Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.
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Methodenartikel
Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Protein-DNA-Wechselwirkungen untermauern essentielle zelluläre Prozesse. Das Verständnis dieser Wechselwirkungen ist entscheidend für die Aufklärung der molekularen Mechanismen verschiedener Signalwege. Schlüsselfaktoren wie die Struktur, Sequenz und Länge eines DNA-Moleküls können die Proteinbindung maßgeblich beeinflussen. Die Bioschichtinterferometrie (BLI) ist eine markierungsfreie Technik, die die Bindungskinetik zwischen Molekülen misst und einen einfachen und präzisen Ansatz zur quantitativen Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen bietet. Ein großer Vorteil von BLI gegenüber herkömmlichen gelbasierten Methoden ist die Fähigkeit, Echtzeitdaten über die Bindungskinetik zu liefern, was eine genaue Messung der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) für dynamische Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglicht. In diesem Artikel wird ein grundlegendes Protokoll zur Bestimmung desKD-Wertes der Wechselwirkung zwischen einem DNA-Replikationsprotein, dem Replikationsprotein A (RPA) und einem einzelsträngigen DNA-Substrat (ssDNA) vorgestellt. RPA bindet ssDNA mit hoher Affinität, muss aber auch leicht verdrängt werden, um nachfolgende Proteininteraktionen innerhalb biologischer Signalwege zu erleichtern. Im beschriebenen BLI-Assay wird biotinylierte ssDNA auf einem Streptavidin-beschichteten Biosensor immobilisiert. Anschließend wird die Bindungskinetik (Assoziation und Dissoziation) von RPA an die Biosensor-gebundene DNA gemessen. Die resultierenden Daten werden analysiert, um mit Hilfe von Systemsoftware genaue Werte für die Assoziationsratenkonstante (ka), die Dissoziationsratenkonstante (kd) und die Gleichgewichtsbindungskonstante (KD) abzuleiten.
Einleitung
Zelluläre Proteine spielen eine zentrale Rolle bei der Orchestrierung der komplexen biologischen Prozesse, die in lebenden Organismen ablaufen. Das optimale Funktionieren dieser Signalwege hängt vom Zusammenspiel zwischen Proteinen und anderen Biomolekülen innerhalb der Zelle ab, einschließlich der Wechselwirkungen mit Partnerproteinen und Nukleinsäuren1. Um die Feinheiten zellulärer Prozesse zu verstehen, ist daher ein tiefes Verständnis der Dynamik der Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen erforderlich.
Traditionell wurden Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen mit Hilfe von elektro....
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Protokoll
Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung von Ködern, Analyten, Puffern und Reinigung des Tropfenhalters
- Einrichten des Instruments: Schalten Sie das Gerät mindestens 1 Stunde vor Beginn des Experiments ein. Dadurch kann sich die Lampe erwärmen.
- Vorbereitung von Stripping- und Reinigungspuffern
- Stripping-Puffer: Bereiten Sie 50 mL 0,15 M Phosphorsäure [pH 2,0] vor.
- Reinigungspuffer: Bereiten Sie 10 mL mit 0,5 N HCl vor.
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Ergebnisse
Bei BLI wird weißes Licht von der Grenzfläche von Bioschicht/Puffer und der internen Referenzgrenzfläche zum Spektrometer reflektiert. Das resultierende Interferenzmuster wird aufgezeichnet und die spektrale Verschiebung über einen bestimmten Zeitraum gemessen und als Antwort der Bindungskurven in nm dargestellt. Eine repräsentative Abbildung, die die Biosensorspitze mit und ohne Analytbindung und die entsprechende spektrale Wellenlängenverschiebung (nm) zeigt, ist in Abbildung 1 dargestellt.......
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Diskussion
Die Fähigkeit, die Bindungskinetik eines Proteins an sein Substrat unter Verwendung von BLI zu analysieren, bietet die Möglichkeit, die spezifischen Faktoren (wie Sequenz, Struktur oder Länge einer DNA), die die Protein-DNA-Wechselwirkungen innerhalb der Zelle steuern, zu isolieren und zu charakterisieren19. Das Octet N1-System, das auf den Prinzipien der Biolayer-Interferometrie basiert, ermöglicht die quantitative Messung von Protein-Protein- und Protein-Nuklein.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu deklarieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Science Foundation (1929346) und der American Cancer Society (RSG-21-028-01) finanziert. Wir möchten uns auch bei den Mitgliedern des Balakrishnan-Labors für hilfreiche Gespräche bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Globe Scientific | 111554A | |
| 96 Well Standard Schwarz Mikroplatte | Dot Scientific | 4ti-0223 | |
| Biotinyliertes Poly dT Oligonukleotid | IDT | ||
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Dot Scientific | DSD11000-10 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Dot Scientific | DSE57020-500 | |
| Salzsäure | Fisher Wissenschaftlich | A144-500 | |
| Kimtec Science Kimwipes | Kimtech | 34120 | |
| Octet N1 Software | Sartorius | 1.4.0.13 | |
| Octet SA Biosensor | Sartorius | 18-5019 | |
| PBS pH 7,2 (10x) | Gibco | 1666711 | |
| Personal Assay Octet N1 System | Sartorius | ||
| Phosphorsäure | Ward's Science | 470302-024 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020-5000 | |
| Tris Base | Dot | Scientific DST60040-5000 | |
| Tween20 | Bio-Rad | 170-6531 |
Referenzen
- Kalodimos, C. G., et al. Structure and flexibility adaptation in non-specific and specific protein-DNA complexes. Science. 305 (5682), 386-389 (2004).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-op....
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Nachdrucke und Genehmigungen
