Wir beschreiben ein Protokoll zur Extraktion hochwertiger Zellkerne aus kryokonservierten induzierten pluripotenten Stammzelltypen, die aus Stroma-/Endothel- und Blutzelltypen gewonnen wurden, um Einzelkern-Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation zu unterstützen. Die Herstellung hochwertiger, intakter Kerne ist für Multiomics-Experimente unerlässlich, kann aber für einige Labore ein Hindernis für den Einstieg in das Feld darstellen.
Methodenartikel
Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Modelle sind hervorragende Plattformen, um die Blutentwicklung zu verstehen, und iPSC-abgeleitete Blutzellen haben einen translationalen Nutzen als klinische Testreagenzien und transfusionierbare Zelltherapeutika. Das Aufkommen und die Erweiterung der Multiomics-Analyse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq) und den Assay für die Transposase-zugängliche Chromatin-Sequenzierung (snATACseq), bietet das Potenzial, unser Verständnis der Zellentwicklung zu revolutionieren. Dazu gehört auch die Entwicklungsbiologie mit in vitro hämatopoetischen Modellen. Es kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen, intakte Zellkerne aus kultivierten oder primären Zellen zu isolieren. Unterschiedliche Zelltypen erfordern oft maßgeschneiderte nukleare Präparate, abhängig von der zellulären Steifigkeit und dem Gehalt. Diese technischen Schwierigkeiten können die Datenqualität einschränken und ein Hindernis für Forscher darstellen, die an Multiomics-Studien interessiert sind. Die Kryokonservierung von Proben ist oft aufgrund von Einschränkungen bei der Zellentnahme und/oder -verarbeitung erforderlich, und gefrorene Proben können zusätzliche technische Herausforderungen für die Isolierung intakter Kerne mit sich bringen. In diesem Manuskript stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus iPSC-abgeleiteten Zellen in verschiedenen Stadien der hämatopoetischen In-vitro-Entwicklung für den Einsatz in Einzelkern-Multiomics-Arbeitsabläufen vor. Wir haben uns bei der Methodenentwicklung auf die Isolierung von Zellkernen aus iPSC-abgeleiteten adhärenten Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärenten hämatopoetischen Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Bezug auf strukturelle und zelluläre Identität sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren. Die beschriebenen Schritte zur Fehlerbehebung beschränkten die Verklumpung von Kernen und Trümmern und ermöglichten die Rückgewinnung von Kernen in ausreichender Menge und Qualität für nachgelagerte Analysen. Ähnliche Methoden können angepasst werden, um Zellkerne aus anderen kryokonservierten Zelltypen zu isolieren.
Einleitung
Die Hämatopoese ist ein relativ gut charakterisiertes Entwicklungssystem, aber die Unfähigkeit, die Blutzellbildung in vitro zu rekapitulieren, zeigt ein unvollständiges Verständnis der damit verbundenen Faktoren. Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Hämatopoesemodelle können dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfaktoren und die damit verbundene Biologie aufzuklären. Das iPSC-System bietet auch ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Bluterkrankungen, und iPSC-basierte Blutzellen wurden entwickelt, um translational und therapeutisch relevante Reagenzien herzustellen 1,2,3,4. Einzelzellstudien wurden ausgiebig eingesetzt, um die iPSC-basierte Entwicklungsbiologie zu untersuchen, einschließlich der Zelltypen, die während der Hämatopoese gebildet werden5. Im Vergleich zur Massen-RNA-Sequenzierung, bei der keine Beziehungen zwischen Zellsubpopulationen abgeleitet werden können6, ermöglichen Einzelzellmodalitäten die Beurteilung der Zellheterogenität und können die Identifizierung und Charakterisierung der Zellentwicklung erleichtern 6,7.
Die Bildung hämatopoetischer Zellen aus iPSCs erfordert eine sequentielle Differenzierung durch primitive Streifen-, Mesoderm- und Endothelzustände, um hämogene Endothelzellen zu bilden. Hämogene Endothelzellen sind direkte Vorläufer von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen8. Diese Zelltypen haben bemerkenswert unterschiedliche morphologische und zelluläre Eigenschaften. Es gibt ein begrenztes Verständnis der epigenetischen Landschaft und der Entwicklungsdynamik von in vitro abgeleiteten hämatopoetischen Zellmodellen, obwohl dies ein wesentliches Wissen ist, um das volle therapeutische Potenzial des iPSC-Systems auszuschöpfen. In vielen Fällen ermöglichen nur Einzelzellanalysemodalitäten die Identifizierung von Zellpopulationen, transkriptionellen Aktivitäten, Chromatinlandschaften und Regulationsmechanismen, die die Entwicklung heterogener Zellpräparate steuern.
Zwei Methoden, die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) und die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq), können transkriptionelle Erkenntnisse auf Einzelzellebene liefern9. Ein Hauptfaktor, der die Gültigkeit und Zuverlässigkeit der Daten bestimmt, ist der kompromisslose Bedarf an Proben, die strenge Qualitätskriterien erfüllen. Dazu gehören genaue Anforderungen an die Zell-/Kerndichte, optimale Viabilität und minimale Verklumpung. Die Präparation einzelner Zellkerne kann eine technische Herausforderung darstellen. Zusätzliche Herausforderungen können mit der Verwendung von zuvor kryokonservierten Zellen verbunden sein.
Wir weisen auf vier wichtige potenzielle Einschränkungen von Standard-scRNAseq-Ansätzen hin. Erstens beziehen sich Standardprotokolle zur Erzeugung von Zellsuspensionen oft auf Präparate aus frischen Zellen oder Geweben und nicht auf solche, die nach der Kryokonservierung gewonnen wurden10. Dies kann den Nutzen potenziell wertvoller Ressourcen einschränken. Zweitens ist die Dissoziationseffizienz verschiedener Zelltypen variabel. Zum Beispiel durchlaufen viele Immunzelltypen die Dissoziation relativ leicht. Im Gegensatz dazu haben Stromazellen, Fibroblasten und Endothelzellen, die normalerweise in die extrazelluläre Matrix und Basalmembran eingebettet sind, einzigartige Zelleigenschaften, die die Isolierung von Zellkernen erschweren können11,12. Diese Eigenschaften können aggressive Dissoziationsprotokolle erforderlich machen, die die strukturelle Integrität empfindlicherer Zellpopulationen gefährden können. Drittens können einige Zellen (z. B. Megakaryozyten) einen Durchmesser von mehr als 100 μm erreichen und stellen Schwierigkeiten für mehrere bestehende kommerzielle Einzelzellplattformen dar13. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Handhabung zu zellulären Schäden und Stressreaktionen während der ersten Schritte der Zellisolierung führen, einschließlich enzymatischer Hydrolyse und mechanischer Dissoziation, was sich auf die Genexpressionsprofile auswirken kann11,14.
Aus diesen und anderen Gründen kann ein Einzelkernansatz eine bevorzugte Alternative zu Einzelzellmethoden sein15. Aufgrund der überlegenen Stabilität der Kernmembran im Vergleich zur Zellmembran kann die Kernhülle auch nach der Kryokonservierung des Gewebes intakt bleiben16. Dies kann die Kernextraktion erleichtern und die Vielfalt der Probentypen erhöhen, die für Next-Generation-Sequencing-Modalitäten geeignet sind. Zweitens weisen die Zellkerne eine erhöhte Resistenz gegen mechanische Störungen auf und neigen dazu, während der Dissoziation weniger transkriptionelle Verschiebungen zu manifestieren14. Daher können Zellkerne eine höhere RNA-Stabilität und reproduzierbarere Transkriptionsprofile bieten. Ein dritter bemerkenswerter Vorteil von Einzelkernmethoden ist das Fehlen von Zellgrößenbeschränkungen und die Anwendbarkeit für größere Zellen wie Kardiomyozyten oder Megakaryozyten12. Viertens dienen Zellkerne als geeignete Substrate für Multiomics-Analysen, die erweiterte Einblicke aus der integrierten Analyse der Genexpression, der zugänglichen Chromatinregionen und anderer Parameter17 bieten und ein tieferes Verständnis der Zellheterogenität, der Entwicklung und der Funktionszuständeermöglichen 18.
Durch die Profilierung von iPSCs während der hämatopoetischen Entwicklung können Multiomics-Ansätze dazu beitragen, Entwicklungsprozesse in normalen oder pathologischen Krankheitsmodellen zu definieren. Vergleiche von iPSC-abgeleiteten Zellen mit primären Zellen oder Geweben können auch eine Bewertung der Treue des iPSC-Modells zur In-vivo-Biologie liefern, was die Verbesserung des iPSC-Modells und die Entdeckung neuer Zellpopulationen und Faktoren, die die Blutbildung vorantreiben, erleichtert.
Obwohl viele Gruppen die nukleare Isolierung und die daraus resultierende Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation erfolgreich bewältigt haben, bleibt die Isolierung hochwertiger Kerne ein Hindernis für einige Laboratorien, die an der Durchführung von Einzelkernanalysen interessiert sind. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus zuvor kryokonservierten iPSC-abgeleiteten Zellen. Wir haben uns auf adhärente Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärente hämatopoetische Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Struktur und Inhalt sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren, die maßgeschneiderte Modifikationen und Fehlerbehebungen erfordern, um die Rückgewinnung hochwertiger Zellkerne zu verbessern, die für die Sequenzierung der nächsten Generation oder andere Experimente geeignet sind.
Protokoll
1. Kryokonservierung von Zellen
- Frieren Sie >1 x 10 x 10isolierte iPSC-abgeleitete Zellen pro ml in 1 ml 90 % FBS und 10 % DMSO ein. Geben Sie die Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter bei -80 °C, um die Gefriergeschwindigkeit zu reduzieren und die Rückgewinnung lebensfähiger Zellen zu optimieren (Materialtabelle). Rechnen Sie mit erheblichen Zellverlusten, die je nach Kulturbedingungen und Zellidentität variieren können.
- Wechsel von -80 °C zur Lagerung von flüssigem Stickstoff innerhalb von 24 h.
2. Auftauen der Zellen
- Kryofläschchen aus dem Flüssigstickstofflager entnehmen und 2 min in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Aus dem Wasserbad nehmen, solange noch kleine Eiskristalle sichtbar sind.
- Übertragen Sie die Zellen aus dem Kryofläschchen in ein leeres 15-ml-Röhrchen und fügen Sie langsam 10 mL vorgewärmtes Medium (RPMI 1640 + 10 % FBS) hinzu, während Sie vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 25 °C.
- Der Überstand wird aspiriert und in 1 ml DPBS, ergänzt mit 2 % FBS und 1 mM CaCl2 , rekonstituiert (Materialtabelle). Vorsichtig mischen, indem Sie 3x mit einer 1000 μL Mikropipette pipettieren. In ein 5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen umfüllen.
3. Entfernung abgestorbener Zellen
- Geben Sie 50 μl Cocktail zur Entfernung toter Zellen (Tabelle der Materialien) zu 1 ml Zellsuspension. Geben Sie 50 μl Biotin Selection Cocktail in die Zellmischung. 3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Diese Schritte markieren die in der Zellsuspension enthaltenen toten Zellen von Annexin V+ mit Biotin.
- Die Dextran-Kügelchen wirbeln 30 s lang kräftig und sind für die Depletion unerwünschter Zelltypen konzipiert, die mit Biotin markiert sind (Table of Materials). Geben Sie 100 μl Dextrankügelchen in die Zellsuspension und mischen Sie, indem Sie 2x vorsichtig mit einer 1000 μl Mikropipette auf und ab pipettieren (Materialtabelle).
- Geben Sie 1,3 mL DPBS mit 2 % FBS und 1 mM CaCl2 in die Zellsuspension und mischen Sie, indem Sie 2x mit einer 1000-μl-Mikropipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Setzen Sie das Röhrchen in den Magneten ein (Materialtabelle) und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Drehen Sie den Magneten und das Röhrchen um, um die angereicherte Lebendzellsuspension in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen zu gießen. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 4°C. Der größte Teil des Überstands wird entfernt und in 1 ml DPBS + 0,04 % BSA resuspendiert. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 3x mit einer 1000-μl-Mikropipette pipettieren.
4. Isolierung der Zellkerne
- Zentrifugieren Sie die Lebendzellsuspension bei 460 x g für 5 min bei 4 °C und aspirieren Sie dann den Überstand, um sicherzustellen, dass das Zellpellet nicht gestört wird.
- Fügen Sie 100 μl frisch zubereiteten 0,5x Lysepuffer hinzu, der auf Eis gekühlt wurde (Tabelle 1), und mischen Sie vorsichtig, indem Sie 10x mit einer 100 μl Mikropipette pipettieren. 3 min auf Eis inkubieren.
- Geben Sie 500 μl gekühlten Waschpuffer (Tabelle 2) in das Röhrchen, ohne zu mischen. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Waschen und Beurteilung der Zellkerne
- Überstand aspirieren und 500 μl gekühlten Waschpuffer hinzufügen, um das verbleibende intakte Pellet ohne Vermischung aufzulösen. Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den gesamten Überstand, ohne das Kernpellet zu zerstören.
- In 120 μl gekühltem verdünntem Kernpuffer resuspendieren (Tabelle 3). Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem 40-μm-Zellsieb (Materialtabelle).
- Mit 0,4% Trypanblau färben und die Qualität der isolierten Zellkerne unter dem 10-fachen Mikroskop visuell beurteilen (Materialtabelle).
6. Verarbeitung isolierter Zellkerne
- Halte die Kerne auf Eis. Fahren Sie sofort mit der weiteren Verarbeitung fort, da es im Laufe der Zeit zu nuklearen Verklumpungen kommen kann, die zusätzliche Filtrationsschritte erforderlich machen.
Ergebnisse
Wir haben das oben erwähnte Protokoll verwendet, um Zellkerne aus kryokonservierten iPSC-abgeleiteten adhärenten Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärenten (schwebenden) hämatopoetischen Vorläuferzellen zu extrahieren. Eine detaillierte schematische Darstellung des Verfahrens der nuklearen Isolierung ist in Abbildung 1 zu finden.
Für die morphologische Untersuchung wurden isolierte Zellkerne mit Trypanblau gefärbt und unter dem Mikroskop sichtbar gemacht. Die kernmorphologische Untersuchung ist unmittelbar vor der Verarbeitung von entscheidender Bedeutung, da Ablagerungen oder verklumpte Kerne die Erzeugung hochwertiger Daten aufgrund von Verstopfungen in mikrofluidischen Präzisionsinstrumenten verringern oder verhindern können. Die mikroskopische Untersuchung von Kernen, die aus einer Probe isoliert wurden, die mit einem herkömmlichen Kit-Protokoll hergestellt wurde, zeigte das Vorhandensein von Trümmern und ≥1 Kernaggregat pro visualisiertem Feld (Abbildung 2A-B). Diese Proben wurden aufgrund minderer Qualität verworfen.
Qualitativ hochwertige Kerne sind rund und intakt, mit minimalen bis keinen Klumpen, wie wir sie nach der Methodenoptimierung beobachtet haben (Abbildung 2C-D). Der Hof beobachtete in diesen Proben keine Aggregate oder Verklumpungen. Diese Kerne waren von ausreichender Qualität und Quantität, um die nachgelagerte Verarbeitung und Analyse zu unterstützen. Eine ähnliche Fehlerbehebung und Protokolloptimierung kann möglicherweise auf andere kryokonservierte Zelltypen ausgeweitet werden.
Abbildung 1: Diagramm zur Veranschaulichung der Zellkernextraktion aus kryokonservierten Zellen. Visuelle Darstellung, die die Schritte der nuklearen Isolierung aus kryokonservierten Zellen beschreibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zellkerne, die aus kryokonservierten humanen iPSC-Zellen isoliert wurden. Isolierte Zellkerne aus adhärenten Stroma-/Endothelzellen, die mit Trypanblau gefärbt wurden, weisen signifikante Rückstände (A) kleine Partikel und (B) Kernaggregate (große Partikel) auf, die nachgelagerte Analysen ausschlossen. Nach Durchführung der hier vorgestellten technischen Modifikationen wurden hochwertige Zellkerne aus (C) kryokonservierten humanen iPSC-abgeleiteten hämatopoetischen Vorläuferzellen oder (D) stromalen/endothelialen Zellpopulationen in ausreichender Menge isoliert, um nachgelagerte Analysen zu unterstützen. Als Referenz wurden diese nicht-adhärenten hämatopoetischen Vorläuferzellen an Tag 9 + 8 und adhärente Stroma-/Endothelzellen an Tag 9 + 7 der hämatopoetischen Differenzierung, wie in4 beschrieben, entnommen. Beachten Sie, dass die Kernmorphologie je nach Zelltyp unterschiedlich sein kann. Maßstabsstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Vorbereitung des Puffers | |||
| 0,5-facher Lysepuffer | Lager | Finale | 2 mL |
| 1X Lyse-Puffer | 1X | 0,5-mal | 1 ml |
| Lyse-Verdünnungspuffer | 1 ml | ||
| Lyse-Puffer | Lager | Finale | 2 mL |
| BSA | 10% | 1% | 200 μL |
| Digitonin | 5% | 0.01% | 4 μL |
| DVB-T | 1000 mM | 1 mM | 2 μL |
| MgCl2 | 1 Mio. | 3 mM | 6 μl |
| NaCl | 5 Meter | ca. 10 mM | 4 μL |
| Nonidet P40 Stellvertreter | 10% | 0.10% | ca. 20 μl |
| Nukleasefreies Wasser | 1,67 mL | ||
| RNase-Hemmer | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH7,4) | 1 Mio. | ca. 10 mM | ca. 20 μl |
| Tween-20 | 10% | 0.10% | ca. 20 μl |
| Lyse-Verdünnungspuffer | Lager | Finale | 2 ml |
| BSA | 10% | 1% | ca. 200 μl |
| DVB-T | 1000 mM | 1 mM | 2 μL |
| MgCl2 | 1 Mio. | 3 mM | 6 μL |
| NaCl | 5 Meter | ca. 10 mM | 4 μL |
| Nukleasefreies Wasser | 1,72 mL | ||
| RNase-Hemmer | 40 U/μl | 1 U/μl | 50 μl |
| Tris-HCl (pH7,4) | 1 Mio. | ca. 10 mM | 20 μl |
Tabelle 1: Herstellung von 0,5x Lysepuffer. Diese Lösung ist für das Verfahren zur Kernisolierung in Schritt 4.2 vorgesehen. Lysepuffer und Lyseverdünnungspuffer werden gemischt, um 0,5x Lysepuffer herzustellen. Es ist zwingend erforderlich, unmittelbar vor jedem Versuch frischen Puffer vorzubereiten und auf Eis zu halten. Beachten Sie, dass die Fehlerbehebung für einige Zelltypen eine 1-fache, 0,5-fache oder niedrigere Verdünnung des Lysepuffers umfassen kann, um die Isolierung des intakten Zellkerns zu erleichtern.
| Vorbereitung des Puffers | |||
| Wasch-Puffer | Lager | Finale | 4 mL |
| BSA | 10% | 1% | 400 μL |
| DVB-T | 1000 mM | 1 mM | 4 μL |
| MgCl2 | 1 Mio. | 3 mM | 12 μL |
| NaCl | 5 Meter | ca. 10 mM | 8 μL |
| Nukleasefreies Wasser | 3,40 mL | ||
| RNase-Hemmer | 40 U/μl | 1 U/μl | 100 μL |
| Tris-HCl (pH7,4) | 1 Mio. | ca. 10 mM | 40 μL |
| Tween-20 | 10% | 0.10% | 40 μL |
Tabelle 2: Vorbereitung des Waschpuffers. Diese Lösung wird bei der Kernisolierung verwendet. Diese sollte vor jedem Versuch frisch zubereitet und auf Eis aufbewahrt werden.
| Vorbereitung des Puffers | |||
| Verdünnter Kernpuffer | Lager | Finale | 1 ml |
| DVB-T | 1000 mM | 1 mM | 1 μL |
| Nukleasefreies Wasser | 924 μL | ||
| Kern-Puffer | 20-mal | 1X | 50 μL |
| RNase-Hemmer | 40 U/μL | 1 U/μL | 25 μL |
Tabelle 3: Herstellung von verdünntem Zellpuffer. Diese Lösung wird in Schritt 5.2 verwendet. Es sollte vor jedem Versuch frisch zubereitet und auf Eis aufbewahrt werden.
Diskussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Die Isolierung hochwertiger Zellkerne ist essentiell für die erfolgreiche Implementierung derzeitiger, einzelkernbasierter Next-Generation-Sequencing-Modalitäten, die sich schnell weiterentwickeln. In Anbetracht der bestehenden Barrieren für Labore, die an diesen Ansätzen interessiert sind, insbesondere für kryokonservierte Proben, war es unsere Absicht, eine nukleare Isolationstechnik zu entwickeln, die auf zuvor gefrorene Zellen zugeschnitten ist. Die Isolierung von Zellkernen aus kryokonservierten Proben ist häufig für klinische Proben und für seltene iPSC-abgeleitete Zellpopulationen erforderlich.
Es ist wichtig, die Verdünnung des Lysepuffers, die Lysezeit und die Filtrationshäufigkeit auf bestimmte Zellpopulationen abzustimmen. Wir haben beobachtet, dass besonders empfindliche Zelltypen, wie z. B. kryokonservierte humane iPSC-abgeleitete hämatopoetische Vorläuferzellen, in weniger als einer Minute mit 1x Lysepuffer überlysiert werden. Eine solche Überlyse ist nicht nur eine technische oder betriebliche Störung. Vielmehr können Überlyse und Verklumpung auf ein Austreten von anhaftendem Kernmaterial hinweisen. Bei adhärenten Stroma- und Endothelzellen mit robuster Zytoskelettarchitektur und Membranen, die zu starken Zell-Zell-Adhäsionen neigen, war eine doppelte Filtration erforderlich, um verklumpte Zellkerne zu entfernen. Nukleare Aggregate können mikrofluidische Kanäle verstopfen, was ein greifbares Risiko für die experimentelle Integrität darstellt und möglicherweise jede Datenausgabe ausschließt.
Wir fanden auch heraus, dass die Integration eines Schritts zur Entfernung toter Zellen die Rückgewinnung intakter Zellkerne drastisch erhöhte und gleichzeitig Verklumpungen und Ablagerungen begrenzte. Zu Beginn des Experiments war es notwendig, Proben mit >70 % lebensfähigen Zellen auf der Grundlage der Trypanblau-Färbung zu verarbeiten. Wenn Sie alle Puffer auf Eis halten, kann dies auch dazu beitragen, die Rentabilität zu erhalten.
Grenzen der Technik
Die beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Kernausbeute aus kultivierten iPSC-abgeleiteten Zelltypenzu optimieren 4. Es ist möglich, dass ähnliche Verfahren zur Fehlerbehebung über iPSC-induzierte Zellen hinausgehen und auch andere kryokonservierte Zelltypen umfassen, aber es ist etwas schwierig, den spezifischen Bedarf für einzelne Proben oder Zelltypen ohne Tests vorherzusagen. Unabhängig von der Probe oder dem Zelltyp sollte das Ziel von Kernpräparaten mit <5 % verbleibenden lebensfähigen ganzen Zellen, die Minimierung der Aggregation und die Reduzierung überlysierter Zellkerne direkt mit dem experimentellen Erfolg korrelieren.
Bedeutung im Vergleich zu bestehenden Methoden
Translational relevante iPSC-basierte Differenzierungssysteme können eine Vielzahl von Zelltypen und Vorläuferzellen hervorbringen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf iPSC-abgeleitete adhärente Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärente hämatopoetische Vorläuferzellen als beispielhafte Zelltypen, die unterschiedliche methodische Anforderungen zur Optimierung der Kernisolierung stellten. Wir gehen davon aus, dass dieses Protokoll angepasst und auf andere iPSC-abgeleitete Zelltypen angewendet werden kann, um entscheidende Entwicklungsstadien zu untersuchen, da es notwendig ist, die Isolierungsmethoden in Abhängigkeit vom Proteingehalt, der Membranstruktur und der Zellsteifigkeit fein abzustimmen. Die hier beschriebene Methode kann jedoch die Rückgewinnung hochwertiger Zellkerne aus einem breiten Spektrum kryokonservierter Zelltypen ermöglichen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Jason Hatakeyama (10x Genomics) und Diana Slater (Children's Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) für Anleitungen und Vorschläge. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (HL156052 bis CST) unterstützt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zellkulturreagenzien | |||
| Dimethylsulfoxidlösung (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cells | |||
| induzierte pluripotente Stammzellen | N/A | N/A | Die in dieser Studie verwendeten iPSCs wurden durch die CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility |
| Cell Staining Reagents | |||
| Trypanblau-Lösung | Corning | 25900CI | |
| strong>Reagenzien zur Entfernung toter Zellen | |||
| Calciumchlorid (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Kit zur Entfernung toter Zellen (Annexin V) | StemCell Technologies | 17899 | Dieses Kit ist für die Depletion unerwünschter Zelltypen konzipiert, die mit Biotin markiert sind. Das Kit enthält einen Cocktail zur Entfernung toter Zellen (Annexin V), einen Biotin Selection Cocktail und Dextran-Perlen. Dieses Kit zielt auf Phosphatidylserin auf dem äußeren Segel der Zellmembran apoptotischer Zellen unter Verwendung von Annexin V ab. Unerwünschte Zellen werden mit Annexin V, biotinylierten Antikörpern und magnetischen Partikeln markiert und ohne Säulen mit einem EasySep-Magneten getrennt. Gewünschte Zellen werden einfach in ein neues Röhrchen abgegossen. |
| Materials | |||
| 10 & micro; l Mikropipette | Wards Wissenschaft | 470231606 | |
| 100 &Mikro; l Mikropipette | Wards Wissenschaft | 470231598 | |
| 1000 µ l Erweiterte Universalspitze | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 & micro; l Mikropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2,0 ml Kryofläschchen | Corning | 431386 | |
| 20 & micro; l Mikropipette | Wards Wissenschaft | 470231608 | |
| 200 &Mikro; l Mikropipette | Wards Science | 470231600 | |
| 5ml Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0,1-10 & Mikro; l Pipettenspitzenstation | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ l Pipettenspitzenstation | Corning | 4144 | |
| Zählkammer | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 & Mikro; M | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° C Gefrierbehälter | Nalgene | 51000001 | |
| IsolationsreagenzienNuclei-Isolationsreagenzien | umfassen Lysepuffer Waschpuffer und verdünnter Kernpuffer sowie Lyseverdünnungspuffer. Die Zusammensetzung dieser Puffer ist in den Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführt. Unsere Methode zur Isolierung von Kernen verbesserte die Isolierung von den Standard-Kit-Protokollen (z. B. 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). Dieses Protokoll kann mit mehreren kommerziellen Kits verwendet werden, einschließlich des Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | ||
| Kit zur Entfernung toter Zellen | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol Lösung (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Zellsieb, 40 & Mikro; m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS Rinderserumalbumin (BSA) Lager Lösung | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| Magnesiumchlorid (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Magnesiumchlorid Lösung, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Ersatz | Sigma | 74385 | |
| Nukleasefrei Wasser | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Kernpuffer (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector RNase Inhibitor | Sigma | 3335399001 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Natriumchlorid Lösung, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Trizma Hydrochlorid Soultion, pH 7,4 | Sigma | T2194 | |
| Trizma-Hydrochlorid (Tris-HCl) (pH7,4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Andere Geräte | |||
| Automatisierter Zellzähler | CytoSMART | 699910591 | |
| Mikroskop | Zeiss | Primostar 3 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
