Schnelle Trennung und Darstellung von aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffen in Sipunculus nudus durch Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Protokoll (PAGE) vor, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Sipunculus nudus schnell zu trennen und darzustellen.

Zusammenfassung

Fibrinogenolytika, die Fibrinogen direkt auflösen können, werden häufig in der Antikoagulationsbehandlung eingesetzt. Im Allgemeinen erfordert die Identifizierung neuer fibrinogenolytischer Wirkstoffe zunächst die Trennung der einzelnen Komponenten und dann die Überprüfung ihrer fibrinogenolytischen Aktivitäten. Derzeit werden die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und die Chromatographie hauptsächlich in der Trennphase eingesetzt. In der Zwischenzeit werden in der Regel die auf PAGE basierenden Fibrinogenplattenassays und Reaktionsprodukte verwendet, um ihre fibrinogenolytischen Aktivitäten anzuzeigen. Wegen der räumlich-zeitlichen Trennung dieser beiden Stadien ist es jedoch unmöglich, die fibrinogenolytischen Wirkstoffe mit ein und demselben Gel zu trennen und auszustellen. Um die Trennungs- und Darstellungsprozesse der Fibrinogenolytika-Identifizierung zu vereinfachen, haben wir in dieser Studie eine neue Fibrinogen-PAGE-Methode entwickelt, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Erdnusswürmern (Sipunculus nudus) schnell zu trennen und darzustellen. Diese Methode umfasst die Fibrinogen-PAGE-Vorbereitung, Elektrophorese, Renaturierung, Inkubation, Färbung und Entfärbung. Die fibrinogenolytische Aktivität und das Molekulargewicht des Proteins können gleichzeitig nachgewiesen werden. Nach dieser Methode konnten wir innerhalb von 6 h mehr als einen aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoff des Erdnusswurmhomogenats nachweisen. Darüber hinaus ist diese Fibrinogen-PAGE-Methode zeit- und kostensparend. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe der anderen Organismen zu untersuchen.

Einleitung

In den letzten Jahren sind thrombotische Erkrankungen aufgrund des anhaltenden Anstiegs thrombotischer Erkrankungen zu einem neuen großen globalen Gesundheitsproblem geworden¹. Gegenwärtig werden Antithrombotika in drei Gruppen eingeteilt: Thrombozytenaggregationshemmer, Antikoagulanzien und Thrombolytika. Unter ihnen sind thrombolytische Medikamente wie Urokinase (UK), Gewebeplasminogenaktivator (tPA) usw. die einzigen klinisch verwendeten Medikamente, die den Thrombus² hydrolysieren können. In der Zwischenzeit werden durch die Identifizierung neuartiger Thrombolytika sicherere und wirksamere Thrombolytika entwickelt³.

Die Identifizierung neuartiger Thrombolytika ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv und umfasst hauptsächlich die Trenn-/Reinigungs- und Charakterisierungs-/Kontrollphasen. Ersteres dient dazu, jede Komponente zu trennen, und letzteres dient dazu, ihre fibrino(geno)lytischen Aktivitäten anzuzeigen ^4,5. Obwohl es in früheren Studien gelungen ist, ein neuartiges fibrino(geno)lytisches Enzym (sFE) aus dem Erdnusswurm (Sipunculus nudus) mittels Affinitätschromatographie und Fibrin(ogen)-Plattenassay ^6,7,8 zu isolieren, sind diese Prozesse sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Zunächst ist es notwendig zu bestimmen, ob die Erdnusswurm-Homogenate eine fibrino(geno)lytische Aktivität aufweisen, und zwar nach dem Fibrin(ogen)-Plattenverfahren und den Reaktionsprodukten auf der Grundlage von SEITE⁹. Anschließend muss eine Reihe von Chromatographien, wie z. B. die Ionenaustauschchromatographie, die Gelfiltrationschromatographie, die Affinitätschromatographie und andere Verfahren zur Trennung und Reinigung durchgeführt werden^10,11. Anschließend wird der Fibrinplatten-Assay erneut durchgeführt, um die fibrinogenolytische Aktivität jeder getrennten Komponente zu überprüfen. Schließlich werden native-PAGE und Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE durchgeführt, um das Molekulargewicht der aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffe¹² zu bestimmen. Daher ist es wichtig, die aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffe schnell zu trennen und anzuzeigen.

Um die aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffe in den Erdnusswurm-Homogenaten schnell zu trennen und darzustellen, wurde eine neue Fibrinogen-PAGE-Methode entwickelt, bei der die PAGE- und die Fibrinogenplattenmethode kombiniert wurden, d.h. die Substrate der fibrinogenolytischen Wirkstoffe Fibrinogen wurden dem nativen PAGE-Gel zugesetzt. Nach native-PAGE wurden die Komponenten nach ihrem Molekulargewicht getrennt. In der Zwischenzeit kann jede aktive fibrinogenolytische Komponente durch Färben dargestellt werden. Mit dieser Methode konnten wir innerhalb von 6 h mehr als einen aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoff des Erdnusswurm-Homogenats nachweisen. Darüber hinaus ist diese Fibrinogen-PAGE-Methode zeit- und kostensparend. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe der anderen Organismen zu untersuchen.

Protokoll

1. Zubereitung des Erdnusswurm-Homogenats

1. Geben Sie 50 g Erdnusswürmer und 150 ml Kochsalzlösung in den Homogenisator.
2. Homogenisieren Sie bei 24000 U/min für 60 s.
   HINWEIS: 3 Mal wiederholen.
3. Das Homogenat wird bei 9710 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
4. Sammeln Sie den Überstand als Erdnusswurm-Homogenat für weitere Studien.

2. Fibrinogen-PAGE Gel-Vorbereitung

1. Wiegen Sie 0,01 g Fibrinogen in ein 50-ml-Glasbecherglas.
2. 1,9 mL DDH₂O, 1,3 mL Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) und 0,05 mL SDS (10 % w/v) in das Becherglas geben; Durch Pipettieren gut mischen.
3. Den Becher 30 Min. bei 37 °C stellen.
   HINWEIS: In diesem Schritt wird das Fibrinogen aufgelöst.
4. Fügen Sie 1,7 mL Acrylamid (30 %, w/v), 0,05 mL Ammoniumpersulfat (APS; 10 %, w/v), 0,002 mL TEMED hinzu; Durch Pipettieren gut mischen.
   HINWEIS: Dies ist ein Trenngel.
5. Gießen Sie das Trenngel in eine 10-Well-Gelform.
6. Geben Sie 2 mL DDH₂O in die Gelform; Warten Sie 30 Minuten.
7. Entferne das Wasser gründlich, indem du die Form auf den Kopf stellst.
8. 1,4 mL DDH₂O, 0,25 mL Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL SDS (10%, w/v), 0,33 mL Acrylamid (30%, w/v), 0,02 mL APS (10%, w/v), 0,002 mL Tetramethylethylendiamin (TEMED) in das Becherglas geben; Durch Pipettieren gut mischen.
   HINWEIS: Dies ist das Laden von Gel.
9. Gießen Sie das Ladegel in dieselbe Gelform wie in Schritt 2.5; Führe den Kamm sofort ein.
   HINWEIS: Das hier verwendete Fibrinogen-PAGE-Gel setzte sich aus dem Fibrinogen (0,2%) enthaltendem Trenngel und dem Ladegel zusammen. Die Konzentration von Fibrinogen kann je nach Bedarf angepasst werden.

3. Elektrophorese

1. Geben Sie das vorbereitete Fibrinogen-PAGE-Gel zusammen mit der Leimform in den Elektrophoresetank; Gießen Sie 1300 ml Elektrophoreselösung (1,963 g Tris, 12,22 g Glycin, 0,65 g SDS und 1300 ml DDH₂O) in den Tank; Nimm den Kamm heraus.
2. 5 μl 5x nicht denaturierender Ladepuffer zu den 20 μl sFE und 20 μl Erdnusswurm-Homogenat hinzufügen; durch Pipettieren gut mischen; Laden Sie sie in das vorbereitete Fibrinogen-PAGE-Gel.
   HINWEIS: Kochen Sie die Mischung nicht. sFE ist ein fibrino(geno)lytisches Enzym, das zuvor ^6,7,8 identifiziert wurde und in dieser Studie als Positivkontrolle verwendet wird. Erdnusswurm-Homogenat ist die Probe, die nachgewiesen werden soll. Nicht denaturierender Ladepuffer ohne Bromphenolblau, β-Mercaptoethanol und SDS im Vergleich zum SDS-PAGE-Ladepuffer. Jede Probenspur wird mit dem 1x SDS-PAGE-Ladepuffer getrennt, um die Bewegung des Proteins eindeutig zu detektieren.
3. Führen Sie die Elektrophorese bei 80 V für 30 min oder 120 V für 20 min durch.
4. Entfernen Sie das Fibrinogen-PAGE-Gel aus der Leimform.

4. Renaturierung

1. Übertragen Sie das Fibrinogen-PAGE-Gel in eine Plastikbox.
2. Geben Sie 100 mL Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) und 2 mL Triton X-100 in die Schachtel. Legen Sie es für 10 Minuten bei 60-70 U/min auf einen Shaker.
3. Entfernen Sie den Waschpuffer durch Pipettieren.
   HINWEIS: Wiederholen Sie den Vorgang dreimal.

5. Inkubation

1. Geben Sie 50 mL Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) in die Kunststoffbox.
2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 4 h.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Stärke der fibrinogenolytischen Aktivität angepasst werden.

6. Färben

1. Entfernen Sie den Inkubationspuffer durch Pipettieren.
2. Geben Sie 50 mL Coomassie Brillant Blue Staining Solution in die Schachtel und stellen Sie die Schachtel 30 Minuten lang bei 60-70 U/min auf einen Shaker.

7. Entfärbung

1. Entfernen Sie die Färbelösung durch Pipettieren.
2. Geben Sie 50 mL DDH₂O in die Schachtel.
3. Stellen Sie die Box 30 Minuten lang bei 60-70 U/min auf einen Shaker.
   HINWEIS: Als Entfärbungslösung wurde hier DD H₂O verwendet. Die Schüttelzeit kann je nach Stärke der fibrinogenolytischen Aktivität eingestellt werden.

Ergebnisse

Nach der Elektrophorese waren alle Banden des Markers deutlich dargestellt. Die 1x SDS-PAGE-Ladebahnen wiesen nur 10 kDa-Banden (Bromphenolblau) auf. Die sFE- und Erdnusswurmproben zeigten keine beobachtbaren Banden (Abbildung 1). Obwohl die Banden der Proben nicht sichtbar sind, deutete die Leistung des Markers und des Bromphenolblaus darauf hin, dass die Elektrophorese erfolgreich war, und die Proben wurden nach ihrem Molekulargewicht getrennt.

Obwohl das gesamte Gel durch die Färbung blau wurde, machte die Entfärbung den Bereich, in dem Fibrinogen durch Fibrinogenolytika abgebaut wurde, transparent. Im Vergleich zum Marker zeigte der sFE eine aktive fibrinogenolytische Bande nahe 25 kDa. Das Erdnusswurm-Homogenat wies 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa und eine Reihe von Banden auf, die größer als 70 kDa waren (Abbildung 2). Die Ergebnisse zeigten, dass sFE nur eine 25 kDa fibrinogenolytische Komponente enthielt, das Erdnusswurm-Homogenat jedoch sFE-Komponenten und andere fibrinogenolytische Wirkstoffe enthielt. Ergänzende Abbildung 1 ist ein Beispiel für ein Gelbild, das den Marker in tiefem Blau und die Zielproben als helle Banden zeigt.

Abbildung 1: Gel nach der Elektrophorese. M: Markierung; Bahn 1: 1x SDS-PAGE-Ladepuffer; Bahn 2: sFE; Bahn 3: 1x SDS-PAGE Ladepuffer; Spur 4: Erdnusswurm-Homogenat; Bahn 5: 1x SDS-PAGE Ladepuffer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gel nach der Entfärbung. M: Markierung; Bahn 1: 1x SDS-PAGE-Ladepuffer; Bahn 2: sFE; Bahn 3: 1x SDS-PAGE Ladepuffer; Spur 4: Erdnusswurm-Homogenat; Bahn 5: 1x SDS-PAGE Ladepuffer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Gelbild, das den Marker in tiefem Blau und die Zielproben als helle Banden zeigt. M: Markierung; Bahn 1: 1x SDS-PAGE-Ladepuffer; Bahn 2: sFE; Bahn 3: 1x SDS-PAGE Ladepuffer; Spur 4: Erdnusswurm-Homogenat; Bahn 5: 1x SDS-PAGE Ladepuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

sFE ist ein neuartiges fibrino(geno)lytisches Enzym, das von unserem Team zuvor aus Erdnusswürmern isoliert wurde 3,6,8,13. Die Identifizierungsprozesse von sFE waren jedoch zeit- und arbeitsaufwendig und umfassten den Nachweis der fibrinogenolytischen Aktivität, die Trennung der Proteinkomponenten und die Aktivitätsbestätigungsphasen. Als einfache Methode wird der Fibrinogenplatten-Assay meist in der Vorscreening-Phase eingesetzt, um die fibrinogenolytische Aktivität der Proben zu überprüfen. Die Fibrinogenplatten-Assay-Methode kann jedoch nicht unterscheiden, welche Komponente aktiv ist. Daher müssen Chromatographie und native/SDS-PAGE verwendet werden, um ihre Komponenten nach der Aktivitätsdetektion zu trennen. Dann werden die Reaktionsprodukte erneut durch die SDS-PAGE aufgelöst, um den Abbau des Substratfibrinogens zu bestätigen. In dieser Arbeit wurde das Substrat Fibrinogen zu PAGE-Gel hinzugefügt, um das Fibrinogenolytikum nachzuweisen. Nach Elektrophorese, Renaturierung, Inkubation, Färbung und Entfärbung wurden das Molekulargewicht und die fibrinogenolytische Aktivität der fibrinogenolytischen Wirkstoffe mit demselben Gel deutlich dargestellt. Mit dieser Methode konnten wir innerhalb von 6 h mehr als einen aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoff aus Erdnusswurm-Homogenat nachweisen.

Um die optimalen Ergebnisse zu erzielen, sollte der Fibrinogen-PAGE-Gelvorbereitung, der Renaturierung und der Inkubation mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Im Allgemeinen gilt: Je niedriger die Konzentration von Fibrinogen, desto farbloser ist die fibrinogenolytische Zone, die auf die fibrinogenolytische Aktivität der Mittel hinweist. Je niedriger jedoch die Konzentration von Fibrinogen ist, desto farbloser ist der Hintergrund und desto schwieriger ist es, die fibrinogenolytische Zone vom Hintergrund zu unterscheiden. Die Renaturierungszeit beeinflusst die fibrinogenolytische Aktivität der Komponenten erheblich. Wenn diese Zeit zu kurz ist, um das SDS im PAGE-Gel abzuwaschen, wird die fibrinogenolytische Aktivität der Komponenten durch remanentes SDS gehemmt. Ist die Inkubationszeit zu kurz, ist die fibrinogenolytische Reaktion nicht gründlich. Wenn die Inkubationszeit zu lang ist, wird der Marker, der zur Angabe des Molekulargewichts verwendet wird, weggespült. In dieser Studie wurden diese Bedingungen, obwohl sie optimiert wurden, so eingestellt, dass die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Erdnusswürmern getrennt und dargestellt wurden. Daher sollten personalisierte Bedingungen für diese kritischen Schritte entsprechend den spezifischen fibrinogenolytischen Wirkstoffen festgelegt werden.

Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese Fibrinogen-PAGE nur für das Screening von fibrinogenolytischen Wirkstoffen mit fibrinogenlytischer Aktivität geeignet ist, nicht jedoch für Wirkstoffe mit fibrinogen lytischer Aktivität oder Plasminogenaktivierungsaktivität. Wenn wir diese Aktivitäten abbilden wollen, kann die Methode optimiert werden, indem das Fibrinogen durch Fibrin oder Plasminogen ersetzt wird. Ein weiterer erwähnenswerter Punkt ist, dass es sich bei den in dieser Studie getesteten fibrinogenolytischen Wirkstoffen um Monomere handelte, die unter der SDS-Elektrophoresebedingung nicht betroffen waren. Handelt es sich bei den getesteten Wirkstoffen um Polymere, sollte diese Methode daher auf eine native-PAGE-Bedingung eingestellt werden, die das Molekulargewicht nicht anzeigen kann. Daher handelte es sich bei der hier vorgestellten Fibrinogen-PAGE-Methode nur um eine allgemeine Basisversion, die optimiert werden kann, um die anderen fibrinogenolytischen Wirkstoffe schnell zu screenen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1  M Tris-HCl (pH 6,8)	Solarbio	T1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamid/Bis-Acrylamid	Biosharp	BL513B
Ammoniumpersulfat	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Becherglas	PYREX	2-9425-02
Zentrifugenröhrchen (1,5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Inkubator mit konstanter Temperatur	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Färbelösung	Beyotime	P0017F
Elektronische Analysenwaage	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Pipettenspitzen zum Laden von Gelen, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenisator	AHS	ATS-1500
Oszillator mit horizontaler Rotation	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Referenz	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	Sigma	T9281
Pipettenspitze (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipettenspitze (10 & Mikro; L)	Axygene	T-10XT-C
Pipettenspitze (200 & Mikro; L)	Axygene	T-200XT-C
Pipettierer (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettierer (10 Mikro; L)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettierer (200 & Mikro; L)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipette (50 & Mikro; L)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
gekühlte Zentrifuge	cence	H1650R
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200