Die Rolle der CD4-T-Zellen bei der schubförmig-remittierenden experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Zusammenfassung

Ein experimentelles Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) an Mäusen wurde eingesetzt, um die Rolle von CD4-T-Zellen bei der Entstehung und dem Rückfall von EAE aus der Perspektive der Aktivierungsphase und der Immuneffektfunktion zu untersuchen.

Zusammenfassung

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Infiltration von Immunzellen und die Demyelinisierung des Zentralnervensystems (ZNS) gekennzeichnet ist. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als prototypisches Tiermodell für die Untersuchung von MS. In dieser Studie wollten wir die Rolle von CD4-T-Zellen bei der Initiierung und dem Rückfall von EAE untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf der Aktivierungsphase und der Immunantwort lag. Um das EAE-Mausmodell zu erstellen, wurden weibliche Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 immunisiert, das mit einem vollständigen Freund-Adjuvans (CFA) emulgiert wurde. Die klinischen Scores wurden täglich ausgewertet und zeigten, dass die Mäuse in der EAE-Gruppe ein klassisches schubförmig-remittierendes Muster aufwiesen. Die Analyse von Hämatoxylin-Eosin (H&E) und Luxol Fast Blue (LFB) zeigte eine signifikante Infiltration von Entzündungszellen im ZNS und eine Demyelinisierung bei EAE-Mäusen. In Bezug auf die Aktivierungsphase können sowohl CD4⁺CD69⁺ Effektor-T (Teff)-Zellen als auch CD4⁺CD44⁺CD62L-Effektor-Memory T (Tem)-Zellen zur Initiierung von EAE beitragen, wobei das Rezidivstadium wahrscheinlich von CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen dominiert wurde. Darüber hinaus sind in Bezug auf die Immunfunktion Helferzellen T (Th)1 hauptsächlich an der Initiierung der EAE beteiligt. Allerdings tragen sowohl Th1- als auch Th17-Zellen zum Schubstadium bei, und die immunsuppressive Funktion der regulatorischen T-Zellen (Treg) wurde während des EAE-pathologischen Prozesses gehemmt.

Einleitung

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Infiltration des Zentralnervensystems (ZNS) mit Immunzellen und Demyelinisierung gekennzeichnet ist ^1,2. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass es sich um die häufigste Behinderungskrankheit bei jungen Menschen handelt, deren Inzidenz weltweit kontinuierlich zunimmt³. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein prototypisches Tiermodell für MS, das viele Aspekte der Entzündungsphase der menschlichen MS^{simuliert 4}. Aus Sicht der Immunfunktionen werden die initialen CD4-T-Zellen, die noch nicht auf Antigene gestoßen sind, als T(Th)-0-Helferzellen bezeichnet. Diese Zellen durchlaufen Reifungs- und Aktivierungsprozesse, um verschiedene Funktionen zu erfüllen. CD4-T-Zellen können nach ihren spezifischen Funktionen in mehrere Untergruppen eingeteilt werden, zu denen Th1, Th2, regulatorisches T (Treg), follikuläres Helfer-T (Tfh), Th17-, Th9- und Th22-Zellen gehören⁵. Es ist ein allgemeiner Konsens, dass die Zellsubtypen Th1 und Th17 entscheidende Pathogenesefaktoren von EAE⁶ sind. Th1-Zellen könnten Interferon γ (IFN-γ) sezernieren, und Th17-Zellen sezernieren Interleukin (IL)-17 und andere Entzündungsfaktoren, die andere Immunzellen wie Mikrogliazellen und Astrozyten aktivieren könnten. Diese Zellen produzieren entzündliche Zytokine⁷ wie IL-18, IL-12, IL-23 und IL-1β, die die Immunantwort der Th1/Th17-Zellen weiter induzieren könnten, was zu einer fortschreitenden Demyelinisierung und axonalen Schäden führt. Aus der Perspektive der Aktivierungsphase haben CD4-T-Zellen ein vorherbestimmtes Schicksal, sich zu unterschiedlichen Zelluntergruppen und differenzierten Zuständen zu entwickeln, einschließlich naiver, Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen⁸. Die anfänglichen CD4-T-Zellen vermehren sich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Effektor-Untergruppen mit unterschiedlichen Funktionen in verschiedenen Umgebungen⁹. Die meisten Effektorzellen sind kurzlebig, wobei sich eine kleine Population von T-Zellen zu Gedächtnis-T-Zellen entwickelt, die bei der Wiederbegegnung mit denselben Antigenen schnelle Effektorfunktionen aufweisen und dem Wirt einen hochwirksamen und langfristigen Schutz bieten ^10,11.

Obwohl aktuelle Forschungsergebnisse darauf hindeuten, dass CD4-T-Zellen eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung von EAE spielen, ist noch unklar, wie verschiedene CD4-T-Zell-Untergruppen, klassifiziert nach ihrer Aktivierungsphase und Immunwirkungsfunktion, zur Initiierung und zum Rückfall von EAE beitragen. In der vorliegenden Studie etablierten wir das EAE-Modell in C57BL6/J-Mäusen durch Immunisierung des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins (MOG)35-55-Peptids und untersuchten die Initiierung und den Rückfall von EAE, wobei wir uns auf die Aktivierungsphase und die Immunfunktion von CD4-T-Zellen konzentrierten.

Protokoll

Insgesamt wurden für diese Studie 18 weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen nach dem Zufallsprinzip in eine Kontrollgruppe (n = 6) und eine EAE-Gruppe (n = 12) eingeteilt. Die Mäuse wurden vom Versuchstierzentrum der Ningxia Medical University gekauft. Die Mäuse wurden in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raum mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu frischem Wasser und Futter untergebracht. Die Ethikgenehmigung wurde vor Beginn der Studie von der Ethikkommission für Versuchstiere der Ningxia Medical University eingeholt.

1. Entwicklung einer schubförmig remittierenden EAE bei C57BL/6-Mäusen

1. Auflösung des Reagenzes
   1. 5,4 mg MOG35-55 (Materialtabelle) in 1,8 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen. Wiegen Sie 12,6 mg Mycobacterium tuberculosis H37RA (Materialtabelle) und geben Sie es in 1,8 ml vollständige Freund's Adjuvans (CFA) Lösung (Materialtabelle). Lösen Sie 360 μl Pertussis-Toxin (PTX; Tabelle der Materialien) mit einer Pipette in 7,2 ml PBS (Materialtabelle).
2. Vorbereitung der Emulsion von MOG35-55 und CFA
   1. MOG35-55-Lösung und CFA-Lösung mit zwei in Schritt 1.1 vorbereiteten 5-ml-Spritzen pipettieren und mit einem T-Ventil verbinden. 1 Stunde lang kontinuierlich auf Eis mischen, bis eine milchige Wasser-in-Öl-Emulsion entsteht.
      HINWEIS: Die Emulsion wird erfolgreich hergestellt, wenn sie auf der Wasseroberfläche schwimmt, ohne sich nach dem Tropfen ins Wasser zu dispergieren.
3. Anästhesierung von Mäusen
   1. Schrauben Sie die Füllverschlusskappe am vorderen Ende des Verdampfers des Anästhesiegeräts ab. Gießen Sie langsam 20 mL Isofluran entlang der Verschlussschraube in der Mitte und verriegeln Sie die Füllverschlusskappe. Schalten Sie den T-Ventil-Schalter, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vom Verdampfer des Anästhesiegeräts mit der Anästhesie-Induktionsbox kommuniziert wird (Materialtabelle).
   2. Schließen Sie das Netzteil der Luftpumpe an, schalten Sie den Schalter der Luftpumpe ein und drehen und stellen Sie das Luftquellenventil am vorderen Ende des Sauerstoffdurchflussmessers so ein, dass der Ausgangsgasfluss 400 ml/min beträgt. Öffnen Sie den Verdampfer, stellen Sie die Induktionskonzentration auf 3% ein und warten Sie, bis das Anästhetikum die Induktionsbox gefüllt hat.
   3. Etwa 1 Minute später legen Sie die Mäuse in die Induktionsbox, schließen Sie die Induktionsbox und warten Sie, bis sich die Mäuse im Tiefschlaf, Muskelentspannung und gleichmäßiger Atmung befinden. dann konnten die Mäuse als idealer Narkosezustand bestimmt werden (Table of Materials).
      HINWEIS: Schalten Sie den T-Ventil-Schalter, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vom Verdampfer des Anästhesiegeräts mit der Anästhesiemaske kommuniziert wird, bis die Mäuse vollständig betäubt sind.
4. Immunisierung von Mäusen
   1. Injizieren Sie subkutan 200 μl der in Schritt 1.2 hergestellten Emulsion mit einer 1-ml-Spritze mit der Nadel an vier Stellen auf dem Rücken der Maus, etwa 0,5 cm auf beiden Seiten der Wirbelsäule in der Achselhöhle und in der Leistenebene¹² bei den Mäusen der EAE-Gruppe. Verwenden Sie an jeder Stelle 50 μl Emulsion (Materialtabelle).
5. PTX-Einspritzung
   1. Nehmen Sie die Mäuse aus dem Käfig, indem Sie den Schwanz fangen und auf den Käfigdraht legen. Halten Sie den Schwanz der Maus mit dem 4. und 5. Finger fest und ziehen Sie ihn sanft nach oben, um den Trend des Körpers und der Gliedmaßen nach vorne beizubehalten. Fassen Sie den Kopf der Mäuse und erfassen Sie die Haut auf dem Rücken der Mäuse mit dem Mittel- und Ringfinger.
   2. 0 h und 48 h nach der Immunisierung in Schritt 1.4 injizieren Sie 200 μl PTX intraperitoneal in einer Position von 0,5 cm entlang beider Seiten der Mittelabdominallinie mit einer Eindringtiefe von 1-2 cm mit einer 1-ml-Spritze mit Nadel (Materialtabelle).
      HINWEIS: Vor der Injektion von PTX 48 Stunden nach der Immunisierung von MOG35-55 ist es notwendig, Mäuse mit den in Schritt 1.3 beschriebenen Verfahren zu betäuben. Die Mäuse sollten so lange betreut werden, bis sie wieder genug Bewusstsein erlangt haben, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
   3. Bei den Mäusen in der Kontrollgruppe wird die gleiche Methode mit Kochsalzlösung behandelt und der klinische Score täglich beurteilt.
      HINWEIS: Die Mäuse wurden nach folgender Skala auf Anzeichen von EAE untersucht:¹³: 0 = keine Krankheitssymptome, 1 = vollständige Lähmung des Schwanzes, 2 = partielle Lähmung/Schwäche der Hintergliedmaßen, 3 = vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen, 4 = Lähmung der vorderen und hinteren Gliedmaßen und 5 = moribunder Zustand.

2. Histologische Färbeanalyse

1. Sammlung des Gehirns
   1. Betäuben Sie die Mäuse nach Schritt 1.3. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und öffnen Sie den Brustkorb, um das Herz vollständig freizulegen. Schneiden Sie die Auricula dextra und perfundieren Sie langsam mit einer vorgekühlten Kochsalzlösung mit einer 20-ml-Spritze mit Nadel am linken Ventrikel, bis die Leber grau und weiß wird.
   2. Perfundierte langsam mit 4% Paraformaldehyd, bis sich die Schwanzspitze nach oben dreht, der Körper steif wird und die Leber zäh wird. Kopf enthaupten, Schädel aufschneiden, Gehirn mit einer Pinzette einfangen und 24 h lang in 4%iger Paraformaldehydlösung fixieren (Materialtabelle).
2. Vorbereitung von Paraffinschnitten
   1. Gradientendehydratisierung: Tauchen Sie das Hirngewebe aus Schritt 2.1 nacheinander 1 h lang in 70 % Ethanol, 1 h lang 80 % Ethanol, 1 h lang 95 % Ethanol, 1 h lang wasserfreies Ethanol, ersetzen Sie es durch frisches wasserfreies Ethanol und tauchen Sie 1 h lang weiter (Materialtabelle).
   2. Transparenz: Tauchen Sie das Hirngewebe aus Schritt 2.2.1 für 30 Minuten in Xylol, ersetzen Sie es durch frisches Xylol und tauchen Sie es weiter ein, bis das Gewebe transparent ist (Materialtabelle).
   3. Einbetten: Hirngewebe aus Schritt 2.2.2 für 1 h in Paraffin einbetten, durch frisches Paraffin ersetzen, 1 h weiter einbetten, nach dem Lösen der Form in 6 μm große Scheiben schneiden, Objektträger in heißes Wasser legen, bei 37 °C trocknen, bei Raumtemperatur lagern (Materialtabelle).
   4. Entparaffinierung: Hirngewebe aus Schritt 2.2.3 20 min in Xylol tauchen, durch frisches Xylol ersetzen, 20 min weiter eintauchen, 5 min in wasserfreies Ethanol legen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min eintauchen, 5 min 75% Ethanol für 5 min, mit Leitungswasser abspülen (Materialtabelle).
   5. Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung: Gewebe aus Schritt 2.2.4 3-5 min mit Hämatoxylinlösung färben und anschließend mit Leitungswasser abspülen. Behandeln Sie das Gewebe kurz mit einer Hämatoxylin-Differenzierungslösung und spülen Sie es gründlich mit Leitungswasser ab. Behandeln Sie das Gewebe mit Hämatoxylin, Scott Tap Bluing Solution, und spülen Sie es mit Leitungswasser ab. 5 min in 85 % Ethanol und 5 min in 95 % Ethanol eintauchen und 5 min mit Eosin-Farbstoff färben (Materialtabelle).
   6. Dehydrieren: Das Gewebe aus Schritt 2.2.5 nacheinander 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol tauchen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 Minuten weiter eintauchen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 Minuten eintauchen, 5 Minuten lang Xylol verwenden, durch frisches Xylol ersetzen, 5 Minuten eintauchen, mit neutralem Gummi versiegeln (Materialtabelle).
   7. Beobachten Sie das Hirngewebe mit einem Mikroskop und führen Sie Bildaufnahmen und -analysen durch (Materialtabelle).

3. Analyse der LFB-Färbung

1. Myelinscheidensammlung: Schneiden Sie die Wirbelsäule der Maus vom Kopfende 2 Segmente nach oben bis zum Schwanzende 2 Segmente nach unten, blasen Sie das Rückenmark bis zum Schwanzende aus und fixieren Sie das Rückenmark 24 Stunden lang in 4%iger Paraformaldehydlösung.
   HINWEIS: Die Myelinscheide wurde von denselben Mäusen in Schritt 2.1 entnommen, und die Schritte für die Herzperfusion sind die gleichen wie in 2.1.
2. Paraffinabschnitte Entparaffinisierung und Rehydratisierung: Die Objektträger aus Schritt 3.1 nacheinander für 20 min in Xylol legen, durch frisches Xylol ersetzen, 20 min weiter eintauchen, wasserfreies Ethanol 5 min, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min eintauchen, 5 min 75%iger Alkohol, mit Leitungswasser waschen.
3. Schnelle Blaufärbung: Luxol Fast Blaufärbung Lösung A in einen 60 °C Ofen geben und 30 Min. vorheizen. Legen Sie die Objektträger aus Schritt 3.2 in Lösung A und decken Sie sie 1 h lang mit einer Kunststofffolie ab, damit die Scheiben nicht austrocknen, nehmen Sie dann die Objektträger heraus und waschen Sie sie schnell mit Leitungswasser.
4. Unterscheidung des Hintergrunds: Legen Sie die Objektträger aus Schritt 3.3 für 2 s in die Luxol Fast Blue Staining Lösung B (während der Farbstoff heiß ist) und tauchen Sie sie direkt 15 s lang in die Luxol Fast Blue Staining Lösung C zur Differenzierung, waschen Sie sie mit Wasser, bis die Myelinscheide blau und der Hintergrund fast farblos ist.
5. Eosin-Gegenfärbung: Die Objektträger aus Schritt 3.4 zum Trocknen bei 65 °C in den Ofen schieben. Wenn sie fertig sind, nehmen Sie sie aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Legen Sie die Objektträger 1 Minute lang in 95%ige Ethanol- und Eosin-Gegenfärbung.
6. Dehydrierung und Versiegelung: Die Objektträger aus Schritt 3.5 nacheinander 5 min in wasserfreies Ethanol legen, durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min weiter eintauchen, wieder durch frisches wasserfreies Ethanol ersetzen, 5 min weiter eintauchen, 5 min weiter eintauchen, 5 min xylol, durch frisches Xylol ersetzen, 5 min eintauchen. Waschen und trocknen Sie die Proben und versiegeln Sie sie mit neutralem Gummi.
7. Mikroskopische Untersuchung: Sammeln und analysieren Sie Bilder mit einem aufrechten optischen Mikroskop (Table of Materials).

4. Durchflusszytometrische Analyse

1. Öffnen Sie die Bauchhöhle von Mäusen. Die Milz mit einer Pinzette herausziehen und mit einer Schere auf Eis in kleine Stücke von 1,5-2,5 cm in PBS hacken. Mahlen Sie die Milz in 10 ml RPMI-1640 mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS) mit einem 2,5-ml-Spritzenkolben und drücken Sie es durch ein 70-μm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten (Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Milz wurde von denselben Mäusen in Schritt 2.1 entnommen.
2. Die in Schritt 4.1 erhaltene Suspension wird in 15-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang mit 5 ml Lysionspuffer für rote Blutkörperchen auf Eis lysiert. Mit RPMI-1640 mit 2 % FBS waschen, 5 Minuten lang bei 350 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen mit RPMI-1640 mit 2 % FBS resuspendieren.
3. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler (Table of Materials) und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
4. Pipettieren Sie 100 μl Zellsuspension in 1,5 ml-Röhrchen und inkubieren Sie 30 Minuten lang mit 1 μl Anti-Maus-CD16/32-Antikörper¹⁴ (0,5 mg/ml), um unspezifische Färbungen zu blockieren. Mit RPMI-1640 waschen und bei 350 x g 5 min zentrifugieren, den Überstand entsorgen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl RPMI-1640 mit 2 % FBS.
5. Färben Sie mit Antikörpern, die spezifisch für CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) und CD69 (BV674) sind, für Teff-Zellen¹⁵ für 30 min, 2 μl für jeden Antikörper. Färbung mit Antikörpern, die spezifisch für CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) und CD62L (PE) für Temzellen¹⁶ für 30 min sind, 2 μl für jeden Antikörper. Mit RPMI-1640 waschen und 5 min bei 350 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen in 350 μl PBS resuspendieren. Analysieren Sie den Zellanteil mit einem Durchflusszytometer und der zugehörigen Software (Table of Materials).

5. Analyse von Zytokinen mittels zytometrischem Bead-Array

1. Verwenden Sie das zytometrische Bead-Array (Materialtabelle), um IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, Tumornekrosefaktor (TNF)-α und IFN-γ in Mäusegehirnen zu messen, Methoden wie unten beschrieben.
2. Sammeln Sie das Gehirn der Maus, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
3. Extraktion des Gesamtproteins: 50 mg Hirngewebe schneiden und wiegen (drei Gehirne in der Kontrollgruppe, EAE-Gruppe im Spitzenstadium und RR-Stadium). Legen Sie das Gehirn in 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 500 μl Lysepuffer hinzu, der PMSF, Proteasehemmer und Phosphatasehemmer enthält.
4. Das Gehirn in kleine Stücke von ca. 1 mm³ schneiden, mit Ultraschall-Homogenisator bei 400 W, 5 s EIN und 5 s AUS extrahieren; 5x wiederholen. Stellen Sie das Röhrchen 10 min lang auf Eis, zentrifugieren Sie es 5 min lang bei 12000 x g und sammeln Sie den Überstand (Materialtabelle).
5. Bereiten Sie die Th1/Th2/Th17-Zytokinstandards der Maus wie unten beschrieben vor.
   1. Öffnen Sie ein Fläschchen mit lyophilisierten Maus-Th1/Th2/Th17-Standards. Übertragen Sie die Standards in ein konisches 15-ml-Polypropylen-Röhrchen. Beschriften Sie den Röhrendeckel standardmäßig.
   2. Rekonstituieren Sie die Standards in 2,0 ml Assay-Verdünnungsmittel. Lassen Sie den rekonstituierten Standard 15 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Mischen Sie das rekonstituierte Protein vorsichtig durch Pipettieren.
   3. Beschriften Sie 12 mm x 75 mm Röhrchen und ordnen Sie sie in der folgenden Verdünnungsreihenfolge an: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 und 1:256. Pipettieren Sie 300 μl Assay-Verdünnungsmittel in jedes markierte Röhrchen.
   4. Führen Sie serielle Verdünnungen durch: Übertragen Sie 300 μl des Top-Standards in das 1:2-Verdünnungsröhrchen und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren. Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung fort, indem Sie 300 μl aus dem 1:2-Röhrchen in das 1:4-Röhrchen usw. bis zum 1:256-Röhrchen übertragen. Bereiten Sie ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen vor, das nur das Assay-Verdünnungsmittel enthält, das als 0 pg/ml-Negativkontrolle dienen soll.
      HINWEIS: Durch Pipettieren gründlich mischen. Nicht wirbeln, um zu verhindern, dass die Antikörperkopplung an den Mikrokügelchen abfällt.
   5. Um die Th1/Th2/Th17-Zytokin-Fangkügelchen der Maus zu mischen, bereiten Sie 19 Röhrchen vor, einschließlich Standards mit 3 Proben in jeder Gruppe (Kontrollgruppe, EAE-Gruppe im Spitzenstadium und RR-Stadium) für das Experiment. Die Auffangraupensuspension vor dem Mischen 5 s lang kräftig vortexen. Geben Sie 190 μl jeder Fangperle in ein einzelnes Röhrchen und beschriften Sie es als gemischte Fangperlen. Die Perlenmischung gründlich einreiben.
      HINWEIS: Die antikörperkonjugierten Kügelchen setzen sich mit der Zeit aus der Suspension ab. Es ist notwendig, das Fläschchen vor der Entnahme eines Perlsuspensionsaliquots zu wirbeln.
   6. Um den Assay durchzuführen, wirbeln Sie die Mix-Capture-Kügelchen vortexen. Geben Sie 50 μl Kügelchen in alle Analyseröhrchen. 50 μl Maus-Th1/Th2/Th17-Zytokin-Standardverdünnungen werden in die Kontrollröhrchen gegeben, wie in Tabelle 1 angegeben.
   7. Geben Sie 50 μl des Maus-Nachweisreagenzes Th1/Th2/Th17 PE in alle Analyseröhrchen. Inkubieren Sie die Analyseröhrchen 2 h lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht. Geben Sie 1 mL Waschpuffer in jedes Analyseröhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 x g . Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus jedem Analyseröhrchen.
   8. Geben Sie 300 μl Waschpuffer in jedes Analyseröhrchen, um das Bead-Pellet wieder zu resuspendieren. Analysieren Sie Th1/Th2/Th17-Zytokindaten der Maus mit der FCAP Array-Software (Table of Materials).

  

Ergebnisse

Bewertung der klinischen Ergebnisse
Wie in Abbildung 1 gezeigt, zeigten die Mäuse in der Kontrollgruppe keine klinischen Symptome. Die Mäuse in der EAE-Gruppe, die mit MOG35-55 immunisiert wurden, zeigten etwa 12 Tage nach der Immunisierung eine Schwanzlähmung. Am 16. Tag erreichten die Symptome eine vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen (definiert als Spitzenstadium, Peak). Danach ließen die Symptome allmählich nach. Die klinischen Symptome der Mäuse verschlimmerten sich etwa am 25. Tag und erreichten etwa am 30. Tag eine vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen (definiert als schubförmiges Stadium, RR). Bemerkenswert ist, dass die Symptome länger anhielten als beim vorherigen Mal, wodurch sich ein klassisches schubförmig-remittierendes Merkmal entwickelte. Die Hauptmanifestation von schubförmig-remittierenden EAE-Mäusen durchläuft während des Fortschreitens der Krankheit verschiedene Stadien des Ausbruchs, der Remission und des Rückfalls, die eine gewisse Periodizität und Fluktuation aufweisen.

Histologische Analyse
Die Mäuse der Kontrollgruppe zeigten eine intakte Struktur des Hirngewebes mit gleichmäßig verteilten und klar definierten Blutgefäßen, ohne jegliche Infiltration von Entzündungszellen. (Abbildung 2A). Im Hochstadium der Mäuse der EAE-Gruppe wurde eine signifikante Infiltration von Entzündungszellen im Gehirn beobachtet (Abbildung 2B), die manschettenartige Veränderungen um die Blutgefäße herum bildete (gekennzeichnet durch einen roten Pfeil). In ähnlicher Weise gab es bei Mäusen der EAE-Gruppe im RR-Stadium eine offensichtliche Infiltration von Entzündungszellen (Abbildung 2C), mit einer vorherrschenden Aggregation um die Blutgefäße (gekennzeichnet durch einen roten Pfeil).

Analyse von LFB-Färbungen
In der Kontrollgruppe erschien die Myelinscheide der weißen Substanz der Wirbelsäule blau, was darauf hindeutet, dass ihre Struktur intakt und dicht gepackt war (Abbildung 3A). Im Spitzenstadium der EAE-Gruppe zeigte die weiße Substanz der Wirbelsäule eine hellblaue oder weiße Farbe; die Struktur schien locker und diskontinuierlich zu sein, mit einem signifikanten Vorhandensein von vakuolären Degenerationen, die durch einen roten Pfeil angezeigt werden (Abbildung 3B). Im RR-Stadium der EAE-Modellgruppe wurde ein umfangreicher Verlust von Myelin der weißen Substanz im Rückenmark beobachtet. Die Struktur schien locker zu sein, und es konnte eine signifikante Anzahl von vakuolären Degenerationen beobachtet werden (gekennzeichnet durch rote Pfeile; Abbildung 3C).

Durchflusszytometrie-Assay
Die in Abbildung 4A,B dargestellten Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des Anteils von CD4⁺CD69⁺ Teff-Zellen in EAE-Mäusen im Spitzenstadium im Vergleich zur Kontrollgruppe (P < 0,0001). Darüber hinaus stieg der Anteil dieser Zellen auch während der RR-Phase an, obwohl der Unterschied statistisch nicht signifikant war (P > 0,05). Abbildung 4C,D zeigte einen bemerkenswerten Anstieg des Anteils von CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen in ^EAE-Mäusen sowohl im Peak- als auch im RR-Stadium im Vergleich zur Kontrollgruppe (P < 0,0001).

Zytokin gemessen mit zytometrischem Bead-Array
Die in Abbildung 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Spiegel von IL-4 (P < 0,0001), IL-6 (P < 0,001), IFN-γ (P < 0,0001) und TNF-α (P < 0,0001) in der EAE-Gruppe im Spitzenstadium signifikant erhöht waren. Während die Expression von IL-17A ebenfalls zunahm, war der Unterschied statistisch nicht signifikant (P > 0,05). Darüber hinaus zeigte der IL-2-Spiegel während des Spitzenstadiums von EAE-Mäusen keine Veränderung (P > 0,05); sie stieg jedoch während der RR-Phase signifikant an (P < 0,01). Darüber hinaus waren sowohl die TNF-α- (P < 0,001) als auch die IL-17A-Expression (P < 0,01) im RR-Stadium signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Umgekehrt war die Expression von IL-10 in der EAE-Gruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe, sowohl im Peak- als auch im RR-Stadium (P < 0,0001).

Abbildung 1: Bewertung des klinischen Scores. Der klinische Score wurde täglich ausgewertet und zeigt, dass die Mäuse eine klassische schubförmig-remittierende EAE entwickelten, die mit MOG35-55 immunisiert wurde. (A) Das Diagramm des Symptomverlaufs der EAE-Mäuse. (B) Die Bewertung von EAE-Mäusen anhand mittlerer klinischer Scores. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 6, ausgedrückt. Die Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit Post-hoc-Vergleichen analysiert, um statistisch signifikante Unterschiede zu bewerten. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Mikroskopische Karte der H&E-Färbung im Gehirn. (A) Mäusegehirn in der Kontrollgruppe. (B) EAE-Mäusegehirn im Hochstadium. Entzündungszellen wurden bei Mäusen der EAE-Gruppe im Hochstadium in das Gehirn infiltriert und um die Blutgefäße herum verteilt, um eine manschettenartige Veränderung zu bilden (roter Pfeil). (C) EAE-Mäusegehirn im RR-Stadium. Entzündungszellen in Mäusen der EAE-Gruppe des RR-Stadiums aggregiert um Blutgefäße (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Mikroskopische Karte der LFB-Färbung der Myelinscheide. (A) Myelinscheide von Mäusen in der Kontrollgruppe. (B) Die Myelinscheide der EAE-Mäuse befindet sich im Spitzenstadium. Die weiße Substanz der Wirbelsäule war hellblau oder weiß, die Struktur war locker und diskontinuierlich, und es trat eine große Anzahl von vakuolären Degenerationen auf (roter Pfeil). (C) Myelinscheide von EAE-Mäusen im RR-Stadium. Das Myelin der weißen Substanz des Rückenmarks ging weitgehend verloren, die Struktur war locker und es trat eine große Anzahl von vakuolären Degenerationen auf (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Immunisierung durch MOG35-55 induzierte die Hochregulation des Anteils von CD4-Teff- und Tem-Zellen sowohl im Peak- als auch im RR-Stadium in EAE-Mäusen. (A) Illustratives Flussdiagramm, das die Immunfärbung von CD4⁺CD69⁺ -Zellen zeigt. (B) Prozentsatz der CD4⁺CD69⁺ Teff-Zellen. (C) Illustratives Flussdiagramm, das die Immunfärbung von CD44⁺CD62L⁺ -Zellen zeigt (Gate auf CD4-T-Zellen). (D) Prozentsatz der CD44⁺CD62L⁺ Tm-Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 5, ausgedrückt. Die Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit Post-hoc-Vergleichen analysiert, um statistisch signifikante Unterschiede zu bewerten. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zytokinspiegel im Gehirn von Mäusen, analysiert mit zytometrischem Bead-Array. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, n = 3. Die Daten wurden mittels unidirektionaler ANOVA mit Post-hoc-Vergleichen analysiert, um statistisch signifikante Unterschiede zu bewerten. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Etikett für Tuben	Konzentration (pg/ml)	Zytokin-Standard-Verdünnung
1	0 (Negativkontrolle)	keine Standardverdünnung (nur Assay-Verdünnungsmittel)
2	20	1:256
3	40	1:128
4	80	1:64
5	156	1:32
6	312.6	1:16
7	625	1:8
8	1250	1:4
9	2500	1:2
10	5000	Höchster Standard

Tabelle 1: Liste der Zytokin-Standardverdünnungen zu den Kontrollröhrchen.

Diskussion

MS ist die häufigste demyelinisierende Autoimmunerkrankung des ZNS, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind¹⁷. Die EAE ist das typische Tiermodell zur Simulation der klinischen pathologischen Merkmale von MS¹⁸. Studien haben gezeigt, dass Menschen mit MS aufgrund der Degeneration von Axonen und Neuronen im ZNS kognitive Beeinträchtigungen und andere Behinderungen erleiden 19,20,21. Im Peak- und RR-Stadium des EAE-Modells zeigten die Mäuse Lähmungen in ihren Schwänzen und Hintergliedmaßen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Entzündungszellen in das ZNS infiltrieren, was zu einem unterschiedlich starken Verlust der Myelinscheide führt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das EAE-Modell in diesem Experiment erfolgreich etabliert wurde.

Der Emulgierprozess von MOG35-55 und CFA muss auf Eis durchgeführt werden, um die Degradation von MOG35-55 durch Wärmeentwicklung während des Homogenisierungsprozesses zu verhindern. PTX wird intraperitoneal verabreicht, um die Gefäßpermeabilität zu erhöhen, so dass T-Zellen die Blut-Hirn-Schranke leicht überwinden und die Myelinscheide erreichen können, die die Neuronen umgibt²². Besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich, dass es in Fällen, in denen Mäuse gelähmt werden und es nicht ertragen können, selbst zu fressen oder zu trinken, wichtig ist, Futter- und Wasserschalen in ihrem Käfig bereitzustellen oder sie manuell zu füttern, um übermäßigen Durst und Hunger zu vermeiden.

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde der Anteil von CD4⁺CD69⁺ Teff-Zellen und CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen analysiert. Der Anteil von CD4⁺CD69⁺ Teff-Zellen in der Milz von EAE-Mäusen war im Peakstadium bemerkenswert hochreguliert. Darüber hinaus war sie höher als die der Kontrollgruppe im Schubstadium, obwohl dieser Unterschied keine statistische Signifikanz erreichte. Auf der anderen Seite war der Anteil an CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen in den ^EAE-Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe sowohl im Peak- als auch im RR-Stadium signifikant höher. Dies deutet darauf hin, dass die Initiierung von EAE sowohl CD4⁺CD69⁺ Teff als auch CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen im Peakstadium betreffen könnte, während das RR-Stadium möglicherweise hauptsächlich von CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem-Zellen dominiert wird. CD69 ist das früheste Membranoberflächenmolekül, das während der Lymphozytenaktivierung exprimiert wird. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Modulation der Adhäsion und Migration von T-Zellen und hilft so Immunzellen bei der Identifizierung und Lokalisierung von Infektions- oder Entzündungsherden im Körper²³. Ruhende T-Zellen exprimieren kein CD69, können aber, wenn sie durch Anti-CD3/TCR-Aktivatoren stimuliert und aktiviert werden, induktiv exprimiert werden²⁴. Nach dem Effektorstadium durchläuft ein erheblicher Teil der T-Zellen eine Apoptose, da sie nicht mehr in der Lage sind, sich weiter zu differenzieren. Diese Verringerung der Anzahl wird hauptsächlich durch das Fehlen von überlebensfördernden Zytokinen, einschließlich IL-2, verursacht, die während der Antigenstimulation produziert werden. Darüber hinaus trägt die Herunterregulierung der Rezeptoren für diese Zytokine weiter zu diesem Phänomen der klonalen Kontraktion bei²⁵. Darüber hinaus führt die Beseitigung des Infektionserregers durch eine adaptive Immunantwort zu einer klonalen Kontraktion der T-Zellen, so dass letztlich weniger langlebige Gedächtniszellen übrig bleiben, um im Falle einer erneuten Infektion mit dem Erreger eine Immunantwort auf den Wirt zu erbringen²⁶. In der vorliegenden Studie war der Anteil der CD4⁺CD69⁺ T-Zellen im Hochstadium bemerkenswert erhöht, während er im RR-Stadium abnahm, was darauf hindeutet, dass CD4-Teff-Zellen nicht in der Lage sind, für einen längeren Zeitraum zu überleben und schließlich Apoptose zu durchlaufen, nur ein kleiner Teil der antigenspezifischen T-Zellen entwickelt sich zu langlebigen Gedächtnis-T-Zellen. Temzellen haben eine geringe Expression von CD62L. Sie sind jedoch in der Lage, einige Chemokinrezeptoren und Adhäsionsmoleküle zu exprimieren, die ihre Wanderung in entzündetes Gewebe erleichtern. Nach der Reaktivierung des Antigens ist die Proliferationsrate relativ langsam, aber Zytokine werden schnell freigesetzt, um die Effektorfunktion zu initiieren²⁷. In der vorliegenden Studie lösten sich die Antigene in Mäusen aus der Emulsion und griffen das Immunsystem wieder an, Tem-Zellen können reaktiviert werden und eine große Anzahl von Zytokinen, wie IL-6 und IFN-γ, freisetzen, was bei EAE-Mäusen zum Rückfall führen kann.

Die primären proinflammatorischen CD4-T-Zellpopulationen, die mit Autoimmunerkrankungen (einschließlich MS) assoziiert sind, sind Th1-Zellen, die IL-2-, IL-6-, IFN-γ-, TNF-α- und Th17-Zellen sezernieren, die IL-17 sezernieren. Es wurde gezeigt, dass Th1-Zell-assoziiertes IFN-γ eine direkte nachteilige Wirkung auf die Oligodendrozyten haben kann, was zu einer Schädigung der ZNS-Neuronen des Patienten führen^{kann 28}. Th17-Zellen spielen auch eine wichtige Rolle bei mehreren Autoimmunerkrankungen, einschließlich MS. Die Forschung hat erhöhte Spiegel von Th17-Zellen und IL-17-mRNA in Hirnläsionen von MS-Patienten im Vergleich zu Personen ohne die Krankheit beobachtet²⁹. Treg-Zellen, die durch die Produktion von IL-10 und TGF-β³⁰ gekennzeichnet sind, haben eine immunsuppressive Wirkung und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Toleranz des Immunsystems gegenüber Eigenkomponenten, wodurch der Körper in die Lage versetzt wird, die Immunhomöostase aufrechtzuerhalten. Hier beobachteten wir eine signifikante Hochregulation der IL-4-, IL-6-, IFN-γ- und TNF-α-Expression in der EAE-Gruppe im Peak-Stadium. Zusätzlich war auch die Expression von IL-17A erhöht, obwohl es keine Signifikanz gab. Im Gegensatz dazu waren die Expressionsniveaus von TNF-α und IL-17A im RR-Stadium im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher. Dies deutet darauf hin, dass das Peak-Stadium von EAE hauptsächlich von Th1-Zellen und nicht von Th17-Zellen angetrieben wird, während das RR-Stadium von EAE sowohl von den Th1- als auch von den Th17-Zellen initiiert wurde. Es ist erwähnenswert, dass die Expression von IL-10 in der EAE-Gruppe sowohl in der Peak- als auch in der RR-Phase deutlich niedriger war als in der Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass die immunsuppressive Funktion der Treg-Zellen während der pathologischen Prozession von EAE behindert wurde.

Zusammenfassend deuten unsere Studien auf die erfolgreiche Etablierung eines schubförmig-remittierenden EAE-Modells von Mäusen durch Immunisierung mit MOG35-55-Peptid hin. Aus der Perspektive der aktiven Phase wurde das Peakstadium von EAE wahrscheinlich durch CD4⁺CD69⁺ Teff und CD4⁺CD44⁺CD62L^{- Tem-Zellen} initiiert, während das Rezidivstadium des EAE RR-Stadiums hauptsächlich von CD4⁺CD44⁺CD62L^- Tem-Zellen dominiert werden könnte. Aus Sicht der Immuneffektfunktion wurde das Spitzenstadium der EAE hauptsächlich nicht von Th17-Zellen, sondern von Th1-Zellen initiiert. Das RR-Stadium der EAE wurde jedoch durch Th1- und Th17-Zellen initiiert. Die immunsuppressive Funktion der Treg-Zellen wurde während des EAE-pathologischen Prozesses gehemmt. Nichtsdestotrotz müssen die molekularen Mechanismen, die der Aktivierung von Th1/Th17-Zellen und der Unterdrückung von Treg-Zellen zugrunde liegen, weiter untersucht werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verdampfer für Anästhesiemaschinen	Norvap	20-17368
Isofluran	Sigma-Aldrich (Shanghai) Handel Co.Ltd.
70 μ m Zellensieb	XIYAN Co., Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 Anti-Maus CD45 Antikörper	Biolegend	103128
APC Anti-Maus CD4 Antikörper	Biolegend	100616
Automatischer Zellzähler	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Maus Th1/Th2/Th17 CBA Kit	BD Biosciences	560485
Biotin Anti-Maus CD16/32 Antikörper	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 Anti-Maus CD69 Antikörper	Biolegend	104532
BV786 Ratte Anti-Maus CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Säule Gewebe & Zellprotein-Extraktionskit	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Vervollständigen Sie Freund's Adjuvans	Sigma-Aldrich (Shanghai) Handels Co.Ltd.
Dörrgerät	DIAPATH	Donatello
Sterilisierte Einwegspritze (1 mL)	Yikang Group	210820
Sterilisierte Einwegspritze (2,5 mL)	Yikang Group	210820
Sterilisierte Einwegspritze (5 mL)	Yikang Group	210820
Färbemaschine	DIAPATH	Giotto
Einbettungsmaschine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Ethanol	SCRC	100092683
Fötales Rinderserum	Procell Life Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.	FSP500
FITC Hamster Anti-Maus CD3e (145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Durchflusszytometer	Becton, Dickinson and Company	FACSCelesta
Durchflusszytometer	Becton, Dickinson and Company	Accuri C6
Flow Jo Software	BD Biosciences	10.8.1
Gefrorene Plattform	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
Objektträger	Servicebio	G6004
HE Farbstofflösungsset	Servicebio	G1003
Hämatoxylin-Eosin-Lösung	Servicebio	G1002
Kühlzentrifuge mit hoher Geschwindigkeit	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Bildgebungssystem	Nikon	NIKON DS-U3
Luxol Fast Blue Färbeset	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Neutralgummi	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Ofen	Labotery	GFL-230
Pathologie-Schneidemaschine	Leica	RM2016
Pertussis Toxin aus Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Servicebio	G4202
Pipette 0,5-10 μ L	DLAB Scientific	7010101004
Pipette 100-1000 μ L	DLAB Scientific	7010101014
Pipette 20-200 μ L	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science& Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.
T-Stück Ventil	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Gewebespreizer	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P Aufrechtes
optisches Mikroskop	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xylol	SCRC	10023418