Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen

Rong Qiu; Chayanne Petit; Christopher S. Thom

doi:10.3791/66490

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Methodenartikel

Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen

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DOI:

10.3791/66490

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15. März 2024

Rong Qiu¹ , Chayanne Petit¹ , Christopher S. Thom¹^,²

¹Division of Neonatology, Children’s Hospital of Philadelphia, ²Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Extraktion hochwertiger Zellkerne aus kryokonservierten induzierten pluripotenten Stammzelltypen, die aus Stroma-/Endothel- und Blutzelltypen gewonnen wurden, um Einzelkern-Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation zu unterstützen. Die Herstellung hochwertiger, intakter Kerne ist für Multiomics-Experimente unerlässlich, kann aber für einige Labore ein Hindernis für den Einstieg in das Feld darstellen.

Zusammenfassung

Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Modelle sind hervorragende Plattformen, um die Blutentwicklung zu verstehen, und iPSC-abgeleitete Blutzellen haben einen translationalen Nutzen als klinische Testreagenzien und transfusionierbare Zelltherapeutika. Das Aufkommen und die Erweiterung der Multiomics-Analyse, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq) und den Assay für die Transposase-zugängliche Chromatin-Sequenzierung (snATACseq), bietet das Potenzial, unser Verständnis der Zellentwicklung zu revolutionieren. Dazu gehört auch die Entwicklungsbiologie mit in vitro hämatopoetischen Modellen. Es kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen, intakte Zellkerne aus kultivierten oder primären Zellen zu isolieren. Unterschiedliche Zelltypen erfordern oft maßgeschneiderte nukleare Präparate, abhängig von der zellulären Steifigkeit und dem Gehalt. Diese technischen Schwierigkeiten können die Datenqualität einschränken und ein Hindernis für Forscher darstellen, die an Multiomics-Studien interessiert sind. Die Kryokonservierung von Proben ist oft aufgrund von Einschränkungen bei der Zellentnahme und/oder -verarbeitung erforderlich, und gefrorene Proben können zusätzliche technische Herausforderungen für die Isolierung intakter Kerne mit sich bringen. In diesem Manuskript stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus iPSC-abgeleiteten Zellen in verschiedenen Stadien der hämatopoetischen In-vitro-Entwicklung für den Einsatz in Einzelkern-Multiomics-Arbeitsabläufen vor. Wir haben uns bei der Methodenentwicklung auf die Isolierung von Zellkernen aus iPSC-abgeleiteten adhärenten Stroma-/Endothelzellen und nicht-adhärenten hämatopoetischen Vorläuferzellen konzentriert, da diese in Bezug auf strukturelle und zelluläre Identität sehr unterschiedliche Zelltypen repräsentieren. Die beschriebenen Schritte zur Fehlerbehebung beschränkten die Verklumpung von Kernen und Trümmern und ermöglichten die Rückgewinnung von Kernen in ausreichender Menge und Qualität für nachgelagerte Analysen. Ähnliche Methoden können angepasst werden, um Zellkerne aus anderen kryokonservierten Zelltypen zu isolieren.

Einleitung

Die Hämatopoese ist ein relativ gut charakterisiertes Entwicklungssystem, aber die Unfähigkeit, die Blutzellbildung in vitro zu rekapitulieren, zeigt ein unvollständiges Verständnis der damit verbundenen Faktoren. Auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) basierende Hämatopoesemodelle können dazu beitragen, wichtige Entwicklungsfaktoren und die damit verbundene Biologie aufzuklären. Das iPSC-System bietet auch ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Bluterkrankungen, und iPSC-basierte Blutzellen wurden entwickelt, um translational und therapeutisch relevante Reagenzien herzustellen 1,2,3,4.