Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Erzeugung lichtregulierter und reversibler Proteinmuster mit hoher raumzeitlicher Präzision an künstlichen Lipidmembranen beschrieben. Die Methode besteht aus der lokalisierten Photoaktivierung des Proteins iLID (improved light-inducible dimer), das auf Modellmembranen immobilisiert ist und unter blauem Licht an sein Partnerprotein Nano (Wildtyp-SspB) bindet.

Zusammenfassung

Die präzise Lokalisierung und Aktivierung von Proteinen an der Zellmembran zu einem bestimmten Zeitpunkt führt zu vielen zellulären Prozessen, darunter die Polarisation, Migration und Teilung von Zellen. Daher sind Methoden zur Rekrutierung von Proteinen zur Modellierung von Membranen mit subzellulärer Auflösung und hoher zeitlicher Kontrolle unerlässlich, um solche Prozesse in synthetischen Zellen zu reproduzieren und zu kontrollieren. Hier wird ein Verfahren zur Herstellung lichtregulierter reversibler Proteinmuster an Lipidmembranen mit hoher raumzeitlicher Präzision beschrieben. Zu diesem Zweck immobilisieren wir das photoschaltbare Protein iLID (improved light-inducible dimer) auf gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) und auf der äußeren Membran von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs). Bei lokaler Blaulichtbeleuchtung bindet iLID an seinen Partner Nano (Wildtyp-SspB) und ermöglicht die Rekrutierung eines beliebigen mit Nano fusionierten Proteins (POI) von der Lösung in den beleuchteten Bereich auf der Membran. Diese Bindung ist im Dunkeln reversibel, was eine dynamische Bindung und Freigabe des POI ermöglicht. Insgesamt handelt es sich um eine flexible und vielseitige Methode, um die Lokalisierung von Proteinen mit hoher Präzision in Raum und Zeit mittels blauem Licht zu regulieren.

Einleitung

Die Bildung von Proteinmustern auf Zellmembranen innerhalb subzellulärer Regionen führt zu zahlreichen biologischen Prozessen, einschließlich Migration, Teilung und lokalisierter Zell-zu-Zell-Kommunikation ^1,2. Diese Proteinmuster sind räumlich und zeitlich reguliert und hochdynamisch. Die Replikation solcher Proteinmuster in synthetischen Zellen ist unerlässlich, um zelluläre Prozesse, die aus ihnen entstehen, nachzuahmen und um besser zu verstehen, wie eine solche Regulation auf molekularer Ebene funktioniert. Analog zu dem, was für Membranen in lebenden Zellen beobachtet wird, müssen Methoden zur Erzeugung von Proteinmustern auf künstlichen Membranen deren Dynamik erfassen und eine präzise raumzeitliche Kontrolle ermöglichen.

Unter den verschiedenen Reizen zeichnet sich das Licht durch die höchste raumzeitliche Kontrolle und mehrere zusätzliche Vorteile aus³. Durch die Regulierung mit Licht ist es einfach, einen gewünschten Bereich zu jeder gewünschten Zeit mit unübertroffener Präzision zu beleuchten. Darüber hinaus bietet das Licht eine hohe Abstimmbarkeit, da sowohl die Lichtintensität als auch die Impulsdauer eingestellt werden können. Darüber hinaus ist sichtbares Licht für Biomoleküle, einschließlich Proteine, ungefährlich, und es ist sogar möglich, mehrere Funktionalitäten mit unterschiedlichen Wellenlängen zu adressieren. Daher erweisen sich lichtempfindliche Ansätze, die auf sichtbarem Licht basieren, als vielversprechende Wege für die kontrollierte und biorthogonale Regulation von Proteinmustern in Raum und Zeit ^4,5,6. Die Verwendung von photoschaltbaren Proteinpaaren aus der Optogenetik, die als lichtinduzierbare Dimerizer wirken, bietet eine einfache Methode zur Rekrutierung spezifischer Proteine für Membranen. Insbesondere wurden Proteinmuster auf künstlichen Membranen erfolgreich unter Verwendung der durch blaues Licht ausgelösten Wechselwirkung zwischen iLID (verbessertes lichtinduzierbares Dimer, basierend auf der photoschaltbaren LOV2-Domäne von Avena sativa) und Nano (Wildtyp-SspB)^7,8, dem blaulichtinduzierbaren SpyTag-System (BLISS)⁹, dem grünlichtresponsiven Proteintetramer CarH¹⁰ und der rotlichtinduzierbaren Wechselwirkung zwischen PhyB und PIF6¹¹ gebildet.

Es wurde gezeigt, dass die photoschaltbare Wechselwirkung zwischen iLID und Nano⁵ genutzt werden kann, um Proteine auf Modellmembranen mit blauem Licht zu photostrukturieren⁷. Die iLID/Nano-Wechselwirkung ist im Dunkeln reversibel, hochspezifisch und funktioniert unter physiologischen Bedingungen. Die Verankerung von iLID an Lipidmembranmodellen, wie z. B. riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) oder gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs), ermöglicht eine lichtregulierte Rekrutierung von Nano an diese Membranen, die im Dunkeln reversibel ist. Insbesondere haben wir beobachtet, dass die Einführung einer ungeordneten Domäne in den N-Terminus von iLID (was zu einem Protein namens disiLID führt) als Bindung an eine Modelllipidmembran die Effizienz der Nanorekrutierung und die Reversionsdynamik verbessert⁸.

Unter Verwendung der disiLID/Nano-Wechselwirkung haben wir eine Methode entwickelt, mit der sich kontrastreiche Muster von Nano-fusionierten Proteinen (POI) auf SLBs und den externen Membranen von GUVs erzeugen lassen. Diese Methode ermöglicht die Erstellung von Proteinmustern mit bemerkenswerter räumlicher und zeitlicher Auflösung und hoher Reversibilität innerhalb von Minuten. Das detaillierte Protokoll beschreibt den Prozess der lokalen Rekrutierung von Proteinen auf künstlichen Membranen. Konkret wird dies durch die Immobilisierung einer biotinylierten Version von disiLID auf SLBs und GUVs durch die Biotin-Streptavidin (SAv)-Interaktion erreicht. Anschließend wird fluoreszenzmarkiertes Nano (mOrange-Nano) unter Blaulichtbeleuchtung an diese disiLID-funktionalisierten Membranen rekrutiert. Unser experimentelles Protokoll bietet einen unkomplizierten und anpassungsfähigen Ansatz, um eine lokalisierte Proteinrekrutierung an Membranen zu erreichen. Wichtig ist, dass diese Methodik nicht auf die berichteten SLB- und GUV-Grenzflächen oder mOrange-Nano beschränkt ist. Es kann auf andere disiLID-funktionalisierte Materialien und Proteine ausgeweitet werden, die mit Nano fusioniert sind.

Protokoll

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Biotinyliertes disiLID (b-disiLID) und mOrange-Nano (siehe Materialtabelle) exprimieren und reinigen nach den zuvor beschriebenen Verfahren ^7,8.
2. Bereiten Sie Lipidmischungen in Glasfläschchen mit der ausgewählten Lipidzusammensetzung und den ausgewählten Konzentrationen vor. Zuerst werden die Lipide in Chloroform aufgelöst, um eine endgültige Lipidlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu erhalten.
   1. Lipide werden gemischt, um eine Zusammensetzung von 94,9 mol% 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminN-(cap biotinyl)natriumsalz (DOPE-biotin) und 0,1 mol% 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanin (DiD) zu erhalten (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Lipidmischung kann mit unterschiedlichen Verhältnissen und DOPE-Biotin-Konzentrationen und/oder verschiedenen Membranfarbstoffen eingestellt werden. Die empfohlene DOPE-Biotin-Konzentration (5 mol%) ermöglicht die Bildung einer Streptavidin (SAv)-Schicht mit hoher Dichte in den folgenden Schritten.
3. Präparation kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs) nach den zuvor beschriebenen Methoden ^7,8,12. Für diesen Schritt empfiehlt es sich, SUVs mit einem Durchmesser ≤100 nm vorzubereiten.
4. Für diese Studie wird die Beschallungsmethode eingesetzt. Zuerst wird die Chloroformlösung im Glasfläschchen mit einem Stickstoffstrom verdampft, während die Fläschchen gedreht werden, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Entfernen Sie anschließend das restliche Chloroform für mindestens 1 h unter Vakuum.
   1. Rehydrieren Sie den getrockneten Film in Reinstwasser mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml Lipiden durch Vortexen. Zum Schluss beschallen Sie die erhaltene Lösung 10 Minuten lang, bis die undurchsichtige Lösung klar wird.
      HINWEIS: Lagern Sie die Lipidmischung in einem Mikrozentrifugenröhrchen im Kühlschrank für maximal 2 Wochen. Es können auch verschiedene SUV-Aufbereitungsmethoden (z. B. Extrusionsverfahren) verwendet werden, solange die Größe der endgültigen SUVs ≤ 100 nm beträgt.

2. mOrange-Nano-Rekrutierung zu disiLID-funktionalisierten SLBs

1. 150 μl 2 M NaOH in jede Vertiefung der 18-Well-Glasbodenkammer mit μ Objektträger geben (siehe Materialtabelle) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie anschließend das NaOH und waschen Sie die Vertiefungen 3-5 Mal, zuerst mit 150 μL Reinstwasser, dann 3 Mal mit 150 μL Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) mit 10 mM CaCl₂.
2. Geben Sie 15 μl frisch zubereitete SUVs (Stammkonzentration 1 mg/ml in Wasser) in die Vertiefungen mit 150 μl Puffer mit 10 mM CaCl₂ , um eine Verdünnung von SUVs um etwa den Faktor 10 im Puffer zu erhalten. Lassen Sie die SUVs 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubationszeit werden biotinylierte SLBs gebildet.
3. Waschen Sie die SLBs mindestens 7 Mal mit Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) ohne CaCl₂ , indem Sie zuerst die Lösung entfernen und anschließend in jedem Schritt frischen Puffer hinzufügen. Es wird empfohlen, für jeden Waschschritt 80 μl Puffer zu verwenden.
   HINWEIS: Eine optimale Reinigung der SLBs wird erreicht, indem die frische Lösung mehrmals auf und ab pipettiert wird, ohne die Oberfläche zu berühren. Das Pipettieren der Lösung in den Vertiefungen, die die neu gebildeten SLBs enthalten, sollte schonend erfolgen, um die Bildung kleiner Luftblasen zu reduzieren, die die gebildeten SLBs beschädigen würden. Ab diesem Zeitpunkt sollten die Vertiefungen ein ausreichendes Volumen an Puffer enthalten, um ein Austrocknen der SLBs zu verhindern.
4. Für die weitere Funktionalisierung der biotinylierten SLBs mit SAv wird eine Lösung von SAv bis zu einer Endkonzentration von 250 nM zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Entfernen Sie anschließend den Überschuss an SAv, indem Sie ihn mindestens 5 Mal mit einem Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) waschen.
5. Halten Sie die Proben von diesem Moment an unter rotes Schutzlicht, um eine unerwünschte Photoaktivierung von photoschaltbaren Proteinen zu vermeiden. Geben Sie b-disiILD (siehe Materialtabelle) zu einer Endkonzentration von 1 μM in der Vertiefung hinzu. Entfernen Sie nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur das überschüssige Protein, indem Sie es mindestens 5 Mal mit Puffer waschen.
6. Geben Sie mOrange-Nano (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 200 nM und halten Sie die Probe im Dunkeln, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken.
7. Legen Sie den μ-Objektträger unter das Fluoreszenzmikroskop und passen Sie die Bildgebungseinstellungen an. Stellen Sie den 552 nm Laser für die Anregung von mOrange-Nano ein. Passen Sie den Emissionsbereich an, um das mOrange-Signal zu optimieren. Die Photoaktivierung von disiLID wird mit einem 488 nm Laser unter Verwendung von Lichtpulsen im Abstand von 2,58 s erreicht.

3. Vorbereitung von GUVs

1. Eine 5%ige (w/v) Lösung von Polyvinylalkohol (PVA, siehe Materialtabelle) (MW: 145 000 g/mol) mit 100 mM Saccharose in Reinstwasser herstellen und über Nacht bei 80 °C bei 400 U/min mischen.
2. Bereiten Sie eine Lipidlösung in Chloroform mit der gewünschten Zusammensetzung vor (Endkonzentration 10 mg/ml). Für diese Methode wird eine Zusammensetzung empfohlen, die aus 10 mg/ml POPC, 10 mol% 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG), 2 mol% DOPE-biotin und 1 mol% DiD besteht (siehe Materialtabelle).
3. Bereiten Sie GUVs mit der Hydratationstechnik ^7,8 vor. Zuerst werden 40 μl der vorbereiteten PVA-Lösung als homogene dünne Schicht auf einen 60 mm x 24 mm großen Objektträger verteilt, vorzugsweise mit einer Pipettenspitze. Anschließend die dünne Schicht bei 50 °C 30 min trocknen.
4. 5 μl der Lipidlösung mit einer Nadel auf die PVA-Schicht verteilen und bei 30 °C 1 h trocknen lassen.
5. Montieren Sie eine Kammer auf dem funktionalisierten Glasobjektträger mit einem Abstandshalter (~40 mm × 24 mm × 2 mm, siehe Materialtabelle) und einem zweiten Objektträger.
6. 1 ml Rehydrationspuffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) für 1 h bei Raumtemperatur in die Kammer geben, um GUVs zu bilden. Nach 1 h die Kammer umdrehen und mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Glasoberflächen klopfen.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Glasschieber auf einer Seite, um die gebaute Kammer zu öffnen, und entnehmen Sie die GUVs mit einer Pipette.
8. Geben Sie die Lösung in ein Plastikröhrchen und lassen Sie die GUVs 2 Stunden lang absetzen.

4. mOrange-Nano Rekrutierung zu disiLID-funktionalisierten GUVs

1. Geben Sie eine Lösung von SAv zu den frisch geernteten GUVs und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ziehen.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten mit rotem Schutzlicht durchgeführt werden, um eine Photoaktivierung von disiLID zu vermeiden.
2. Geben Sie 1 μM b-disiLID in die GUVs-Lösung und legen Sie die Probe 30 Minuten lang in die Dunkelheit, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken.
3. Eine 18-Well-Glasbodenkammer mit μ Objektträger 10 Minuten lang mit 150 μl BSA-Lösung (3 % w/v in Wasser) vorbehandeln. Entfernen Sie anschließend die BSA-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal mit 150 μl Reinstwasser.
4. Geben Sie 145 μl 200 nM mOrange-Nano in Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) in die Vertiefung.
5. Geben Sie anschließend 5 μl mit b-disiLID dekorierte GUVs in die Lösung und warten Sie ~15 Minuten, bis sich die GUVs abgesetzt haben.
6. Legen Sie den μ-Objektträger unter das konfokale Mikroskop. Die Probe wird bei 552 nm angeregt, um die mOrange (λ_ex = 557 nm; λ_em = 576 nm) Fluoreszenz sichtbar zu machen, und bei 638 nm, um DiD (λ_ex = 644 nm; λ_em = 665 nm) in den GUV-Membranen sichtbar zu machen. Die mOrange-Nano-Rekrutierung wird alle 5,3 s mit blauen Lichtpulsen (488 nm, Intensität 1%) ausgelöst, um unerwünschte Photobleaching-Effekte zu minimieren.
   HINWEIS: Die Anregungswellenlängen können je nach verwendetem Mikroskoptyp angepasst werden. Andere gängige Anregungswellenlängen, die für Mikroskope verfügbar sind, sind 532 nm oder 561 nm und 633 nm, 647 nm, 639 nm oder 640 nm Laser.

Ergebnisse

Die beschriebenen Verfahren ermöglichen die Bildung von SLBs, um mOrange-Nano auf den synthetischen Membranen zu rekrutieren. Die Bildung von definiertem mOrange-Nano, das auf den mit b-disiLID funktionalisierten SLBs strukturiert ist, ist in Abbildung 1A dargestellt. Wenn eine quadratische (24 μm × 24 μm) Region of Interest (ROI) auf dem SLB mit 488 nm blauem Licht beleuchtet wird, wird ein schneller Anstieg des Fluoreszenzsignals im mOrange-Kanal (rot dargestellt) im ROI innerhalb von 200 s beobachtet. Das Muster zeigt sehr definierte und scharfe Kanten (Abbildung 1B), was auf eine hohe räumliche Kontrolle über den photoaktivierten Bereich hinweist. Die Interaktion ist schnell und vollständig reversibel, da die Beleuchtung mit blauem Licht unterbrochen wird. Diese Methode ermöglicht auch die Bildung von Mustern über mehrere Beleuchtungszyklen (Abbildung 2). Wechselnde Zyklen von ~200 s blauem Licht und 200 s dunklem Licht führen zu einer reversiblen Rekrutierung von mOrange-Nano im ausgewählten Bereich für ein Vielfaches mit vergleichbaren Werten der Δ-Intensität der Fluoreszenz in den Mustern.

Abbildung 3 zeigt die schematische Darstellung der GUVs-Aufbereitung. Die Rekrutierung von mOrange-Nano wird auch auf GUVs beobachtet. Es wird gezeigt, dass GUVs, die im Dunkeln platziert werden, keine mOrange-Fluoreszenz aufweisen (Abbildung 4A). Da die GUVs global mit blauem Licht beleuchtet werden, wird mOrange-Fluoreszenz beobachtet, die mit dem GUV-Membranfarbstoff (DiD) kolokalisiert. Die Wechselwirkung ist hochgradig reversibel, da die Beleuchtung beendet wird. Die Quantifizierung der mOrange-Intensität an der GUV-Membran über die Zeit zeigt die schnelle und effektive Rekrutierung von Proteinen sowie die vollständige Reversibilität (Abbildung 4B).

Abbildung 1: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von SLBs, die mit b-disiLID funktionalisiert wurden. Die Fluoreszenzbilder in Gegenwart von mOrange-Nano vor (A) und während (B) lokaler Blaulichtbeleuchtung (488 nm) in der ROI. Maßstabsbalken = 20 μm. (C) Fluoreszenzintensität von mOrange gemessen im ROI für SLBs, die mit b-disiLID funktionalisiert wurden (bei = 200 s). Die Abbildung ist eine Adaption von Di Iorio et ^al.8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Fluoreszenzintensität von mOrange, die im ROI auf SLBs rekrutiert wurde, die mit b-disiLID dekoriert waren, während drei Rekrutierungszyklen. Nach jedem Photoaktivierungsschritt stieg die mOrange-Nano-Fluoreszenz innerhalb des ROI an. Das Muster erreicht die Sättigung innerhalb von 120 s, und die Fluoreszenz nimmt innerhalb von 120 s fast auf Hintergrundniveau ab. Es wird kein Verlust der Musterqualität über verschiedene Blaulicht-/Dunkelzyklen beobachtet. Die Abbildung ist eine Adaption von Di Iorio et ^al.8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der GUVs-Aufbereitung mit der schonenden Hydratationsmethode. Das Schema bietet eine visuelle Darstellung der einzelnen Stufen und der Kammer, die aus zwei Glasrutschen und einem Abstandhalter gebaut wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Fluoreszenzmikroskopische Messungen der lichtabhängigen Rekrutierung von mOrange-Nano auf GUVs-Membranen. (A) Fluoreszenzbilder eines disiLID-funktionalisierten GUV in Gegenwart von mOrange-Nano. In Grün ist der Membranfarbstoff der GUVs und in Rot die mOrange-Fluoreszenz vor, während und nach der Beleuchtung mit blauem Licht zu sehen. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Fluoreszenzintensität von mOrange, lokalisiert auf GUV über die Zeit. Bei Beleuchtung erreicht die mOrange-Fluoreszenz (rot dargestellt) auf der Lipidmembran innerhalb von 60 s die maximale Intensität, mit einer 5,9-fachen Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn die Beleuchtung gestoppt wird, sinkt die mOrange-Fluoreszenz innerhalb von 60 s auf fast Vorbeleuchtungswerte (mit einer Wiederfindung von 90 %). Die Abbildung ist eine Adaption von Di Iorio et ^al.8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Wir haben eine Methode zur lokalisierten Rekrutierung von mOrange-Nano-Proteinen auf Modellmembranen, wie z.B. gestützten Lipiddoppelschichten und riesigen unilamellären Vesikel, unter Verwendung des photoschaltbaren Proteins disiLID⁸ beschrieben. Aspekte, die zur Qualität des Musters beitragen, sind unter anderem die Qualität der Proteine sowie die gute Qualität der SLBs und GUVs.

Um eine gute Proteinqualität nach der Expression und Aufreinigung zu gewährleisten, ist es wichtig, zunächst die photoschaltbaren Eigenschaften von disiLID zu bewerten. Zu diesem Zweck muss die Absorption des FMN-Cofaktors im Dunkeln und nach Blaulichtbeleuchtung gemessen werden. Es wird erwartet, dass die UV-Vis-Spektren von disiLID den charakteristischen Triple-Peak des Cofaktors FMN im Dunkeln zeigen, der bei Blaulichtbeleuchtung deutlich abnimmt und sich im Dunkeln erholt¹³. Dieses photoschaltbare Verhalten ist entscheidend, um in den folgenden Schritten eine reproduzierbare und reversible Rekrutierung zu erhalten. Die Arbeit mit schützendem rotem Licht und die Exposition von disiLID mit minimaler externer Beleuchtung während der Probenvorbereitung erhöht die Leistung der Experimente.

Ein weiterer kritischer Schritt, und vielleicht der entscheidendste, ist die Bildung geeigneter SLBs. Defekte in den Membranen und/oder die Bildung inhomogener SLBs (d.h. das Vorhandensein von Multilayern oder gepatchten SLBs) beeinträchtigen die Qualität der Proteinstrukturierung. Daher wird unerfahrenen Anwendern empfohlen, das Protokoll zu reproduzieren, indem die SUVs mit einigen Membranfarbstoffen wie DiD und DiO markiert werden, um fluoreszenzmarkierte SLBs zu bilden. Auf diese Weise können die Eigenschaften und die Qualität von SLBs mit der Fluoreszenzmikroskopie gut charakterisiert werden. FRAP-Messungen stellen einen typischen Ansatz zur Beurteilung der Qualität eines SLB dar, indem die Fließfähigkeit der Membranen bewertet wird. Alternativ kann im Falle von biotinylierten SLBs, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, fluoreszenzmarkiertes SAv (z. B. Atto 488-SAv) verwendet werden, um die Qualität von SLBs sichtbar zu machen und zu bewerten.

Der erste Teil des Protokolls beschreibt die Bildung von Mustern auf SLBs. Um ein optimales Ergebnis zu gewährleisten, ist es wichtig, mOrange-Nano auf die SLBs zu geben und die Probe 15 Minuten lang im Dunkeln inkubieren zu lassen. Bei der Photoaktivierung ist die Auswahl des ROI nicht auf eine bestimmte Größe beschränkt. Allerdings müssen die Laserintensität und die Belichtungszeit reguliert werden, um unerwünschtes Photobleaching der fluoreszierenden Proteine zu reduzieren.

Diese Methode ist nicht auf biotinylierte Proteine beschränkt, und andere Ansätze können verwendet werden, um disiLID an SLBs zu verankern. Zum Beispiel kann His-markiertes disiLID exprimiert und an Ni-NTA-haltigen SLBs verankert werden. Es ist jedoch entscheidend, Nano und disiLID mit unterschiedlichen Tags zu exprimieren, um einen Ersatz der Proteine auf den SLBs zu vermeiden. Diese Methode ermöglicht es auch, die Reihenfolge der Proteine umzukehren, wodurch SLBs mit Nano funktionalisiert und disiLID (oder disiLID-fusionierte Proteine) bei Blaulichtbeleuchtung rekrutiert werden.

Zur dynamischen Kontrolle der Proteinlokalisation sollte die reversible Lokalisierung des Proteins in die ausgewählte Region wiederholt möglich sein. Um dies zu erreichen, ist die Konzentration von Nano (200 nM) in der Lösung ein kritischer Parameter, um eine hohe Reversibilität zu erreichen.

Ein weiteres Problem ist die Rekrutierung von Nano auf der disiLID-funktionalisierten GUV-Oberfläche. Wie im Fall der Proteinstrukturierung auf SLBs kann diese Methode auf verschiedene Membranfunktionalisierungsstrategien erweitert werden. In diesem Protokoll wurde das gesamte GUV mit blauem Licht beleuchtet, um mOrange-Nano auf der gesamten GUV-Oberfläche zu rekrutieren. Die Selektion kleiner ROIs, die auf der GUV-Membran lokalisiert sind, sollte jedoch zu einer präzisen Lokalisierung von Proteinen in einem engeren Bereich führen.

Diese Methode stellt nur eine Einschränkung dar, die mit der Wahl des Fluorophors zusammenhängt, das für die Abbildung der Nanorekrutierung an der Membran der SUVs oder GUVs verwendet wird. Insbesondere müssen Fluorophore mit einem Anregungsspektrum im Blaulichtbereich vermieden werden, da ihre Verwendung die Photoaktivierung von (dis)iLID stört. Daher wird für diese Art von Experimenten die Wahl von Fluorophoren im Grün- oder Rotlichtbereich (z. B. mOrange oder Cy5) empfohlen.

Das disiLID-Design bietet eine einfache und anpassungsfähige Möglichkeit, die lokale Proteinrekrutierung an Membranen zu verbessern und erweitert den Dynamikbereich von iLID und Nano aus der Optogenetik⁴. Diese Methoden konzentrieren sich auf die Rekrutierung von Nano auf mimische Membranen wie Lipiddoppelschichten und GUVs. Dennoch ist dieser Ansatz auf die zahlreichen optogenetischen Werkzeuge in Zellen erweiterbar, bei denen (dis)iLID oder Nano an eine Membran gebunden sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
µ-Slide 18 Well	Ibidi	81817	Für SLB-Vorbereitung
25 & micro; L Mikroliter Spritze	Hamilton	Modell 702 N	Zur Herstellung von Lipidmischungen und zum Verteilen der Lipidlösung auf der PVA-Schicht
Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(cap biotinyl)) (Natriumsalz)	Avanti Polar Lipids	870273C	Für die Herstellung von SUVs
CaCl2 (Calciumchlorid)	Sigma-Aldrich	C5670	Für SLB-Bildung
Deckgläser 24 mm x 60 mm	Engelbrecht	K12460	Für die Bildung von GUVs
DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanin)	Thermo Fisher Scientific	D7757	Membranfarbstoff
disiLID			Sequenz: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF
DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin)	Avanti Polar Lipids	850375P	Für SUVs Lipidzusammensetzung
Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen	Merk	EP0030108116-100EA	Zum Sammeln von frisch hergestellten GUVs
mOrange-Nano			Sequenz: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKS alm FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSSNNNNNNNNN EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQQ taklkvtkgg PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG
NaCl (Natriumchlorid)	Sigma-Aldrich	S9888	Für Puffer
NaOH (Natriumhydroxid)	Sigma-Aldrich	1064980500	Für Oberflächenaktivierung bei SLB-Bildung
POPC (1-Palmitoyl-2- Oleoylphosphatidylcholin)	Avanti Polar Lipids	850457C	Für GUVs, Lipidzusammensetzung
PVA (Polyvinylalkohol), vollständig hydrolysiert,	Sigma-Aldrich	8148940101	Für GUVs-Bildung
SP8, konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica
Streptavidin	, TermoFisher	434301
Saccharose	Sigma-Aldrich	84097	Für die Bildung von GUVs
Trishydrochlorid	Sigma-Aldrich	10812846001	Für Puffer