 ml/1 l Anästhesiekammer). Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie durch eine Pfotenklemme; Bestätigen Sie das Fehlen eines Pfotenrückzugsreflexes, bevor Sie fortfahren.
   2. Übertragen Sie das Tier auf das Seidenpapier im Arbeitsbereich zur Gehirnextraktion und enthaupten Sie es mit einer chirurgischen Schere.
   3. Führen Sie eine Irisschere in den Hirnstamm ein und halten Sie die untere Schere bündig mit der Schädeldecke. Schneiden Sie entlang der sagittalen Naht, bis die koronale Naht erreicht ist. Legen Sie eine Irisschere in die Augenhöhlen und schneiden Sie die metopische Naht durch. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Seiten der Schädeldecke nach unten zu bewegen und das gesamte Gehirn freizulegen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit der Irisschere und der Pinzette, um das Gehirn beim Durchtrennen der Nähte nicht zu punktieren.
   4. Schieben Sie das Gehirn mit der stumpfen Kante der gebogenen Pinzette in das 50-ml-Becherglas mit 30 ml hochsaccharosereichem Schneidlösungsmatsch. 1 Minute ruhen lassen.
   5. Übertragen Sie das Gehirn in die 90-mm-Kunststoffkulturschale mit gekühlter karbogenierter Schneidlösung im Arbeitsbereich für die Gehirnvorbereitung. Richten Sie das Gehirn für die Positionierung in der Agaroseform aus.
   6. Gib einen kleinen Punkt Sekundenkleber auf das rostrale Ende der Agaroseform. Legen Sie das Gehirn mit dem Spatel in die Form. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn mit der Rückenseite nach unten zum horizontalen Schneiden platziert wird.
      HINWEIS: Die Position des Klebers in der Form ändert sich je nach Region of Interest (ROI). Stellen Sie bei Hippocampus-Kortikal- (HC) und Riechkolbenschnitten (OB) sicher, dass der OB stabilisiert ist und die Seiten des Gehirns frei von Klebstoff bleiben. Zu viel Kleber beeinträchtigt die Schnittqualität und verursacht Risse beim Vibratomenschneiden.
   7. Bewegen Sie die Probenplatte in die Pufferschale, bewegen Sie die Klinge im richtigen Winkel in Position und erhöhen Sie die Höhe der Pufferschale, um die Klinge so nah wie möglich an das Gehirn zu bringen.
   8. Schneiden Sie HC- und OB-Gewebe in Intervallen von 300 μm in Intervalle von 0,20 mm/s und sammeln Sie sie dann nach jeder Schneiderunde mit einer Pasteurpipette aus Glas.
   9. Lassen Sie die Scheiben 45 Minuten lang in der mit aCSF gefüllten Rückgewinnungskammer in einem 32 °C warmen Wasserbad, gefolgt von 1 h bei RT. Stellen Sie sicher, dass sich die Scheiben nicht überlappen und vollständig der carbogenierten Lösung ausgesetzt sind.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass alle Lösungen und alle genannten Kammern, die die Lösung enthalten, kontinuierlich aufgefüllt werden. Ein Druckregler kann verwendet werden, um eine gleichmäßige Aufladung aufrechtzuerhalten.

2. In-vitro-humanes iPSC-basiertes neuronales Netzwerk auf HD-MEA

HINWEIS: Alle in dieser Studie verwendeten iPSC-Neuronen werden kommerziell hergestellt (siehe Materialtabelle). Diese menschlichen Zellen unterschieden sich von stabilen iPS-Zelllinien, die aus menschlichem peripherem Blut oder Fibroblasten gewonnen wurden.

1. Beschichtung von HD-MEA-Chips für humane In-vitro-iPSC-Zellkulturen (Abbildung 2B)
   1. Platzieren Sie den HD-MEA-Chip auf der Erfassungsplattform, füllen Sie den Behälter mit PBS und testen Sie den Chip vor der Beschichtung. Starten Sie die Brainwave-Software. Wählen Sie Datei > Neue Aufnahmesitzung aus. Stellen Sie die Aufnahmeparameter auf eine Aufnahmefrequenz von 50 Hz und eine Abtastfrequenz von 18 kHz/Elektrode ein. Ändern Sie den Verstärker-Offset , um den Chip zu kalibrieren. In Tabelle 2 finden Sie Tipps zur Fehlerbehebung.
      HINWEIS: Die Parameter für die Aufnahmefrequenz und die Abtastfrequenz hängen vom Datentyp und den individuellen Systemanforderungen ab.
   2. HD-MEAs sterilisieren und vorkonditionieren.
      1. Wischen Sie den Chip und den Glasring unter der Haube mit einem mit 96 % Ethanol (EtOH) angefeuchteten Gewebe ab, legen Sie dann jedes Gerät in eine sterile 100 mm x 20 mm große Petrischale und füllen Sie das MEA-Reservoir 20 Minuten lang mit 70 % EtOH.
      2. Saugen Sie das EtOH an und waschen Sie das Reservoir 3 Mal mit sterilem, gefiltertem DD-Wasser. 1 ml Vorkonditionierungsmedium zugeben und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
         HINWEIS: Vorkonditionierungsmedien müssen eine Lösung auf Salzbasis sein, um die HD-MEA-Oberfläche hydrophiler zu machen. Dies kann zuvor vorbereitete BrainPhys (BP)-Komplettmedien (nicht >3 Monate alt) umfassen (Tabellen 1C).
   3. HD-MEAs beschichten. Am nächsten Tag Vorkonditionierungsmedien ansaugen. Fügen Sie 1 ml 0,1 mg/ml Poly-dl-Ornithin (PDLO) hinzu, um die gesamte aktive Fläche zu beschichten. Inkubieren bei 37 °C über Nacht in einem Inkubator.
   4. Bereiten Sie Medien vor und erwärmen Sie sie für RT. Die Protokolle hier nutzen funktionelle menschliche iPSC-Neuronen aus zwei kommerziellen Quellen; Daher variieren die Medienkomponenten für jeden Anbieter. Ein Protokoll ist in (Tabellen 1C, D) beschrieben.
   5. PDLO ansaugen, 3 mal mit dd-Wasser waschen und die Chips 10 min unter der Haube trocknen lassen.
   6. Füllen Sie eine 35 mm x 10 mm große Petrischale mit sterilem, gefiltertem DD-Wasser und stellen Sie sie neben den Chip, um die richtige Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und die Verdunstung der ausgesäten Zellen in den nächsten Schritten zu vermeiden.
2. Beschichtung und Aufrechterhaltung menschlicher iPSC-Neuronen in HD-MEAs (Abbildung 2B)
   1. Auftauen und Verdünnen Sie die Zellen auf die gewünschte Zellkonzentration pro Mikroliter (d. h. 1000 Zellen/μl, um 50.000 Zelldichte in einem 50-μl-Tropfen auf dem HD-MEA zu erhalten) (Tabelle 1C).
   2. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf der Oberfläche der aktiven Chipfläche mit hochlamininierten Punktierungsmedien (Tabelle 1D).
   3. Bei 37 °C mit 5 % CO₂ 45-60 min inkubieren.
   4. Füllen Sie vorsichtig 2 ml Medium in das HD-MEA-Reservoir (Tabelle 1C).
   5. Führen Sie einen 100%igen Medienwechsel an Tag 1 (DIV1) nach der Aussaat mit RT-Medien durch (Tabelle 1C). Wechseln Sie 50% der Medien alle 3-4 Tage. Lassen Sie HD-MEAs während des gesamten Experiments bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
      HINWEIS: Pipettieren Sie vorsichtig, um ein Lösen der Zellen zu vermeiden. Überprüfen Sie die Farbe des Mediums auf Verunreinigungen. Das Intervall und die Menge des Medienwechsels können durch individuelle Studienfragen oder Zellanforderungen/-spezifikationen bestimmt werden.
   6. Optional: Überprüfen Sie den Fortschritt des Zellkulturwachstums zwischen DIV4 und DIV8 unter einem aufrechten Differenzialinterferenzkontrastmikroskop (DIC), nachdem Sie den Tisch mit >70% EtOH gereinigt haben.

3. Ex-vivo - und In-vitro-Neuronale Aufzeichnungen in großem Maßstab mit HD-MEAs

1. Vorbereitung des Arbeitsbereichs für die Aufzeichnung von Hirnschnitten (Abbildung 2A)
   1. Während sich die Gehirnschnitte erholen, platzieren Sie die erforderlichen Werkzeuge in jedem dafür vorgesehenen Arbeitsbereich (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Das Hauptsystem-Setup muss lange vor dem Brain-Slice-Experimentiertag optimiert und getestet werden. Das Perfusionssystem (Einlassleitungen, Pumpenauslassleitungen, Schläuche und Erdung) muss mit PBS oder aCSF und einem HD-MEA auf der Aufzeichnungsplattform getestet werden, um ein sauberes Signal, ein erhöhtes Signal-Rausch-Verhältnis und kein Perfusionsrauschen zu gewährleisten.
   2. Beschichten Sie den HD-MEA-Chip mit 0,1 mg/ml PDLO, um die Gewebe-Chip-Kopplung zu verbessern, und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei 37 °C.
   3. Füllen Sie während der Chip-Inkubation das schwerkraftbasierte Perfusionssystem und die Linien mit Aufzeichnungs-aCSF. Stellen Sie eine kontinuierliche Carbogenation des Perfusionssystems sicher. Stellen Sie eine Durchflussrate von 4,5 ml/min und eine Temperatur von 37 °C ein.
   4. Platzieren Sie den HD-MEA-Chip auf der Aufnahmeplattform, füllen Sie das Reservoir mit aCSF, testen Sie das Perfusionssystem und beheben Sie alle verbleibenden Systemgeräusche.
      1. Starten Sie die Brainwave-Software. Wählen Sie Datei > Neue Aufnahmesitzung aus. Stellen Sie die Aufnahmeparameter auf eine Aufnahmefrequenz von 1 Hz und eine Abtastfrequenz von 14 kHz/Elektrode ein. Ändern Sie den Verstärker-Offset , um den Chip zu kalibrieren. In Tabelle 2 finden Sie Tipps zur Fehlerbehebung.
         HINWEIS: Die Parameter für die Aufnahmefrequenz und die Abtastfrequenz hängen vom Datentyp und den individuellen Systemanforderungen ab.
   5. Stellen Sie sicher, dass der Aufnahmebereich durch ein Raumbeleuchtungssystem oder einen schattigen Käfig auf dem optischen Tisch dunkel ist.
   6. Richten Sie das Stereomikroskop auf das HD-MEA-Chipreservoir und den aktiven Bereich für die Bildaufnahme aus.
   7. Setzen Sie den Anker in den Spänebehälter, um ihn auszugleichen.
      HINWEIS: Anchor ist eine maßgefertigte Platinharfe mit minimalen Drähten, um die Sauerstoffversorgung zu fördern; Es sind jedoch einige kommerzielle erhältlich.
   8. Geben Sie pharmakologische Verbindungen in die entsprechenden Perfusionsröhrchen.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden sowohl spontane als auch pharmakologisch induzierte 100-μM-4-Aminopyridin (4-AP)-Aufzeichnungen wie zuvor beschrieben erhalten. Pharmakologische Wirkstoffe können auf die spezifische Studienfrage zugeschnitten werden.
   9. Stellen Sie im Arbeitsbereich zur Vorbereitung von Gehirnschnitten eine neue 90-mm-Kunststoffkulturschale in eine 150-mm-Glas-Petrischale. Fügen Sie aCSF hinzu und beginnen Sie mit dem Carbogenieren.
2. Schaltungsweite Aufnahmen von HC- und OB-Slices mit HD-MEAs
   Anmerkungen: Die Scheibenkopplung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um einen Sauerstoffmangel an Sauerstoff in der Scheibe zu vermeiden. Die Kopplung sollte nur ~1 Minute von der ersten Platzierung der mikrodisparierten Schicht auf dem aktiven Bereich des Chips bis zum endgültigen Start des Perfusionssystems dauern.
   1. Nehmen Sie die Scheibe mit einer Glaspipette aus der Auffangkammer der Gehirnschnitte und legen Sie sie in eine 90-mm-Kunststoffkulturschale mit kontinuierlicher Aufkohlung. Isolieren Sie den HC oder OB mit einem Mikrodissektionswerkzeug vom umgebenden Hirnschnittgewebe.
   2. Bringen Sie die isolierten HC- oder OB-Akutschnitte mit einer Glaspipette in das HD-MEA-Reservoir. Richten Sie die Scheibe vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf dem aktiven MEA-Bereich aus. Saugen Sie alle Lösungen aus dem HD-MEA-Chip gut mit einem Absaugsystem an.
   3. Legen Sie den Anker vorsichtig mit einer Pinzette auf die Scheibe.
      Anmerkungen: Der Anker sollte ohne Scheibenbewegung platziert werden, um den Verlust der Kupplung zu vermeiden.
   4. Geben Sie vorsichtig Lösung in das Spänereservoir und starten Sie das Perfusionssystem.
      Anmerkungen: Stellen Sie eine laminare Strömung vom Perfusionseinlass und Pumpenauslass für optimale Aufnahmeparameter sicher.
   5. Stellen Sie sicher, dass der Aufnahmebereich durch das Raumbeleuchtungssystem oder mit einem schattigen Käfig auf einem optischen Tisch ausreichend gedimmt ist.
   6. Lassen Sie die Scheibe 10 Minuten lang akklimatisieren, bevor Sie mit der Aufnahme oder zusätzlichen pharmakologischen Modulation beginnen.
   7. Starten Sie die Brainwave-Software. Wählen Sie Datei > Neue Aufnahmesitzung aus. Stellen Sie die Aufnahmeparameter auf eine Aufnahmefrequenz von 1 Hz und eine Abtastfrequenz von 14 kHz/Elektrode ein. Ändern Sie den Verstärker-Offset , um den Chip zu kalibrieren.
      HINWEIS: Wie bereits in Abschnitt 3.1.4.1 beschrieben, stellen Sie bei der Durchführung von Systemtests sicher, dass dieselben Aufzeichnungsparameter angewendet werden.
   8. Drücken Sie die Aufnahmetaste , um die Aufnahme mit den voreingestellten Versuchsbedingungen zu beginnen.
   9. Nehmen Sie unmittelbar nach der endgültigen Aufnahme eine Lichtbildgebung des akuten Hirnschnitts auf. Bewegen Sie die Scheibe zurück in die Scheibenrückgewinnungskammer, entfernen Sie mit einer Bürste alle organischen Materialien, die mit dem Span verbunden sind, und fahren Sie mit der nächsten Scheibe fort. Reinigen Sie die HD-MEAs wie in Abschnitt 3.4 beschrieben.
3. Vorbereitung des menschlichen iPSC-Aufnahmearbeitsplatzes und netzwerkweiter Aufzeichnungen auf HD-MEA (Abbildung 2B)
   HINWEIS: Wechseln Sie das Medium entweder am Tag vor der Aufnahme oder unmittelbar nach der menschlichen iPSC-Aufzeichnung (Tabelle 1C). In Studien mit den funktionellen Neuronen wurde das Medium alle 4 Tage gewechselt, und bei 4, 8, 16 und 24 DIV wird das Medium unmittelbar nach iPSC-Aufzeichnungen gewechselt.
   1. Sorgen Sie für eine sterile Arbeitsumgebung, indem Sie die HD-MEA-Erfassungsplattform mit >70 % EtOH reinigen.
   2. Setzen Sie eine Polydimethylsiloxan (PDMS)-Basiskappe mit Referenz vorsichtig auf den HD-MEA-Ring unter der Haube. Verschieben Sie den HD-MEA-Chip in den iPSC-Aufnahmearbeitsbereich und befestigen Sie den HD-MEA-Chip an der Aufnahmeplattform.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Aufnahmebereich durch ein Raumbeleuchtungssystem oder einen schattigen Käfig auf einem optischen Tisch ausreichend gedimmt ist.
   4. Lassen Sie den HD-MEA-Chip 10 Minuten lang äquilibrieren, bevor Sie mit der Aufnahme oder zusätzlichen pharmakologischen Modulation beginnen.
   5. Starten Sie die Brainwave-Software. Wählen Sie Datei > Neue Aufnahmesitzung aus. Stellen Sie die Aufnahmeparameter auf eine Aufnahmefrequenz von 50 Hz und eine Abtastfrequenz von 18 kHz/Elektrode ein. Ändern Sie den Verstärker-Offset , um den Chip zu kalibrieren.
      HINWEIS: Wie bereits in Abschnitt 2.1.1 beschrieben, stellen Sie bei der Durchführung eines Systemtests vor dem Beschichten und Beschichten sicher, dass dieselben Aufzeichnungsparameter angewendet werden.
   6. Zeichnen Sie die spontane Feueraktivität oder pharmakologisch induzierte Reaktionen des menschlichen iPSC-Netzwerks an jedem Tag des Versuchsplans auf (d. h. 4, 8, 16, 24 DIVs).
      HINWEIS: Lassen Sie den Chip nicht >30 Minuten außerhalb des Inkubators bleiben, um eine stabile Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und einen Temperaturschock für die Zellen zu vermeiden.
   7. Inkubieren Sie HD-MEAs bei 37 °C mit 5 % CO₂ im Verlauf des Experiments.
   8. Befestigen Sie nach Abschluss des Experiments das neuronale Netzwerk auf Chips und färben Sie es für die weitere optische Bildgebung oder reinigen Sie die HD-MEAs direkt, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
4. Reinigung von HD-MEA-Chips
   1. Entsorgen Sie die Lösung nach dem Experiment entsprechend der ordnungsgemäßen Abfallentsorgung und spülen Sie sie mit dd-Wasser ab.
   2. Fügen Sie das Reinigungsmittel Ihrer Wahl hinzu, reinigen Sie den aktiven Bereich und den gesamten Behälter mit einem Wattestäbchen und entsorgen Sie das Reinigungsmittel. Mit Spülmittel nachfüllen, 20 Minuten inkubieren, dann Spülmittel wegwerfen.
   3. Gründlich mit Wasser in Laborqualität abspülen. Anschließend 3-4 mal mit dd-Wasser abspülen.
   4. Verwenden Sie Luftdruck, um den HD-MEA-Chip gründlich zu trocknen.

4. Analyse groß angelegter neuronaler Aufzeichnungen von HD-MEAs

HINWEIS: Während Schritt 4.1 softwarespezifisch ist, kann Schritt 4.2 basierend auf dem im Handel erhältlichen HD-MEA-Gerätetyp jedes Benutzers geändert werden.

1. Rohdatenvorverarbeitung und Ereigniserkennung
   1. Öffnen Sie eine aufgezeichnete Rohdatendatei (.brw) in der Brainwave-Software. Wählen Sie Analyse > LFP-Erkennung oder Spike-Erkennung.
      HINWEIS: Die LFP-Erkennung verwendet IIR-Filterung mit einem Tiefpass-Butterworth-Filter 4^. Ordnung (1-100 Hz). Harte Schwellenwertalgorithmen umfassen einen hohen Schwellenwert von 150 μV, einen niedrigen Schwellenwert von -150 μV, ein Energiefenster zwischen 70 und 120 ms, eine Refraktärzeit von 10 ms und eine maximale Ereignisdauer von 1 s. Die Einzel- und MUA-Spike-Erkennung verwendet IIR-Filterung mit einem Hochpass-Butterworth-Filter 4^. Ordnung (300-3500 Hz). Ein PTBS-Algorithmus wird mit einem Standardabweichungsfaktor von 8, einer maximalen Lebensdauer von 2 ms und einer Refraktärzeit von 1 ms angewendet.
   2. Fügen Sie für HC- und OB-Schaltkreisaufzeichnungen die Option "Erweiterter Arbeitsbereich " in der erkannten Ereignisdatei (.bxr) hinzu, um das vom Stereomikroskop aufgenommene strukturelle Lichtbild zu importieren. Wenn Sie großflächige HC-Schaltkreise untersuchen, erstellen Sie Strukturschichten, die den Gyrus dentatus (DG), den Hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), den entorhinalen Kortex (EC) und den perirhinalen Kortex (PC) enthalten. Erstellen Sie bei der Untersuchung großer OB-Schaltkreise Strukturschichten, die die olfaktorische Nervenschicht (ONL), die glomeruläre Schicht (GL), die äußere plexiforme Schicht (EPL), die Mitralzellschicht (MCL) und die Körnerzellschicht (GCL) enthalten. Betrachten Sie die EPL und die MCL als Projektionsschicht (PL), einschließlich des olfaktorischen Kortex (OCx).
2. Datenverarbeitung mit einer benutzerdefinierten Python-Berechnungspipeline
   1. Rauschunterdrückung
      1. Lesen Sie die .bxr-Datei mit einem benutzerdefinierten Python-Skript 26,29,32 und einem h5py 3.6.0-Python-Paket.
      2. Extrahieren Sie Spike-Züge, die sich auf die iPSC-Netzwerkaufzeichnungen beziehen, und LFP-Ereigniszüge, die sich auf die HC- und OB-Brain-Slice-Schaltungsaufzeichnungen beziehen.
      3. Charakterisieren Sie Ereignisse mit einer Gesamtzahl aktiver Elektroden von weniger als 0,1 % oder 10 % der durchschnittlichen aktiven Elektroden pro durchschnittlichem Ereignis oder erkannte Ereignisse, die außerhalb eines statistisch vernünftigen Feuerratenbereichs liegen, als zufällige Ereignisse und entfernen Sie sie. Wenden Sie außerdem Schwellenwerte für Amplitude und Ereignisdauer an.
         HINWEIS: Für den Feuerratenbereich werden 0,1-15 Spikes/s und 0,1-60 LFP-Ereignisse/min berücksichtigt. Dies sind Beispiele für Ratenschwellenwerte, die für die analysierten Datensätze verwendet werden. Die Schwellenwerte für Rate, Amplitude und Dauer hängen von den einzelnen Daten ab.
      4. Speichern Sie die resultierenden Ereigniszugdaten mit den zugehörigen räumlichen und zeitlichen Informationen im .npy-Dateiformat.
   2. Rastergramme
      1. Lesen Sie gefilterte .npy- und .bxr-Dateien und generieren Sie ein Rasterdiagramm mit der Matplotlib-Funktion pyplot (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Sortieren und gruppieren Sie außerdem für Hirnschnittaufnahmen mit Schichtspezifität die Elektroden-IDs basierend auf den in Schritt 4.1.2 erzeugten Schichten.
   3. Mittlere Brennaktivität
      1. Verarbeiten Sie die Zeitreihendaten aus der .bxr-Datei und berechnen Sie die durchschnittliche Zündrate jeder Elektrode (Anzahl der Ereignisse/Aufzeichnungszeit).
      2. Erstellen Sie eine Datenmatrix, in der die Zeilen und Spalten die Koordinaten der Elektroden im HD-MEA 64 x 64-Array darstellen, wobei jeder Matrixwert die mittlere Feuerrate angibt.
      3. Verwenden Sie eine Plotting-Bibliothek wie Matplotlibs imshow oder Seaborns Heatmap-Funktionen in Python.
      4. Verwenden Sie hier die "heiße" Farbkarte, um eine informative Heatmap zu erstellen, die die räumliche Verteilung der mittleren Feuerraten über das Elektrodenarray visuell kapselt.
   4. Repräsentative Wellenformspuren
      1. Lesen Sie Zeitreihendaten aus der .brw-Datei und generieren Sie eine Wellenformspur mit der Matplotlib-Funktion pyplot. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
      2. Geben Sie die gewünschte Elektroden-ID, den Zeitbereich und das Frequenzband für eine repräsentative Wellenformspur ein. Zu den in diesen Analysen definierten Frequenzbändern gehören niederfrequente LFP-Oszillationen (1-100 Hz) mit bandpassgefilterten δ-, θ-, β- und γ Frequenzbändern; scharfe Wellenwelligkeit (SWR) (140-220 Hz); und Hochfrequenz Single und MUA (300-3500 Hz). Die Frequenzbänder δ, θ, β und γ sind 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz bzw. 35-100 Hz.
   5. Spektrale Leistungsdichte
      1. Lesen Sie Zeitreihendaten aus der .brw-Datei und berechnen Sie die Periodogramme, um die dominanten Frequenzen zu erkennen, die der oszillatorischen Aktivität innerhalb jeder Zeitreihe zugrunde liegen.
      2. Erstellen Sie Pseudo-Farbspektrogramme der Frequenz-Zeit-Dynamik.
         HINWEIS: Spektren werden mit der Welch-Methode berechnet, indem die Fast-Fourier-Transformation aufgezeichneter LFPs verwendet wird, um die spektrale Leistungsdichte⁴¹ zu schätzen.
      3. Geben Sie die gewünschte Elektroden-ID, den Zeitbereich und das Frequenzband für eine spektrale Dichtekarte ein. Zu den in diesen Analysen definierten Frequenzbändern gehören die in Schritt 4.2.4 beschriebenen.
   6. Funktionale Konnektivität
      1. Führen Sie für Brain-Slice-Schaltungsaufzeichnungen die Schritte 4.2.6.2-4.2.6.4 aus.
      2. Lesen Sie Zeitreihendaten aus der .brw-Datei und berechnen Sie die Kreuzkovarianz zwischen Paaren aktiver Elektroden im 64 x 64-Array unter Verwendung des Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCC)⁴².
      3. Passen Sie ein vektorautoregressives Modell mithilfe der multivariaten Granger-Kausalität an die Zeitreihe an, um den Einfluss einer Zeitreihe auf eine andere zu quantifizieren.
      4. Wenden Sie die Directed Transfer Function (DTF) an, um den Richtungsinformationsfluss innerhalb der korrelierten Verbindungen zu bewerten.
         HINWEIS: Die funktionale Konnektivität im mehrschichtigen Netzwerk wird durch Festlegen eines Korrelationswertschwellenwerts hergestellt, der auf denen über dem Mittelwert und zwei Standardabweichungen aller Kreuzkovarianzwerte ^43,44 basiert.
      5. Führen Sie für die iPSC-Aufzeichnung die Schritte 4.2.6.6-4.2.6.8 aus.
      6. Lesen Sie Spiketrains-Daten aus der .bxr-Datei und berechnen Sie eine 64x64-Matrix der PCC-Korrelationskoeffizienten zwischen allen Kombinationen von Spike-Zügen mit spike_train_correlation Funktionen (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
         HINWEIS: Die funktionale Konnektivität im mehrschichtigen Netzwerk wird durch Festlegen eines Korrelationswertschwellenwerts hergestellt, der auf denen über dem Mittelwert und zwei Standardabweichungen aller Kreuzkovarianzwerte basiert.
      7. Implementieren Sie außerdem räumlich-zeitliche Filter (STF) und entfernungsabhängige Latenzschwellen (DdLT) in der Konnektivitätsmatrix, um potenzielle gepaarte Verbindungen zu eliminieren, die die maximale Ausbreitungsgeschwindigkeit (festgelegt auf 400 mm/s) ^{überschreiten45}.
      8. Extrahieren Sie negative Peaks aus resultierenden Kreuzkorrelationsmatrizen mit Filter- und Schwellenwertoperationen, um die inhibitorischen Verbindungen unter Verwendung des FNCCH-Algorithmus (Filtered and Normalized Cross-Correlation Histogram)⁴⁵ zu identifizieren.
      9. Transformieren Sie jede Konnektivitätsmatrix in eine dynamische Diagrammdatei (.gexf).
   7. Karten der Netzwerkkonnektivität
      1. Offenes Datenlabor im Gephi-Programm 9.2 Version (https://gephi.org) für den dynamischen Graphen zum Zeichnen bestimmter Zeitabschnitte.
      2. Wenden Sie Geo-Layout im Layout-Fenster für die räumliche Zuordnung an.
      3. Platzieren Sie Parameterbeschränkungen für den Gradbereich und die Kantenstärke zum Vergleich.
      4. Weisen Sie Knotenfarbe, Kantengröße und Gradgröße für eine bessere Visualisierung zu.

Raumzeitliche Abbildung mehrerer Modelle und Extraktion von oszillatorischen Feuerungsmerkmalen
Um netzwerkweite LFP- und Spike-Ereignisse zu quantifizieren, die aus dynamischen neuronalen Ensembles hervorgingen, untersuchten wir synchrone großräumige Feuermuster in HC- und OB-Schaltkreisen und menschlichen iPSC-Netzwerken. Aufgezeichnete Gehirnschnittschaltkreise aus Schritt 3.2 und aufgezeichnete iPSC-Netzwerke aus Schritt 3.3 wurden gemäß den Schritten 4.1-4.2 des Protokolls analysiert. Zunächst wurden Ereigniserkennung und Rauschunterdrückung für alle aufgezeichneten Datensätze durchgeführt und gemäß den Schaltungsspezifikationen regional aufgelöst. Als nächstes wurden topographische räumliche Pseudofarbenkartierungen von mittleren großräumigen LFP- und Spike-Feuermustern, Rastergramme der erkannten Ereignisse und repräsentative 5-s-Spuren gefilterter Wellenformen aufgetragen (Abbildungen 3 A-I). Topographische Pseudo-Farbkartierungen von großflächigen LFP- und Spike-Feuerratenmustern wurden mit den jeweiligen mikroskopisch aufgenommenen optischen Bildern von HC (Abbildung 3A), OB (Abbildung 3B) und humanem neuronalem iPSC-Netzwerk (Abbildung 3C) überlagert. Dies ermöglicht die Untersuchung einzelner schaltungs- und netzwerkbasierter Oszillationsmuster und -antworten. HC- und OB-Rastergramme enthalten die Anzahl der erkannten LFP-Ereignisse, die über die DG-, Hilus-, CA3-, CA1-, EC- und PC-Schichten des HC-Schaltkreises und die ONL-, OCx-, GL-, PL- und GCL-Schichten des OB-Netzwerks über einen 60-s-Zeitbereich sortiert sind (Abbildungen 3D, E). Das menschliche iPSC-Rastergramm zeigt synchron erkannte Spike-Ereignisse des miteinander verbundenen kultivierten Netzwerks über einen Zeitbereich von 20 s an (Abbildung 3G). Als nächstes zeigen 5s-repräsentative Ereignisspuren von großflächigen HD-MEA-Aufnahmestellen einen Bereich von aufgezeichneten Schwingungsfrequenzen in den HC- (d. h. ausgewählte Elektrode in CA3) (Abbildung 3G) und OB (d. h. ausgewählte Elektrode in GL) (Abbildung 3H) Schaltkreisen und Multiunit-Spike-Bursting-Aktivität im menschlichen iPSC-Netzwerk von vier ausgewählten aktiven Elektroden im Array (Abbildung 3I). Diese beispielhaften Signale zeigen Biosignalsignaturen, einschließlich niederfrequenter LFP-Oszillationen (1-100 Hz) mit bandpassgefilterten δ-, θ-, β- und γ Frequenzbändern; scharfe Wellenwelligkeit (SWR) (140-220 Hz); und Hochfrequenz Single und MUA (300-3500 Hz). Schließlich wurde eine PSD-Analyse (Power Spectral Density) durchgeführt, um gleichzeitig die Leistungsgröße eines bestimmten Oszillationsbandes in der von HD-MEA aufgezeichneten verschalteten HC- und OB-Schaltung zu quantifizieren (Abbildungen 3J, K).

Multimodales netzwerkweites funktionales Konnektom
Um die großflächige Konnektivität von mehrschichtigen neuronalen Netzen aus gleichzeitig feuernden Mustern gleichzeitig aktiver neuronaler Ensembles abzuleiten, wurde die Kreuzkovarianz zwischen Paaren aktiver Elektroden in detektierten Ereignissen gemäß Schritt 4.2.6 des Protokolls berechnet. Hier wurde der Korrelationskoeffizient basierend auf Schichten im HC- und OB-Kreis oder unsortiert im iPSC-Netzwerk sortiert und dann in einer symmetrischen Matrix gespeichert. Funktionelle Konnektome von HC- und OB-Schaltkreisen wurden durch Anwendung der multivariaten Granger-Kausalität und der gerichteten Übertragungsfunktion (DTF) erzeugt, um den Einfluss einer Zeitreihe auf eine andere zu quantifizieren und den gerichteten Informationsfluss innerhalb der korrelierten Verbindungen in den verschiedenen Netzwerken zu bewerten. Das Konnektom-Mapping von HC (Abbildung 4A) und OB (Abbildung 4B) und die Netzwerkvisualisierung wurden mit dem Gephi-Programm 9.2 Version (https://gephi.org) durchgeführt. Ähnliche Parameterbeschränkungen wurden auf die funktionellen Verbindungen gelegt, um die HC- und OB-Brain-Slice-Schaltkreise zu vergleichen, und 100 s der funktionellen Konnektivität der detektierten LFP-Ereignisse veranschaulicht. Die Knoten werden nach Grad Stärke skaliert, wobei die Knotenfarbe die Schicht anzeigt und die Verbindungsfarbe die Verbindungen innerhalb und zwischen den Schichten kennzeichnet. Funktionelle Konnektome menschlicher iPSC-Netzwerke wurden durch die Anwendung von räumlich-zeitlichen Filtern (STF) und entfernungsabhängigen Latenzschwellen (DdLT) erzeugt, um die Auswahl signifikanter Verbindungen zu verbessern und die Identifizierung sinnvoller Verbindungen durch die Anwendung gefilterter und normalisierter Kreuzkorrelationshistogramme (FNCCH) zu verfeinern. Konnektom-Mapping von menschlichen iPSC-Netzwerken auf dem gesamten HD-MEA-Chip (Abbildung 4C) Visualisierung mit Gephi. Die Knotenfarbe zeigt erregenden oder hemmenden Input an, und die Verbindungsfarbe kennzeichnet Verbindungen.

Abbildung 1: Überblick über die experimentelle und rechnerische Plattform für großflächige HD-MEA. (A) Isometrische schematische Darstellung unserer multimodalen biohybriden neuroelektronischen Plattformen, die mit CMOS-basiertem HD-MEA realisiert wurden, um die neuronale Dynamik von neuronalen Schaltkreisen und Netzwerken von HC, OB und humanen iPSC zu erfassen. (B) Schematischer Arbeitsablauf für das Schneiden von Mäusegehirnen und seine Arbeitsumgebung zur Gewinnung von HC- und OB-Schnitten. (C) Topographische Darstellungen der großflächigen Feuermuster, die gleichzeitig von den gesamten HC- und OB-Schichten aufgezeichnet wurden, die mit den extrahierten extrazellulären Wellenformen zu den optischen Schichtbildern überlagert wurden. (D) Schematische Darstellung des neuronalen Netzwerks iPSC, das vom Menschen erhalten wurde. (E) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die zelluläre c-fos und somatische/dendritische MAP-2 des gesamten menschlichen neuronalen Netzwerks auf dem HD-MEA-Chip (links) zeigen, abgeglichen mit der gesamten Karte der durchschnittlichen Feueraktivität (rechts). (F) Computerrahmen einschließlich erweiterter Datenanalyse, Konnektivitätskartierung und KI-Machine-Learning-Tools zur Analyse mehrdimensionaler neuronaler Daten, die aus groß angelegten Aufzeichnungen auf HD-MEAs gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Layouts für die Vorbereitung und Aufzeichnung von Ex-vivo-Hirnschnitten und menschlichen In-vitro-iPSC-Kulturen . (A) Schematischer Arbeitsablauf, der den Aufbau für die Vorbereitung von HC- und OB-Schnitten mit den erforderlichen Werkzeugen und Geräten in jedem Arbeitsbereich veranschaulicht. (B) Schematische Darstellung für die Vorbereitung menschlicher iPSC-Kulturen, einschließlich der erforderlichen Werkzeuge und Geräte. Eine vollständige Liste der Materialien finden Sie in den Schritten 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 und in der Materialtabelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Kartierung und Extraktion raumzeitlicher Muster der Netzwerkdynamik. (A-C) Mittlere LFP- und Spike-Rate-Raumkarten, berechnet über fünfminütige Aufnahmen, überlagert mit dem Mikroskoplichtbild. (D-F) Rasterdiagramme, die erkannte, entrauschte LFP-Ereignisse in einer 60-Sekunden-Datenteilstichprobe und Spitzen in einer 20-Sekunden-Datenteilstichprobe darstellen. (G-I) Repräsentative Wellenform-Trace-Extraktion aus einem 5-Sekunden-Segment der Rasterplot-Datenunterprobe (im Rasterplot rot hervorgehoben), dargestellt als rohe LFP-Oszillationsbänder (1-100 Hz); δ (1-4 Hz), θ (5-12 Hz), β (13-35 Hz) und γ (35-100 Hz) Frequenzbänder; SWR (140-220 Hz); und hochfrequentes Single- und MUA-Spiking (300-3500 Hz). (J,K) Leistungsspektrale Dichtekarten von schnellen und langsamen oszillierenden LFPs (1-100 Hz) und SWR (140-220 Hz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Organisation multimodaler netzwerkweiter funktionaler Konnektome. (A-C) Gephi-Karten, die die funktionale Konnektivität von Knotenpunkten veranschaulichen, wobei die Knoten einer der Beispiellegenden für Farbbalken (unten) entsprechen, während die Verbindungen (oder Kanten) schattiert sind, um den Verbindungsknoten zu entsprechen. Beispiellegenden für (A) HC-, (B) OB- und (C) iPSC-Layer werden auf einem 64 x 64-Array angezeigt. HC- und OB-Layer werden über einen Zeitbereich von 100 Sekunden aufgetragen, um die Anzahl der sichtbaren Knoten und Links für Visualisierungszwecke effektiv zu reduzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Lösungen für die Präparation von Hirnschnitten und Medien für neuronale iPSC-Kulturen. (A) Schneidlösung mit hohem Saccharosegehalt für die Ex-vivo-Präparation von Hirnschnitten. (B) aCSF-Aufzeichnungslösung für die Ex-vivo-Präparation und -Aufzeichnung von Hirnschnitten. (C-D) Humanes neuronales iPSC-Medienprotokoll, wobei (C) das vollständige BrainPhys-Medium ist, das für das Auftauen von Zellen, die HD-MEA-Chipbeschichtung und die kultivierte HD-MEA-Wartung verwendet wird, und (D) das Punktierungsmedium, das für die HD-MEA-Zellbeschichtung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Fehlerbehebung bei häufigen Problemen bei der Erfassung von HD-MEA-Aufnahmen. Eine Liste häufiger Probleme, ihrer möglichen Ursachen und Lösungen zur Fehlerbehebung im Zusammenhang mit HD-MEA-Chips, Aufzeichnungsplattformen, Systemgeräuschen und Software. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.