Dieser Artikel stellt einen Leitfaden für die Probenahme von sechs wichtigen und unterschiedlichen Organen bei erwachsenen Xenopus vor, auf die schnell und einfach zugegriffen werden kann: Herzventrikel, Leberlappen, Bauchspeicheldrüse, Fettkörper, paarige Nieren und Haut.
Methodenartikel
Techniken zur schnellen Probenahme von sechs wichtigen Organen bei erwachsenen Xenopus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Xenopus ist seit über hundert Jahren ein leistungsfähiger Modellorganismus für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Während die experimentelle Analyse und die Präparierungstechniken des Embryos gut dokumentiert sind, wurden die Beschreibungen der adulten Xenopus-Strukturen und -Organe sowie die Techniken für die Arbeit mit adulten Embryonen nicht aktualisiert, um den Anforderungen moderner Ansätze wie der quantitativen Proteomik und der Einzelzell-Transkriptomik Rechnung zu tragen. Die zelltyp- und genzentrierte Perspektive erfordert einen Kontrast zu Beobachtungen in embryonalen Stadien und in adulten Geweben. Die Organe der Larve erleiden signifikante Veränderungen in ihrer Gesamtstruktur, Morphologie und anatomischen Lage während des Übergangs von der Larve zum Erwachsenen, vor allem während des massiven Metamorphose-Umbaus. Die Etablierung robuster Standards für die Identifizierung und Dissektion von Organen ist von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Datensätze, die aus Studien stammen, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, konsistent sind. Das vorliegende Protokoll identifiziert sechs der Organe im adulten Xenopus und demonstriert Verfahren zur Dissektion und Probenahme des Herzventrikels, der Leber, des Fettkörpers, der Bauchspeicheldrüse, der paarigen Niere und der Haut des adulten Xenopus. Abhängig von den Konservierungsmethoden können die präparierten Organe für die quantitative Proteomik, Einzelzell-/Kern-Transkriptomik, in situ Hybridisierung, Immunhistochemie, Histologie usw. verwendet werden. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Gewebeentnahme zu standardisieren und Untersuchungen der adulten Organsysteme in mehreren Laboren zu erleichtern.
Einleitung
Obwohl die "digitale Dissektion" von adultem Xenopus" verfügbar ist1, bleibt die replizierbare Organ- und Gewebeentnahme von adultem Xenopus ohne die detaillierte Anleitung, die für andere adulte Modelle (z. B. Mäuse 2,3,4) verfügbar ist, eine Herausforderung. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine klare Anleitung für eine genaue und replizierbare Organprobenahme von adulten Xenopus zu geben, ähnlich wie sie derzeit für ihre Larven verfügbar ist5. Der Schwerpunkt liegt auf der einfachen Vervollständigung, um maximale Aktualität zu erhalten und das Protokoll für alle Benutzer zugänglich zu machen.
Obwohl es eine gründliche Sezieranleitung für Rana sp.6 sowie zahlreiche Präparieranleitungen für andere Anurans7 gibt, ist derzeit keine Xenopus-Präparier- und Probenahmeanleitung verfügbar. Für diejenigen, die mit den Probenahmepraktiken oder der Anatomie von Amphibien nicht vertraut sind, machen die kleinen Unterschiede zwischen Xenopus und anderen Anuren diese Ressourcen suboptimal für replizierbare Gewebeproben.
Viele wertvolle Gewebe sind nicht enthalten und werden in diesem Leitfaden sogar verworfen; Dies dient dazu, die Frische des Gewebes zu gewährleisten. Sechs Proben sind begrenzt genug, um sicherzustellen, dass diese Gewebe in weniger als einer Stunde nach Beginn des Herzschlags entnommen werden können, unabhängig von der Erfahrung oder dem Können des Benutzers. Fortgeschrittenere und detailliertere Anleitungen zum Sammeln vieler anderer Taschentücher sind als separate Begleitpapiere in Vorbereitung.
Für weniger erfahrene Anwender wird immer empfohlen, dieses Protokoll zuerst an Tieren zu versuchen, die aus anderen Gründen als Experimenten euthanasiert werden, bevor Tiere entnommen werden, die schwer zu ersetzen sind (z. B. Transgene, Tiere fortgeschrittenen Alters usw.). Im Idealfall sind alle beprobten Tiere gesund und, wenn es sich um weibliche Tiere handelt, in den letzten zwei Wochen keinen Eisprung gehabt.
Protokoll
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt. Die repräsentativen Ergebnisse sind sowohl für ein perfundiertes als auch für ein nicht durchblutetes reifes Albino-Männchen Xenopus laevis dargestellt.
1. Experimentelle Vorbereitung
HINWEIS: Wenn vor der Probenahme das Perfusionsprotokoll8 befolgt wird, fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
- Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasietechnik genehmigt hat.
- Eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricain-Methansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat (siehe Materialtabelle) herstellen. Das Volumen muss größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig abzudecken. Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.
- Führen Sie eine primäre Sterbehilfe durch, indem Sie den Xenopus in die Euthanasielösung legen; Das Tier bleibt insgesamt 1 h unter Wasser.
- Richten Sie die Präparierstation so ein, dass alle Gewebe unmittelbar nach der Probenahme in gekühltem PBS oder 0,7x PBS9 (je nach experimentellem Bedarf) gespült, kontrolliert und unter einem Licht mit 5-facher (oder mehr) Vergrößerung getrimmt werden können. Diese Station muss es dem Benutzer auch ermöglichen, entweder alle Zangen und Scheren auszutauschen oder sie zwischen den Anwendungen sauber zu wischen.
- Sobald sich der Frosch 1 h in der Lösung befunden hat, ist die primäre Sterbehilfe abgeschlossen. Entfernen Sie den Frosch und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion, indem Sie einen Fuß kneifen.
- Notieren Sie die entsprechenden Details für das Tier, wie z. B. Art, Stamm, Geschlecht, Alter und Gesundheitszustand sowie ob es perfundiert wurde. Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie zusätzliche Messungen vor, wie z. B. die Länge der Schnauze.
- Setzen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie die Gliedmaßen proximal zum Körper fest (Abbildung 1).
- Schneide mit einer Präparierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, wobei du zwei Laschen machst.
- Identifizieren Sie in Abbildung 2 die Linea alba und greifen Sie sie mit einer Pinzette und ziehen Sie sie aus der Zölomhöhle weg. Die Muskulatur vorsichtig mit einer Schere durchschneiden. Machen Sie zwei Laschen aus der Hohlwand. Schneiden oder stecken Sie alle Laschen aus dem Weg.
- Identifiziere das Herz, das noch schlagen wird. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Coracoidknochen zu verkleinern (Abbildung 2), um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten.
HINWEIS: Wenn das Herz vor der Probenahme aufgehört hat zu schlagen, ist zu beachten, dass die Frische der Probe beeinträchtigt wurde.
2. Probenahme
HINWEIS: Wenn das Tier durchblutet wurde, fahren Sie mit Schritt 2.2 fort.
- Identifizieren Sie das dünne Perikard und ziehen Sie es mit einer Gewebezange straff (Abbildung 3).
- Perforieren Sie das Perikard vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu durchtrennen. Schälen Sie das Perikard von den 3 Kammern des Herzens ab.
- Fassen Sie den Ventrikel mit einer Pinzette an der Spitze, identifizieren Sie, wo er an den Ohrmuscheln und dem arteriellen Stamm befestigt ist (Abbildung 4) und schneiden Sie ihn unterhalb dieser Ansätze ab (Abbildung 5). Trimmen Sie den Ventrikel bei Bedarf so, dass kein Gewebe aus den Ohrmuscheln oder dem arteriellen Stamm sichtbar ist und im Inneren des Ventrikels noch helles Klappengewebe sichtbar ist.
HINWEIS: Bei nicht durchbluteten Tieren kann die Entfernung des Ventrikels als sekundäre Euthanasie eingestuft werden. - Die 3 Leberlappen sind sichtbar (Abbildung 6 und Abbildung 7). Fassen Sie die Lippe des linken Lappens (rechts des Betrachters) und heben Sie sie vorsichtig an, so dass die Leber- und Zystengänge sichtbar sind (Abbildung 8). Nehmen Sie Proben aus dem unteren 1/3 des Lappens unterhalb dieser Aufsätze (Abbildung 9).
- Um einen besseren Zugang zum Gewebe eines weiblichen Frosches zu erhalten, ist es hilfreich, den Eierstock zu entfernen. Identifizieren Sie den Eierstock, der von einer Schicht viszeralem Peritoneum umhüllt ist, die als Keimepithel bezeichnet wird. Verschieben Sie die Lappen vorsichtig, bis sie auf den jeweiligen Seiten liegen, um den Bereich der Befestigung sichtbar zu machen (Abbildung 10). Diese Ansätze befinden sich direkt ventral der paarigen Niere.
- Entfernen Sie mit einer Schere die Eierstöcke so nah wie möglich an den Nieren, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 11).
- Untersuchen Sie den Mediallappen (auch Frontlappen genannt) der Leber und beachten Sie, wie er durch das Mesenterium und den Ductus hepatopancreaticum (auch gemeinsamer Gallengang genannt) mit dem Magen und dem Zwölffingerdarm verbunden ist (Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8).
- Durchtrennen Sie das Mesenterium, das Ligamentum hepatoduodenalis mit einer Iridektomieschere sowie den Gang hepatopankreaticus an der Stelle, an der er auf den Zwölffingerdarm trifft. Die Verbindung der Bauchspeicheldrüse und des Ductus hepatopancreaticus mit dem Mediallappen der Leber wird durchtrennt, so dass kein dunkles Lebergewebe anhaftet (Abbildung 12).
- Fassen Sie den Magen mit einer Zahnzange und das obere Ende der Bauchspeicheldrüse mit einer Gewebezange. Bei 5-facher Vergrößerung die Bauchspeicheldrüse vorsichtig vom Magen abziehen (Abbildung 13).
HINWEIS: Wenn es sich nicht sauber löst, ist das verbleibende Pankreasgewebe sichtbar und kann in Fragmenten abgerissen werden. Alternativ kann die Bauchspeicheldrüse methodisch mit einer Iridektomieschere und einer Gewebezange abgelöst werden. - Identifizieren Sie in Abbildung 14A die Harnblase und entfernen Sie sie, indem Sie so nah wie möglich an der Kloake schneiden. Entsorgen Sie dieses Taschentuch.
- Identifizieren Sie in Abbildung 14B den Dickdarm und ziehen Sie ihn straff, um den Dickdarm so nah wie möglich an der Kloake zu durchtrennen. Entfernen und entsorgen Sie den gesamten Verdauungskanal, indem Sie das Bauchfell durchtrennen, wo es an der Milz befestigt ist. Die Fettkörper werden nun vollständig zugänglich sein.
- Toupieren Sie die Fettkörper auseinander, so dass sie auf den jeweiligen Seiten liegen. Der Bereich über der Niere, wo der Fettkörper mit dem Bauchfell verbunden ist, wird sichtbar sein. Fassen Sie die Basis des linken Fettkörpers (rechts des Betrachters) und schneiden Sie ihn mit einer Schere vom Bauchfell ab, wobei Sie einen kleinen Rand lassen, damit die Niere nicht beschädigt wird (Abbildung 15).
- Entfernen Sie den restlichen Fettkörper und entsorgen Sie ihn. Die gekoppelten Nieren sind nun vollständig sichtbar.
- Bei weiblichen Fröschen oder Männchen mit ausgeprägten verkümmerten Eileitern fassen Sie einen Eileiter und ziehen ihn von der Niere und der Kloake weg (Abbildung 16). Schneide den Eileiter an der Stelle, an der er auf die Kloake trifft, und ziehe ihn weiter von der Niere weg, wobei du alle durchsichtigen Peritonealansätze durchtrennst, sobald sie sichtbar werden. Entsorgen Sie dieses Taschentuch.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem restlichen Eileiter.
- Die Nieren sind noch mit klarem Peritoneum (retroperitoneal)10 bedeckt. Fassen Sie die Nieren mit einer Zange und durchtrennen Sie das Bauchfell an ihrem unteren Ende.
- Heben Sie die Nieren aus der Zölomhöhle und durchtrennen Sie das Peritoneum mit einer Schere so nah wie möglich an den Nieren, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 17).
- Schneiden Sie bei 5-facher Vergrößerung überschüssiges Bauchfell und anderes restliches Gewebe (Fettkörper, Milz) weg. Wenn es sich bei dem Frosch um ein Weibchen handelt, stellen Sie sicher, dass das restliche Eierstockgewebe entfernt wird (Abbildung 18). Wenn es sich um einen männlichen Frosch handelt, entfernen Sie vorsichtig den Hoden und suchen Sie nach einem verkümmerten Eileiter, der ohne Vergrößerung möglicherweise nicht sichtbar ist (Abbildung 19).
- Entfernen Sie die Stifte vom Tier, drehen Sie es auf sein Ventral und stecken Sie die Gliedmaßen des Tieres wieder fest.
- Wählen Sie eine der hinteren Gliedmaßen aus, aus denen die Probe entnommen werden soll, und stecken Sie den Fuß dieser Gliedmaße fest.
- Entfernen Sie einen mandelförmigen Hautlappen über dem Gastrocnemius/Tibiofibula (Abbildung 20).
Ergebnisse
Unter Verwendung von Abbildung 1 bis Abbildung 20 und unter Befolgung aller Schritte dieses Protokolls wurden der Herzventrikel, der linke Leberlappen, die Bauchspeicheldrüse, die linken Fettkörper, die paarigen Nieren und ein Hautlappen innerhalb einer Stunde nach der Euthanasie sauber herausgeschnitten. Innerhalb dieser Zeit werden die Proben gespült und getrimmt, so dass sie erscheinen, wie in Abbildung 21 gezeigt.
Abbildung 1: Angehefteter Xenopus. Ein ausgewachsenes Weibchen X. tropicalis steckt durch jedes Glied. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bauchdecke. Die Bauchhaut eines X . tropicalis-Weibchens ist in Lappen geschnitten, wodurch die Linea alba und die Coracoideusknochen sichtbar werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Perikard umschlossenes Herz. Die Spitze des Herzventrikels wird durch das Perikard gegriffen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Herzventrikel und arterieller Trunc. Der Ventrikel eines perfundierten X laevis wird gegriffen und zeigt seine Befestigung am Arterienstamm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Herzdiagramm. Ein Diagramm der relevanten Strukturen des Herzens mit einer gestrichelten Linie, die angibt, wo die Probe des Ventrikels entnommen werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Hepatopankreasdiagramm. Ein Diagramm der 3 Lappen der Leber, der Bauchspeicheldrüse und der zugehörigen Organe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Hepatopankreasorgane. Ein durchblutetes Albino X. laevis-Männchen mit 3 Leberlappen, Bauchspeicheldrüse und zugehörigen Organen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Zystische und hepatische Gänge. Der linke Leberlappen wird angehoben, um die zystischen und hepatischen Gänge bei perfundierten X. laevis zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Leberprobenahme. Der linke Leberlappen eines nicht durchbluteten X. tropicalis wird unter den Ansätzen der Lebergänge durchtrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Ansatz der Eierstöcke. Mit den Eierstocklappen auf ihren jeweiligen Seiten ist die Kontinuität des Keimepithels zur Peritonealwand (über den Nieren) sichtbar. Zwei weiße gestrichelte Linien zeigen an, wo diese Anhänge durchtrennt werden sollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Entfernung der Eierstöcke. Der Eierstock einer nicht perfundierten X. laevis wird von den paarigen Nieren weggezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12: Mesenterienschnitte. Die Zölomhöhle eines nicht perfundierten X. laevis nach der Probenahme des Herzventrikels und des linken Leberlappens sowie der Entfernung des Eierstocks. Eine weiße gestrichelte Linie zeigt an, wo das hepatopankreatische Band und der Ductus durchtrennt werden sollen, während eine grüne gestrichelte Linie anzeigt, wo die Bauchspeicheldrüse vom Mediallappen der Leber durchtrennt werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 13: Probenahme der Bauchspeicheldrüse. Die Bauchspeicheldrüse eines nicht durchbluteten X. laevis wird vom Magen abgerissen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 14: Organentnahme. (A) Die Harnblase eines nicht durchbluteten X. laevis wird von der Kloake weggezogen, wobei eine gestrichelte Linie anzeigt, wo sie geschnitten werden soll. (B) Der Dickdarm eines nicht durchbluteten X. laevis wird von der Kloake weggezogen, wobei eine gestrichelte Linie anzeigt, wo er durchtrennt werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 15: Fett-Körper-Probenahme. Die Fettkörper, die am oberen Ende der gekoppelten Nieren am Peritoneum befestigt sind, werden aus der Zölomhöhle gezogen, wobei eine gestrichelte Linie zeigt, wo sie geschnitten werden sollen. Beachten Sie, dass dieses Männchen X. tropicalis neben diesem Ansatz 1 Hoden sowie ein Paar unterschiedlicher verkümmerter Eileiter hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 16: Entfernung des Eileiters. Der Eileiter einer perfundierten X. laevis wird von der paarigen Niere weggezogen, wodurch das klare Peritoneum sichtbar wird. Eine gestrichelte Linie zeigt an, wo das Bauchfell eingeschnitten werden soll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 17: Nierenprobenahme. Die paarigen Nieren eines nicht perfundierten X. laevis werden aus der Zölomhöhle gehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 18: Nierentrimmung. (A) Eine ventrale Ansicht einer nicht durchbluteten weiblichen Paarniere von X. laevis mit angeschlossenen Peritonealorganen. (B) Dieselbe Niere mit entfernten zugehörigen Organen, aber mit etwas Peritonealgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 19: Entfernung der Hoden. Die paarigen Nieren von nicht durchbluteten X. tropicalis , bei denen ein Hoden entfernt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 20: Hautprobenahme. (A) Das rechte Bein eines X. tropicalis mit einer gestrichelten Linie, die den zu beprobenden Hautbereich angibt. (B) Das rechte Bein eines X. tropicalis mit einer Hautprobe, die über dem Tibiofibula entnommen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 21: Repräsentative Ergebnisse der Organentnahme. Proben von Herzventrikel, Leber, Bauchspeicheldrüse, Fettkörper, paariger Niere und Haut von einem perfundierten und nicht durchbluteten Albino X. laevis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Diskussion
Da dieses Protokoll darauf abzielt, die Frische zu maximieren, können einige Proben unerwünschtes Gewebe enthalten. Zum Beispiel werden der Ductus hepatopankreaticus und einige Mesenterien mit der Bauchspeicheldrüse entnommen, und etwas Peritonealgewebe, Nebennieren und Harnleiter werden immer mit den paarigen Nieren entnommen. Wenn die Frische keine Rolle spielt, kann mit modifizierten Techniken eine genauere Probenahme erreicht werden.
Das Aussehen und die Lage der Organe sind zwischen Geschlechtern und Arten von Xenopus vergleichbar. Die Farbe des Gewebes variiert jedoch erheblich, je nachdem, ob die Tiere perfundiert wurden oder nicht. Aus diesem Grund werden sowohl Bilder von durchbluteten als auch von nicht durchbluteten Tieren aufgenommen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit Vorrang vor der Entnahme von Proben haben, die die Gesamtheit des gewünschten Gewebes am besten repräsentieren. Zum Beispiel kann der hier entnommene Abschnitt des linken Leberlappens nicht alle drei Lappen des Lebergewebes adäquat darstellen. Wenn es Fehler bei der Probenahme gibt, werden die Optionen zur Fehlerbehebung durch das Potenzial für Variationen zwischen verschiedenen Gewebeabschnitten beeinträchtigt. Zum Beispiel ist nicht bekannt, ob der rechte Leberlappen, der rechte Fettkörper oder ein anderer Teil der Haut funktionelle Alternativen zu den gewünschten Geweben wären. In diesen Fällen sollte auf der Grundlage der Erfordernisse der Forschung Diskretion walten gelassen werden, bevor Gewebeabschnitte ersetzt werden.
Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die Organe in der Zölomhöhle möglicherweise nicht wie hier beschrieben aussehen, wenn die zu beprobenden Tiere drastische anatomische Defekte oder klinisch signifikante gesundheitliche Probleme aufweisen. Granulome wurden im Gewebe von Fröschen gefunden, die mit Mycobacterium spp. infiziert waren11,12, und frühere Fälle von ovariellem Hyperstimulationssyndrom scheinen zu einer abnormalen Präsentation der Organe zu führen13.
Obwohl diese Methode für Labor-Xenopus entwickelt wurde, gibt es signifikante Ähnlichkeiten im Aussehen dieser Organe bei vielen nicht-caecilianischen Amphibien und gliedrigen Reptilien14. Der Probenahmeteil dieses Protokolls könnte leicht für andere Modelle, wie z.B. Axolotl oder die grüne Anol, modifiziert werden.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch das OD Grant R24OD031956 des NIH unterstützt. Wir danken Samantha Jalbert, Jill Ralston und Cora Anderson für ihre Hilfe und Unterstützung sowie unseren Redakteuren und anonymen Peer-Reviewern für ihr hilfreiches Feedback
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Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
