Die dezellularisierte Milzmatrix (DSM) bietet vielversprechende Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering in der Leber. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Vorbereitung des DSM von Ratten, das die Entnahme von Rattenmilz, ihre Dezellularisierung durch Perfusion und die Bewertung des resultierenden DSM zur Bestätigung seiner Eigenschaften umfasst.
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Methodenartikel
Herstellung einer dezellularisierten Milzmatrix aus Ratten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Lebertransplantation ist die primäre Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium. Der Mangel und die unzureichende Qualität der Spenderorgane machen jedoch die Entwicklung alternativer Therapien erforderlich. Biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, haben sich als vielversprechende Lösungen herausgestellt. Die Beschaffung geeigneter DLMs bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) wurde als Grundlage für BALs erforscht und bietet eine leicht verfügbare Alternative. In dieser Studie wurde die Milz von Ratten unter Verwendung einer Kombination aus Gefrier-Auftau-Zyklen und Perfusion mit Dezellularisierungsreagenzien entnommen und dezellularisiert. Das Protokoll bewahrte die Mikrostrukturen und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb des DSM. Der vollständige Dezellularisierungsprozess dauerte ca. 11 h, was zu einer intakten EZM innerhalb des DSM führte. Die histologische Analyse bestätigte die Entfernung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der Struktur und Zusammensetzung der EZM. Das vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Gewinnung von DSM und bietet potenzielle Anwendungen im Bereich des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. Diese Erkenntnisse tragen zur Entwicklung alternativer Ansätze für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium bei.
Einleitung
Die Lebertransplantation ist nach wie vor die einzige definitive Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium 1,2,3. Der kritische Mangel und die abnehmende Qualität von Spenderorganen haben jedoch den Bedarf an alternativen Behandlungen erhöht4. Im Bereich der regenerativen Medizin haben sich biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, als vielversprechende Lösungen erwiesen 5,6,7. Die DLM bewahrt die ursprüngliche Leberstruktur, einschließlich ihres komplizierten mikrovaskulären Netzwerks und der Komponenten der EZM, und bietet ein Gerüst für die Erstellung transplantierbarer BALs, die möglicherweise Lebererkrankungen lindern könnten.
Trotz des Versprechens steht die Einführung dieser Technologie vor Herausforderungen, insbesondere bei der Beschaffung geeigneter DLMs. Vom Menschen stammende DLMs sind knapp, während solche aus tierischen Quellen das Risiko der Übertragung von Krankheiten und der Immunabstoßung bergen. In einem innovativen Ansatz haben wir in unserer Forschung die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) als Grundlage für die BALs 8,9,10,11 untersucht. Milz ist in verschiedenen medizinischen Situationen leichter verfügbar, z. B. bei portaler Hypertonie, traumatischer Ruptur, idiopathischer thrombozytopenischer Purpura und Spende nach dem Herztod. Daher ist Milz für Forschungszwecke weiter verbreitet als Leber. Patienten, die sich einer Splenektomie unterzogen haben, leiden nicht an schweren Erkrankungen, was die Entbehrlichkeit der Milz weiter bestätigt. Die Mikroumgebung der Milz, insbesondere der extrazellulären Matrix und der Sinusoide, ähnelt der der Leber. Damit ist die Milz ein geeignetes Organ für die Zelladhäsion und -proliferation in der Hepatozytentransplantationsforschung. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, dass DSMs vergleichbare Mikrostrukturen und Komponenten mit DLMs aufweisen und das Überleben und die Funktion von Hepatozyten, einschließlich der Albumin- und Harnstoffproduktion, unterstützen können. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass DSMs die hepatische Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks verbessern, was zu einer verbesserten und konsistenten Funktionalität führt.
Durch den Einsatz von DSMs, die mit Heparin behandelt wurden, haben wir funktionelle BALs entwickelt, die in der Lage sind, eine wirksame kurzfristige Antikoagulation und eine partielle Leberfunktionskompensation zu demonstrieren11. Folglich ist dieses dreidimensionale DSM vielversprechend für die Weiterentwicklung des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. In dieser Arbeit stellen wir die detaillierten Methoden zur Entnahme von Rattenmilz und zur Herstellung von DSM vor, die die Mikrostrukturen und Komponenten der EZM erhalten.
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Protokoll
Diese Studie wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Xi'an Jiaotong genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
1. Milz-Entnahme
- Verwenden Sie männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250-280 g. Halten Sie die Ratten in Räumen mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit und versorgen Sie sie nach Belieben mit Futter und Wasser, außer zum Fasten vor der Operation.
- Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 ml/kg) 1 h vor der Operation subkutan als Analgetikum. Betäuben Sie die Ratte durch Isofluran-Inhalation. Verwenden Sie eine Flussrate von 1,5 l/min von 5 % Isofluran für die Induktionsanästhesie in einer Plexiglasbox und halten Sie die Anästhesie mit einer Flussrate von 0,6-0,8 l/min von 2 % Isofluran durch eine Maske aufrecht. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen einklemmen.
- Verwenden Sie einen Elektrorasierer, um die Haut über den gesamten Bauch zu rasieren. Befestigen Sie die Ratte in Rückenlage auf dem Operationstisch. Injizieren Sie 2 ml heparinisierte Kochsalzlösung (1.000 U Heparin) über die Vena dorsalis des Penis, um eine systemische Antikoagulation zu erreichen. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit einer Povidon-Jod-Lösung und decken Sie sie mit einem sterilen Tuch ab.
- Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kreuzförmigen Schnitt im Bauchraum, legen Sie die Bauchhöhle frei, indem Sie sie mit der hämostatischen Zange dehnen, und drehen Sie die Leber in Richtung Zwerchfell. Äußere den Magen-Darm-Trakt zur rechten Seite des Bauches und bedecke ihn mit feuchter Gaze.
- Trennen und durchtrennen Sie vorsichtig das Milzband, um den Milzhilum freizulegen.
HINWEIS: Die Milz, die als rötliche, längliche Struktur mit einer Größe von ca. 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm erscheint, ist im linken Bauch zu erkennen. - Trennen und legen Sie nach und nach die Arteria hepatica communis, die Arteria gastroduodenalis und die Arteria palzica frei, indem Sie entlang des Milzhilums präparieren. Lizieren und durchtrennen Sie die Arteria gastroduodenalis und die Arteria hepatica communis, während das umgebende Gewebe schrittweise dissoziiert wird.
- Drehen Sie die Milz zur rechten Seite, um die Bauchschlagader freizulegen. Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch und legen Sie die Bauchaorta und den Zöliakie-Rumpf mit Wattestäbchen frei. Legen Sie eine 3-0 Seidennaht von ca. 3 cm Länge über und unter den Ästen des Zöliakiestamms und platzieren Sie eine 6-0 Seidennaht von ca. 10 cm Länge am Ast des Zöliakiestamms.
- Ligatur der Bauchaorta unterhalb und oberhalb der Äste des Stammes coeliacus. Machen Sie einen kleinen Schnitt am arteriellen Ast. Heben Sie die 6-0-Seidennaht vorsichtig an, führen Sie einen 24-G-Venenkatheter in die Milzarterie entlang des Truncus coeliacus ein, ligatieren und sichern Sie ihn.
- Infundieren Sie mit einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min heparinisierte normale Kochsalzlösung (25 U/ml) mit einem Volumen von 50 mL. Gleichzeitig wird die Pfortader als Abflusskanal durchtrennt, damit die infundierte Flüssigkeit aus der Milz abfließen kann. Das Tier wird durch Ausblutung eingeschläfert.
- Präparieren Sie vorsichtig das umgebende Gewebe der Milz, um eine Schädigung der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden, während die wichtigsten akzessorischen Gefäße erhalten bleiben.
- Prüfen Sie, ob die Milz undicht ist, entfernen Sie dann die Milz und die Bauchspeicheldrüse und spülen Sie sie mit normaler Kochsalzlösung aus.
HINWEIS: Milz und Bauchspeicheldrüse von Ratten sind eng miteinander verbunden, wobei sich die Bauchspeicheldrüse um die Milzarterie wickelt. Wenn die Milz separat entfernt wird, kann es schwierig sein, zahlreiche kleine Blutgefäße zu ligieren. Bei diesem Verfahren wird die Milz zusammen mit der Bauchspeicheldrüse entfernt. Nach der Dezellularisation werden Milz und Bauchspeicheldrüse transparent und die Mikrogefäße sind sichtbar, was den Erhalt der Milz mit intakten Blutgefäßen erleichtert. - Füllen Sie die Milz in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen um, das mit normaler Kochsalzlösung gefüllt ist, und lagern Sie es in einem -80 °C Gefrierschrank.
HINWEIS: Die Milz und der Venenkatheter, die in die Milzarterie eingeführt werden, werden zusammen kryokonserviert, um eine bequeme Verbindung während der Perfusionsexperimente zu ermöglichen.
2. Milz-Dezellularisierung
- Wiederholen Sie den Gefrier-Auftau-Zyklus 3x in einem sterilen Behälter, um die Milzzellen zu lysieren.
HINWEIS: Der Frost-Tau-Zyklus ist eine physikalische Methode, die für die Entzellularisierung von Gerüsten verwendet wird. Das Milzgewebe wird über Nacht zum Einfrieren in einen -80 °C-Gefrierschrank gelegt, dann aus der Tieftemperaturumgebung genommen und zum Auftauen in ein Wasserbad mit Raumtemperatur oder 37 °C gelegt. Dieser Einfrier- und Auftauvorgang wird 3-6 Mal wiederholt, was die Zellmembranen stört und zur Zelllyse führt. - Richten Sie ein Perfusionssystem innerhalb einer Reinbank ein, das aus einer Peristaltikpumpe, einem 2-Liter-Reservoir, einem Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 2,4 mm und einer Blasenfalle besteht (Abbildung 1).
- Füllen Sie das Perfusionssystem mit deionisiertem Wasser (ddH2O) und lassen Sie es 10 min lang laufen.
- Füllen Sie die geerntete Milz vorsichtig in den mit ddH2O gefüllten Behälter um.
- Verbinden Sie den Silikonschlauch mit dem Venenkatheter, der in die Milzarterie eingeführt wurde.
- Beginnen Sie die Perfusion mit ddH2O mit einer Rate von 2 mL/min für 30 min.
- Die Perfusion mit ddH2O mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min für 30 min fortsetzen.
- Perfusion mit 0,1% (w/v) SDS-Lösung für 4 h.
- Perfusion mit 1% (v/v) Triton X-100 Lösung für 2 h.
- Perfundieren Sie 4 Stunden lang mit PBS mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min, um das DSM zu waschen.
HINWEIS: Verwendung der Peristaltikpumpe für die unidirektionale Perfusion aller Flüssigkeiten. - Nachdem die Perfusion abgeschlossen ist, ligatieren und durchtrennen Sie die Gefäßäste zwischen Bauchspeicheldrüse und Milz und entfernen Sie dann die Bauchspeicheldrüse. Lagern Sie das DSM in einem sauberen und verschlossenen 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das in PBS mit 10 % Penicillin-Streptomycin bei -20 °C getränkt ist, bis es für zukünftige Experimente verwendet werden kann.
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Ergebnisse
Dieses Protokoll verwendete eine Kombination aus wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen und Perfusion mit Dezellularisierungsreagenzien für die Dezellularisierung der Milz von Ratten. Die vollständige Dezellularisation der Milz wurde in ca. 11 h erreicht (Abbildung 2A). Während des Dezellularisierungsprozesses wechselte die Farbe der Milz allmählich von tiefrot zu einem gesprenkelten, hellen Rot und schließlich zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen (Abbildung 2B)....
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Diskussion
Die BALs stellen einen wirksamen Ansatz für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium dar, insbesondere in Fällen, in denen eine Lebertransplantation durch den derzeitigen Mangel an Spenderorganen behindertwird 6. Eine vielversprechende Option zur Erstellung von BALs ist die Verwendung von DLM, bei der die natürliche EZM und die Gefäßstruktur der nativen Leber erhalten bleiben. Die Knappheit von DLM beim Menschen und die potenziellen Infektions- und Immunogenitätsrisiken, die mit tierisch...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte deklariert.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82000624), dem Natural Science Basic Research Program von Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), dem Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), dem Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), der Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anästhesiegerät | Harvard Apparat | ||
| Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | Porendurchmesser: 5 μ m | verhindern Luftblasen | |
| Buprenorphin | TIPR Pharmaceutical Responsible Co., Ltd | eine analgetische | |
| hämostatische Pinzette | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | chirurgisches Werkzeug |
| Heparinisierte Kochsalzlösung | SPH Nr. 1 Biochemisch & Pharmazeutische Co., LTD | verhindern die Bildung von Thrombosen | |
| Isofluran | RWD Life Science Co. | Anästhetikum:zur Einleitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie | |
| Penicillin-Streptomycin | Verifizierter Lieferant - Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | Antibiotika in vitro zur Verhinderung mikrobieller Kontamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | Phosphorsäure-Puffer-Salzlösung |
| Silikonschlauch | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2,4 x 0,8 mm | |
| Seidennaht | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 und 3-0 | ligate Blutgefäße |
| Natriumdodecylsulfat | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionisches Detergens, löst sowohl Zell- als auch Kernmembranen |
| Spritzenpumpe | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenöse Infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | nichtionisches Detergens, unterbricht die Wechselwirkungen zwischen Lipid, Lipid und Protein |
| Venenkatheter | B. Braun Company | 24G | beim Einführen der Milzarterie |
Referenzen
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