Methodenartikel

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

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DOI:

10.3791/66579

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6. September 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Nanoscale Biophysics and Biochemistry, The Rockefeller University, 2Tri-Institutional PhD Program in Chemical Biology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

Zusammenfassung

Nukleosomen stellen die primäre Einheit des eukaryotischen Chromatins dar und standen im Mittelpunkt zahlreicher informativer Einzelmoleküluntersuchungen hinsichtlich ihrer biophysikalischen Eigenschaften und Wechselwirkungen mit Chromatin-bindenden Proteinen. Die Rekonstitution von Nukleosomen auf DNA für diese Studien beinhaltet in der Regel ein Salzdialyseverfahren, das eine genaue Kontrolle über die Platzierung und Anzahl der Nukleosomen ermöglicht, die entlang eines DNA-Haltegurts gebildet werden. Dieses Protokoll ist jedoch zeitaufwändig und erfordert eine beträchtliche Menge an DNA und Histon-Oktameren als Eingaben. Um eine alternative Strategie anbieten zu können, wird eine in situ Nukleosomen-Rekonstitutionsmethode für die Einzelmolekül-Kraft- und Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, die das Histon-Chaperon Nap1 verwendet. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, Nukleosomen auf jeder DNA-Vorlage zu assemblieren, ohne dass starke Nukleosomenpositionierungssequenzen erforderlich sind, die Nukleosomendichte bei Bedarf anzupassen und weniger Reagenzien zu verwenden. Die In-situ-Nukleosomenbildung erfolgt innerhalb von Sekunden, was einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und einen bequemen Übergang zu Einzelmolekülmessungen ermöglicht. Beispiele für zwei nachgeschaltete Assays zur Untersuchung der Nukleosomenmechanik und zur Visualisierung des Verhaltens einzelner Proteine auf dem Chromatin werden weiter beschrieben.

Einleitung

Die primäre Verpackungseinheit des eukaryotischen Chromatins ist das Nukleosom, in dem ~147 Basenpaare (bps) der DNA um ein Oktamer aus Kernhistonenproteinen 1,2 gewickelt sind. Neben der Genomverpackung dient die Nukleosomenarchitektur als eine weitere reichhaltige Schicht biophysikalischer Regulation, die von Chromatin-bindenden Proteinen genutzt werden kann, wenn sie ihre verschiedenen Funktionen erfüllen 3,4. Der experimentelle Zugang und die Messung der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen war eine technische Herausforderung, da diese Einheiten auf winzigen Skalen (z. B. Nanometerlängen, Piconewtonkräfte) arbeiten und ihre Sondierung daher eine ausreichende Empfindlichkeit und Präzision erfordert, um die Funktion sinnvoll zu informieren. Darüber hinaus binden sich Chromatin-bindende Proteine oft vorübergehend an ihre Substrate, und den meisten Ensemble-Ansätzen fehlt eine angemessene zeitliche Auflösung, um die Kinetik dieser Wechselwirkungen zu informieren5. Glücklicherweise hat das Aufkommen von Einzelmolekültechniken es ermöglicht, einzelne Proteine und ihre Wechselwirkungen in Echtzeit zu visualisieren und zu manipulieren, wodurch mechanistische Informationen über diese molekularen Ereignisse auf der Nanoskala enthülltwerden 6. Insbesondere die Einzelmolekül-Korrelative Kraft- und Fluoreszenzmikroskopie (smCFFM) nutzt sowohl hochauflösende Fluoreszenzdetektions- als auch Kraftmanipulationswerkzeuge, um gleichzeitig die Mechanik, Zusammensetzung und Koordination von Chromatin- und Chromatin-Protein-Komplexen aufzuklären 7,8.

Bei der smCFFM, bei der speziell eine "optische Pinzette" als Kraftmanipulationsmethode verwendet wird, wird ein eng fokussierter Laser verwendet, um ein dielektrisches Objekt, typischerweise eine mikrometergroße Kunststoffperle, in drei Dimensionen einzufangen9. Ein Biopolymer, wie z. B. ein Stück DNA, kann an die Kugel konjugiert werden (z. B. über Streptavidin-Biotin, Digoxigenin-Anti-Digoxigenin-Antikörperbindung), und der Benutzer kann sowohl eine kalibrierte Kraft aufbringen als auch die von dem System10 erzeugte Kraft/Verschiebung messen. Das zusätzliche Fluoreszenzmodul ermöglicht die gleichzeitige mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung, um die Zusammensetzung und das Verhalten von Proteinen zu verfolgen.

Die gängige Methode zur Rekonstitution von Nukleosomen-Templates für smCFFM beinhaltet die Assemblierung von Nukleosomen auf benutzerdefinierten DNA-Templates durch Salzdialyse 11,12,13. Bei diesem Verfahren werden gereinigte Histon-Oktamere mit DNA-Templates in einem Puffer mit hohem Salzgehalt (~1 M Natriumchlorid) inkubiert, und während das Salz langsam wegdialysiert wird, lagern sich Nukleosomen spontan auf der DNA in einer sequenzabhängigen Positionsweise an14,15 an. Daher ist es üblich, dass starke Nukleosomenpositionierungssequenzen (z. B. Widom 60116, X. laevis 5S rDNA17) in die DNA-Templates eingebaut werden, um benutzerdefinierte Nukleosomenarrays zu generieren. Obwohl diese gut etablierte Methode eine präzise Kontrolle über die Platzierung und Anzahl der Nukleosomen in der DNA bietet, hat sie mehrere Nachteile: (1) Der Einbau von DNA-Sequenzen mit starker Nukleosomenpositionierung kann künstlich stabile Nukleosomen erzeugen, die die Aktivität von Chromatin-bindenden Proteinen beeinflussen, (2) der Prozess der Salzdialyse zur Nukleosomenbildung erfordert große Mengen an DNA und Oktamern, und (3) das Verfahren erfordert einen bis mehrere Tage Arbeit sowie einen erheblichen Aufwand, um das korrekte DNA-zu-Oktamer-Verhältnis für eine optimale Nukleosomenarray-Dichte zu titrieren.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine alternative Methode zur Bildung von Nukleosomen entlang der DNA in situ in einem Einzelmolekül-Korrelationskraft- und Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des rekombinanten Histon-Chaperons Nap1, das dem physiologischen Weg der Nukleosomenbildung in vivo ähnelt 18,19,20,21,22. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, Nukleosomen auf unspezifischen DNA-Sequenzen zu assemblieren, die Nukleosomendichte einfach einzustellen und deutlich weniger Reagenzien zu verbrauchen – und das alles innerhalb von Minuten. Darüber hinaus ermöglicht die Bildung von nukleosomalen DNA-Fesseln in situ einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und den Komfort der integrierten Einzelmolekül-Visualisierung und -Manipulation. Wenn also eine einheitliche und spezifische Nukleosomenpositionierung nicht erforderlich ist, bietet dieses Protokoll eine nützliche Option für die Untersuchung der Nukleosomenmechanik oder des Proteinverhaltens auf Chromatin, für die wir auch Beispielassays beschreiben.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von biotinylierter DNA

  1. Bereiten Sie eine 120-μl-Volumenreaktion vor, die 20 μg λ-DNA, 33 μM Biotin-dCTP, 33 μM Biotin-dUTP, 33 μM Biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 Einheiten Klenow-Enzym und 1x NEB-Puffer 2 enthält.
    HINWEIS: Dieses Verfahren verwendet speziell lineare doppelsträngige (ds) methylierungsfreie Bakteriophagen λ genomische DNA (48.502 bps), die einen 12-Nukleotid (nt) 5' einzelsträngigen (ss) DNA-Überhang23 enthält. Das Protokoll kann jedoch so angepasst werden, dass es eine beliebige Länge oder Sequenz linearer dsDNA verwendet, vorausgesetzt, dass es mindestens mehrere nts von ss 5'-Überhängen enthält, wobei die Länge und nt-Sequenz die Anzahl der biotinylierten nts vorgibt, die an jedem Ende für das stromabwärts liegende Tethering zwischen optischen Fallen installiert sind. Zusätzlich kann die Reaktion verkleinert werden. So können beispielsweise 5 μg DNA in einer 30 μL Volumenreaktion verwendet werden. Darüber hinaus sind die auf diese Weise erzeugten DNA-Substrate nicht torsionsgebunden. Für Protokolle zur Erstellung torsionsbeschränkter DNA verweisen wir auf die zuvor veröffentlichten Berichte24,25.
  2. Inkubieren Sie die Reaktion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. 10 mM EDTA zugeben und 20 min bei 75 °C inkubieren.
  4. Führen Sie eine Ethanolfällung durch, um das biotinylierte DNA-Produkt zu erhalten.
    1. Fügen Sie 0,1x Volumen 3 M Natriumacetat und 3x Volumen eiskaltes 100% Ethanol hinzu. Bei -20 °C mindestens 1 h bis über Nacht aufbewahren. Zentrifugieren bei 13.500 x g für 30 min bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 1 ml 75%iges Ethanol hinzu. Zentrifugieren Sie bei 13.500 x g für 1 min bei 4 °C.
    3. Wiederholen Sie die Schritte zur Entfernung des Überstands, zur Zugabe von Ethanol und zur Zentrifugation.
    4. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand und lassen Sie das Pellet 10 Minuten an der Luft trocknen. Das Pellet wird in 100-200 μl TE-Puffer oder ddH2O aufgelöst (kann bei 37 °C inkubiert werden, um das Auflösen zu erleichtern). Messen Sie die Konzentration mit einem Nanodrop-Spektralphotometer.

2. Vorbereitung der Kanäle in einer Durchflusszelle

HINWEIS: Dieses Verfahren basiert auf einem kommerziell erhältlichen Mikrofluidik-Chip (siehe Materialtabelle), kann aber an jedes smCFFM-Gerät mit einer Mehrkanal-Durchflusszelle angepasst werden.

  1. Passivieren Sie die Kanäle (Kap.) 4 und 5 (oder alle Kap. , die Proteine enthalten) (siehe Schema der Kanäle in Abbildung 1A). Geben Sie 500 μl 0,1 % BSA in jeden Kanal und fließen Sie 8 Minuten lang mit 0,8 bar (~0,45 μl/s für Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,010 Zoll).
  2. Geben Sie 500 μl 0,05 % Pluronic-F127 in jeden Kanal und fließen Sie 8 Minuten lang mit 0,8 bar. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Spritzen mit 1x PBS aus. Geben Sie 2 mL 1x PBS in jeden Kanal und fließen Sie 27 Minuten lang mit 0,8 bar.
  3. Ziehen Sie die Stammlösung aus Streptavidin-beschichteten Kügelchen vor (bei diesem Verfahren werden Kügelchen mit einer Größe von 3,13 μm verwendet) und fügen Sie 2,15 μl der Bead-Lösung zu 1 mL 1x PBS hinzu. Zu L. 1 hinzufügen.
    HINWEIS: Die Größe und Konzentration der mit Streptavidin beschichteten Kügelchen kann je nach Benutzerwunsch angepasst werden.
  4. Fügen Sie 30-80 ng biotinylierte λ-DNA zu 1 ml 1x PBS hinzu. Zu Kap. 2 hinzufügen.
    HINWEIS: Die Konzentration der biotinylierten DNA kann nach den Wünschen des Benutzers angepasst werden. Größere DNA-Mengen erhöhen die Häufigkeit der Bildung von DNA-Fesseln, erhöhen aber auch die Häufigkeit der gleichzeitigen Bindung mehrerer DNA-Moleküle, was das Experiment erschweren kann.

3. Nap1-vermittelte in situ Nukleosomenbildung

  1. Fügen Sie 500 μl proteinfreien Bildpuffer zu Kap. 3 hinzu.
    HINWEIS: Die Pufferzusammensetzung in Kapitel 3 ist flexibel und sollte sowohl für die Nukleosomen als auch für das/die spezifische(n) Protein(e) von Interesse geeignet sein. Optional können Anwender Sauerstoff-Scavenging-Systeme hinzufügen, um die Photobleiche von Fluorophoren und/oder Konkurrenz-DNA zu reduzieren, um Histon-Oktamere zu entfernen, die nicht richtig in Nukleosomen verpackt sind.
  2. 2 nM S. cerevisiae Nap1 und 2-5 nM LD655-markiertes H4-Histon-Oktamer (HO) werden zu 500 μl 1x HR-Puffer18 hinzugefügt. Zu Kap. 4 hinzufügen.
    HINWEIS: Histon-Oktamere und Nap1 können kommerziell erworben oder im eigenen Haus hergestellt werden (siehe Materialtabelle). Die Anzahl der Nukleosomen, die entlang jeder angebundenen DNA gebildet werden sollen, hängt von der Oktamerkonzentration sowie der in diesem Kanal verbrachten Zeit ab. Die vom Benutzer gewünschte und ungefähre Nukleosomendichte entlang jedes DNA-Moleküls kann durch Anpassen eines oder beider dieser Parameter moduliert werden. Darüber hinaus kann der Benutzer wählen, Histon-Oktamere mit seinem bevorzugten Fluorophor zu markieren.
  3. Optional: Geben Sie das Chromatin-bindende Protein oder ein anderes Protein von Interesse zu Kap. 5 in einem geeigneten Puffer.
  4. Fließen Sie alle Kanäle mit 1,0 bar (~0,55 μL/s im aktuellen Versuchsaufbau) für 30 s, um die Kanäle der Durchflusszelle mit Proben zu spülen.
  5. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 bar ein (~0,16 μL/s im aktuellen Versuchsaufbau). Bewegen Sie die optischen Fallen (OTs) auf Kanal 1 und fangen Sie ein geeignetes Paar Streptavidin-beschichteter Kügelchen.
  6. Bewegen Sie die OTs auf Kanal 3, führen Sie eine Kraftkalibrierung für das Perlenpaar durch, schalten Sie den roten konfokalen Laser (oder eine andere Laserlinie Ihrer Wahl) ein und kalibrieren Sie den Bildgebungsbereich.
  7. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 bar ein und verschieben Sie OTs auf Kanal 2. Fangen Sie biotinylierte DNA.
  8. Verschieben Sie die OTs nach Kanal 3 und stoppen Sie den Fluss. Vergrößern Sie den Abstand zwischen den OTs, um die DNA zu dehnen, und überwachen Sie die zugehörige Kraft-Entfernungs-Kurve (FD), um das Vorhandensein eines einzigen DNA-Tethers (im Gegensatz zu mehreren Tethers) zu bestätigen. Die Kurve sollte dem wurmartigen Kettenmodell für dsDNA bei der gegebenen Konturlänge26 folgen.
  9. Passen Sie den Abstand zwischen den OTs so an, dass die DNA-Spannung etwa 1 pN anzeigt.
    HINWEIS: Die Spannung von 1 pN ist niedrig genug, damit die Nukleosomen von DNA27 umhüllt bleiben können, aber hoch genug, um das gesamte DNA-Molekül innerhalb der Zeilenabtastachse zu platzieren.
  10. Schalten Sie die Zeilenabtastung ein, um mit eingeschaltetem roten Laser einen Kymographen zu erfassen.
    HINWEIS: Kymographen oder 2D-Scans von angebundener DNA können je nach Benutzerwunsch erhalten werden.
  11. Bewegen Sie die OTs bei ausgeschaltetem Durchfluss nach Kanal 4 . Mit Hilfe von Nap1 werden HOs auf DNA geladen und in Echtzeit zu Nukleosomen umwickelt. Die Nukleosomenbeladung wird als fluoreszierende Trajektorien visualisiert, die auf der DNA in Kymographen erscheinen. Gleichzeitig kann die Nukleosomenbildung auf der DNA durch die Krafterhöhung überwacht werden, da mehr HOs geladen werden, wenn die Positionen der OTs konstant gehalten werden.
    HINWEIS: Der Fluoreszenzanregungslaser kann während der Schritte zur Nukleosomenbildung ausgeschaltet werden, um ein Photobleichen von Fluorophoren zu vermeiden. Zusätzlich könnte eine unspezifische Bindung von Histon-Oktameren an DNA, bei der die Oktamere nicht in Nukleosomen eingewickelt sind, unter Verwendung dieses Protokolls auftreten. Diese Bindungsereignisse erzeugen keinen "Riss", wenn die DNA gedehnt wird, wie im Protokoll zum Auspacken von Nukleosomen (Schritt 4) unten beschrieben, und können manchmal durch einen sanften Pufferfluss abgewaschen werden, insbesondere wenn der Puffer freie Konkurrenz-DNA enthält.
  12. Wenn die ungefähr gewünschte Anzahl von Nukleosomen gebildet ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von Daten.

4. Auspacken von Nukleosomen

  1. Führen Sie Schritt 2 und Schritt 3 aus.
  2. Nachdem Sie ein DNA-Tether mit Nukleosomen gebildet haben, verschieben Sie die OTs nach Kap. 3.
  3. Bereiten Sie sich auf Experimente zum Auspacken von Nukleosomen vor, indem Sie den Abstand zwischen den OPs verringern, bis die Kraft ungefähr Null ist. Null die Kraft.
  4. Beginnen Sie, den OT 1 mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,1 μm/s vom OT 2 weg zu bewegen. Auf einem Kymographen bewegt sich die Perle in OT 1 visuell weiter von der Perle in OT 2 entfernt. Auf der FD-Kurve steigt die Kraft mit zunehmender Entfernung. Wenn sich die Nukleosomen aufwickeln, treten "Risse" oder Übergänge in der Kraft (~8-37 pN) auf, die das Auflösen der inneren Umhüllung der einzelnen Nukleosomen 27,28,29 bedeuten.
    HINWEIS: Die Kraft, mit der das Abwickeln erfolgt, hängt von der Zuggeschwindigkeit ab, die für Nichtgleichgewichtsprozesse erwartet wird. Manchmal wickeln sich mehrere Nukleosomen gleichzeitig ab, was zu einer größeren Abstandsänderung des Übergangs auf der FD-Kurve führt. Darüber hinaus ist die Entwirrung der äußeren Hülle des Nukleosoms in dieser experimentellen Umgebung nicht ohne weiteres sichtbar (siehe Abschnitt Diskussion).

5. Visualisierung der Proteinbindung an Chromatin

  1. Führen Sie Schritt 2 und Schritt 3 aus.
  2. Fügen Sie 10 nM Cy3-markiertes Linker-Histon H1.4 zu 500 μl Bildpuffer in Kap. 5 hinzu.
    HINWEIS: Jedes Protein, das von Interesse ist, kann in einer Konzentration Ihrer Wahl zu Kanal 5 hinzugefügt werden (typischerweise unter 100 nM für die Einzelmolekül-Visualisierung).
  3. Nachdem Sie einen DNA-Tether gebildet haben, der Nukleosomen enthält, schalten Sie zusätzlich zum roten Laser den grünen Laser ein und bewegen Sie die OTs auf Kanal 5 , um die Bindung von H1 an das Chromatin in Echtzeit abzubilden.
  4. Sammeln Sie weiterhin Kymographen oder Scans, bis ausreichende Statistiken vorliegen (mindestens ~10-20 Kymographen, abhängig von der Häufigkeit der Ereignisse und der experimentellen Schwierigkeit).

Ergebnisse

Unter Verwendung des in Schritt 3 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 1A) wurde die Nukleosomenbildung entlang des DNA-Tethers als das Auftreten von rot fluoreszierenden Herden auf einem 2D-Scan (Abbildung 1B, links) oder die Trajektorien im Zeitverlauf auf einem Kymographen (Abbildung 1B, rechts) visualisiert. Richtig verpackte Nukleosomen ergaben Fluoreszenztrajektorien, die über die Zeit innerhalb der Beugungsgrenze der konfokalen Detektion (~300 nm) stationär waren. Bemerkenswert ist, dass mehrere Nukleosomen, die nahe beieinander unter der Beugungsgrenze gebildet werden, nicht räumlich aufgelöst werden können und als hellere Herde oder Trajektorien erscheinen. Nichtsdestotrotz wurden die Photobleichschritte einzelner nukleosomaler Trajektorien analysiert und zeigten häufig 1-stufige (Abbildung 1C) oder 2-stufige (Abbildung 1D) Photobleichereignisse, was darauf hindeutet, dass die Herde angesichts der etwa 70%igen Markierungsrate des H4-Proteins in dieser Probe hauptsächlich Mononukleosomen enthielten. Darüber hinaus wurde basierend auf der durchschnittlichen Photonenzahl für ein einzelnes LD655-Fluorophor in dieser experimentellen Bedingung die Anzahl der markierten H4-Kopien in jeder Nukleosomentrajektorie geschätzt und zeigte, dass die Nukleosomenloci überwiegend (>75%) 1 oder 2 markierte H2A-Kopien enthielten (Abbildung 1E), was wiederum mit der Vorstellung übereinstimmt, dass sie hauptsächlich als räumlich getrennte Mononukleosomen geladen wurden. Die anderen helleren Herde enthielten mehr als 3 Kopien von markiertem H4, was wahrscheinlich mehrere Nukleosomen innerhalb der Beugungsgrenze darstellt.

Die Nukleosomenbildung wurde auch durch eine Erhöhung der Spannung entlang des Tethers überwacht, wenn die Positionen der OTs konstant blieben, da mehr DNA um Histon-Oktamere gewickelt wurde (Abbildung 1B, unten). In Abwesenheit von Nap1 können Histon-Oktamere immer noch DNA binden, bleiben aber größtenteils unverpackt, da die damit verbundene Spannung beim Halten der OT-Positionen konstant blieb (Abbildung 1F). Es ist möglich, dass eine unspezifische Bindung von Histon-Oktameren an die DNA auch in Gegenwart von Nap1 auftritt. In einem anderen Experiment wurde das gleiche Protokoll zur Bildung von Nukleosomen durchgeführt, die Cy3-markiertes H2A enthielten, das ähnliche Ergebnisse lieferte wie die mit LD655-markiertem H4 (Abbildung 1G), was auf die Assemblierung von intakten Oktameren zu Nukleosomen hinweist.

Unter Verwendung des in Schritt 4 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 2A) wurde das Auspacken von Nukleosomen im Laufe der Zeit auf einem Kymographen visualisiert, wenn der Tether-Abstand zunahm (Abbildung 2B). Es wurde bereits berichtet, dass Histon-Oktamere nach dem Auspacken oft an die DNA gebunden bleiben30,31, und daher bleiben fluoreszierende Trajektorien oft auch bei hohen Spannungen bestehen. Das Auspacken der Nukleosomen wurde auch auf der zugehörigen FD-Kurve überwacht (Abbildung 2C). Zu den quantifizierbaren Merkmalen der FD-Kurve gehören die Kraft, bei der sich Nukleosomen abwickeln (siehe "Übergang F" in Abbildung 2C) sowie die Länge der DNA, die aus dem Histon-Oktamer freigesetzt wurde (siehe "ΔL" in Abbildung 2C-Einschub), die in Vielfachen von ~24 nm vorliegt, was mit einer unabhängigen Enthüllung der inneren Windungen der DNA einzelner Nukleosomenübereinstimmt 27, 30. Urheberrecht Diese Parameter können verwendet werden, um die Anzahl der Nukleosomen zu schätzen, die an jedem Tether gebildet werden, oder für zusätzliche nachgelagerte Analysen der Nukleosomenmechanik. Daher wurde die Anzahl der Innenwindungsbrüche, die aus mechanischen Zugexperimenten gewonnen wurden, mit der geschätzten Anzahl markierter H4-Kopien an jeder Nukleosomenbahn auf der Grundlage der Monomerintensität verglichen, was zeigte, dass die Zahlen weitgehend konsistent sind (Beispiele in den Abbildungen 2D-G). Es wurde jedoch festgestellt, dass sie aufgrund der ~70%igen markierten Effizienz des H4-Proteins in der Probe und der verbleibenden Nap1-unabhängigen Histonbindung an die DNA, wie in Abbildung 1F gezeigt, nicht perfekt übereinstimmen. Schließlich führt das Dehnen von Nap1-gebundenen nackten DNA-Fesseln (ohne Histone) erwartungsgemäß nicht zu kraftinduzierten Übergängen (Abbildung 2H), was darauf hindeutet, dass Nap1 allein die DNA nicht signifikant verzerrt.

Unter Verwendung des in Schritt 5 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 3A) wurde die Bindung des Linker-Histons H1 an das Chromatin als das Auftreten von grün fluoreszierenden Herden entlang des Chromatin-Tethers sichtbar gemacht (Abbildung 3B). Bemerkenswert ist, dass H1-gebundene Nukleosomen zweifarbige Trajektorien erzeugten (siehe weiße Pfeile in Abbildung 3B), die im Laufe der Zeit stationär erschienen. Darüber hinaus wurde eine Diffusion von H1-Trajektorien über nukleosomenfreie DNA-Regionen beobachtet (siehe grüne Sterne in Abbildung 3B).

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Abbildung 1: Nap1-vermittelte in situ Nukleosomenbildung. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der im Nap1-vermittelten in situ Nukleosomenbildungsprotokoll beschrieben ist (Schritt 3). Ein Paar Kügelchen wurde in Kapitel 1 optisch gefangen, und ein einzelnes λ-DNA-Molekül wurde durch die Biotin-Streptavidin-Bindung in Kapitel 2 zwischen den Kügelchen angebunden. Der Tether wurde dann in Kanal 4 verschoben, der LD655-markierte Histon-Oktamere (rot) und Nap1 für die Echtzeitbildung von Nukleosomen in der DNA enthält. (B) Repräsentativer 2D-Scan (links) und Kymograph (rechts) eines LD655-H4-markierten Nukleosomen-haltigen DNA-Bindeglieds. Der zugehörige Kraftmesswert (unten) zeigt einen sofortigen Kraftanstieg, wenn das Leine auf Kanal 4 bewegt wird, wenn die OT-Positionen konstant gehalten werden, was auf eine Nukleosomenumhüllung hinweist. Hellere Trajektorien bedeuten mehrere benachbarte Nukleosomen, die sich innerhalb der Beugungsgrenze von ~300 nm befinden. (C) Beispiel-Kymograph, der ein 1-stufiges Photobleichereignis (weißer Pfeil) eines Nukleosoms zeigt, das LD655-H4 enthält. (D) Beispiel-Kymograph, der ein 2-stufiges Photobleichereignis (weiße Pfeile) eines Nukleosoms zeigt, das LD655-H4 enthält. (E) Relative Häufigkeit der Anzahl von LD655-markiertem H4 pro Trajektorie, geschätzt aus ihrer Fluoreszenzintensität. (F) Repräsentativer Kymograph eines mit Histon-Oktameren gebundenen Seils in Abwesenheit von Nap1. Der zugehörige Kraftmesswert (unten) bleibt unverändert, auch wenn Histon-Oktamere an die DNA binden. (G) Repräsentativer Kymograph eines Cy3-H2A-markierten Nukleosomen-haltigen DNA-Bindeglieds. Der zugehörige Kraftmesswert (unten) zeigt einen sofortigen Kraftanstieg, wenn der Tether zu Kanal 4 (mit Oktameren und Nap1) bewegt wird, da Nukleosomen gebildet werden, wenn die OT-Positionen konstant gehalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Nukleosomen-Unwrapping-Assay. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der im Unwrapping-Nukleosomen-Protokoll (Schritt 4) beschrieben ist. Der DNA-Tether, der die Nukleosomen enthält, wurde in Kanal 3 mit einem proteinfreien Bildpuffer verschoben, wo der Abstand zwischen den Kügelchen vergrößert und die Nukleosomen ausgewickelt wurden. (B) Repräsentativer Kymograph eines nukleosomenhaltigen DNA-Seils, das durch allmähliche Erhöhung des Abstands zwischen den Kügelchen zu hohen Kräften gezogen wird. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität in Richtung der unteren Perle war wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die DNA leicht aus dem Zeilenfokus kippte. (C) Die zugehörige FD-Kurve, die kraftinduzierte Übergänge der inneren Windungsenthüllung zwischen 8 und 37 pN zeigt. Der Einschub zeigt eine Zoom-Ansicht eines Beispielübergangs, für den die entpackte Distanz (ΔL = ~24 nm für die innere Drehung der DNA einzelner Nukleosomen) und die Übergangskraft (Transition F) aufgezeichnet und weiter analysiert werden können. Für diese Leine wurden 26 Nukleosomen ausgewickelt und die Leine riss bei ~65 pN, wie durch die weiße gestrichelte Linie im Kymographen gekennzeichnet. (D,E) Beispiel für ein LD655-H4-Nukleosomen-haltiges Seil, das zu hohen Kräften gezogen wird, wobei die Anzahl von H4 pro Trajektorie über die Fluoreszenzintensität geschätzt wird (im Kymographen angezeigt, D) und die Anzahl der umhüllten Nukleosomen über die Größe der kraftinduzierten Abstandsänderung geschätzt wird (angezeigt in der zugehörigen Kraft-Weg-Kurve, E). (F,G) Ein weiteres Beispiel wie in (D,E). (H) DNA-Fesseln (n = 5), die nach der Inkubation in einem Kanal, der nur Nap1 enthält, mit hohen Kräften gezogen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Visualisierung der Protein-Chromatin-Interaktion. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, der im Protokoll zur Visualisierung der Proteinbindung an das Chromatin (Schritt 5) beschrieben ist. Der DNA-Tether, der die Nukleosomen enthält, wurde nach Ch. 5 verschoben, der 10 nM Cy3-markiertes Linker-Histon H1 (grün) enthält. (B) Repräsentativer zweifarbiger Kymograph der Bindung von H1 an einen Nukleosomen-haltigen DNA-Gurt. H1-Nukleosomen-Kolokalisationsereignisse sind mit weißen Pfeilen gekennzeichnet. Die ungebundene Nukleosomenbahn ist mit dem magentafarbenen Pfeil gekennzeichnet. H1-Moleküle, die auf nackter DNA diffundieren, sind mit grünen Sternen gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das beschriebene Protokoll bietet mehrere Vorteile für die Nukleosomenrekonstitution, einschließlich der Minimierung von Reagenzien und Zeit sowie der Ermöglichung der Chaperon-abhängigen Nukleosomenbildung entlang jeder (potenziell nativen) DNA-Sequenz. Darüber hinaus ermöglicht die In-situ-Methode einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und einen bequemen Übergang in Einzelmolekül-Assays der Nukleosomenmechanik und der Protein-Chromatin-Interaktion. Auf der anderen Seite gehört zu den Einschränkungen dieses Ansatzes die Unfähigkeit, die Nukleosomenpositionierung entlang der DNA zu steuern (selbst bei Einbeziehung starker Nukleosomenpositionierungssequenzen) und die Anzahl der pro DNA-Band gebildeten Nukleosomen genau zu kontrollieren (obwohl dies empirisch durch Standardisierung des experimentellen Arbeitsablaufs abgestimmt werden kann). In der Tat handeln diejenigen, die sich für diese Methode entscheiden, mit einer präzisen Kontrolle der Positionierung und Dichte der Nukleosomen, um den Arbeitsablauf zu vereinfachen und einen geringen Reagenzienbedarf zu erzielen, dessen Wahl von jedem spezifischen Experiment abhängt. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die äußere Drehung der DNA im aktuellen Protokoll aufgrund der langen Länge des Tethers (~48,5 kbps) und der Pufferbedingungen32 nicht aufgelöst ist. Um Informationen über die äußere Drehung der DNA sowie das Stapeln zwischen den Nukleosomen zu erhalten, kann der Benutzer wählen, die DNA-Länge zu verkürzen und eine höhere Dichte von Nukleosomen auf die DNA zu laden und/oder die Salzdialysemethode zu verwenden, um Nukleosomen auf stark positionierten Sequenzen zu platzieren, die durch regelmäßige Linkerlängen getrennt sind. Schließlich ist es wahrscheinlich, dass es zu einer unspezifischen Bindung von Histon-Oktameren an die DNA kommt; Daher ist es wichtig, bei der Interpretation der Ergebnisse sowohl Fluoreszenz- als auch Kraftsignale zu berücksichtigen.

Ein kritischer Aspekt des aktuellen Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass der Benutzer eine hohe Fluoreszenzmarkierungsrate für Histon-Oktamere erreicht hat (falls eine Visualisierung erforderlich ist), damit die meisten, wenn nicht sogar alle Nukleosomen visuell nachgewiesen werden können. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Bestätigung, dass der Benutzer einen geeigneten Puffer für den Bildgebungskanal ausgewählt hat, der mit Nukleosomen und anderen Proteinen von Interesse kompatibel ist. Benutzerspezifische Modifikationen des Protokolls können die Konjugation von Fluorophoren mit einem anderen Histon umfassen (siehe Berichte33,34 für Beispiele, bei denen diese Methode zur Bildung von Nukleosomen mit markiertem H3 oder H2B verwendet wird), die Auswahl eines alternativen Fluorophors, die Einbeziehung von DNA-Fesseln unterschiedlicher Sequenzen und Längen, das Hinzufügen eines Sauerstofffängersystems zur Verlängerung der Lebensdauer von Fluorophoren, die Wahl einer anderen Bead-Größe, und unter Verwendung eines alternativen DNA-Bead-Konjugationssystems (z. B. Digoxigenin-Anti-Digoxigenin-Antikörper-Kopplung).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene Methode smCFFM einen bequemen und vielseitigen Ansatz zur Erzeugung von Nukleosomen-haltigen Tethern bietet, die leicht zur Untersuchung einer Vielzahl von chromatinfokussierten Fragestellungen in der Biologie eingesetzt werden können. Zu den anwendbaren Forschungsbereichen gehören die Chromatinmechanik, wie sie durch Histonvarianten und posttranslationale Modifikationen reguliert wird, die biophysikalische Bindung und Kinetik von Chromatin-bindenden Proteinen sowie nukleosomengerichtete Assemblierungsprozesse höherer Ordnung wie die biomolekulare Kondensation 35,36,37,38.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

G. N. L. C. bedankt sich für die Unterstützung durch das National Institute of Mental Health der National Institutes of Health (NIH) unter der Fördernummer F31MH132306. S. L. wird unterstützt von der Robertson Foundation, der International Rett Syndrome Foundation und dem NIH (Preisnummer R01GM149862).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x HR PufferN/AN/A30 mM  tris  Acetat pH 7,5, 20 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumchlorid, 0,1 mg/mL BSA 
1x PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)N/AN/A137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 10 mM Natriumphosphat zweibasisch, 1,8 mM Kaliumphophat monobasisch 
Essigsäure, EissäureMillipore SigmaAX0074-6Zur Herstellung von Trisacetat
verwenden Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Rinderserum AlbuminMillipore SigmaA9418-50GAuflösen in H2O und laufen durch 0,22 μm Filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimid funktionalisiert Cy3 Fluorophor
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Tischzentrifuge mit kühlendem
Ethylalkohol, PureMillipore Sigma459844
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Millipore SigmaE9884Lösen in H2O bis 0,5 M
Humanes Histon-Oktamer (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARekombinante Histonproteine und Proteine mit Markierungsmutationen wurden wie zuvor beschrieben im eigenen Haus gereinigt (siehe Ref. 33, 34, 35, 36). Kurz gesagt, rekombinante Histone wurden in BL21 (De3) pLySS-Zellen (Promega) exprimiert. Die Einschlusskörper wurden nach der Beschallung isoliert und die Histone unter denaturierenden Bedingungen extrahiert. Histone wurden in Puffer A dialysiert (7 M Harnstoff, 10 mM Trishydrochlorid pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA und 5 mM 2-Mercaptoethanol) und die Lösung wurde in eine Schwerkraftsäule gegeben, die mit Q Sepharose Fast Flow (Cytiva) beladen war. Der Durchfluss wurde dann in eine mit SP Sepharose Fast Flow (Cytiva) beladene Schwerkraftsäule gegeben, und die Histone wurden durch Zugabe von Puffer A, der mit 600 mM Natriumchlorid ergänzt wurde, aus der Säule eluiert. Histone, die Markierungsmutationen beherbergen (H4, L50C; H2A, K119C) wurden gereinigt und dann über Maleimid-funktionalisierte Farbstoffe (Cytiva, Lumidyne) unter Verwendung eines molaren Verhältnisses von 20:1 an das gewünschte Fluorophor konjugiert (siehe Ref. 33, 34). Histon-Oktamere wurden zusammengesetzt, indem ein gleiches molares Verhältnis jedes Wildtyp- oder Fluorophor-markierten Histons unter denaturierenden Bedingungen hinzugefügt wurde, in einen Puffer mit hohem Salzgehalt dialysiert wurde, der 2 M Natriumchlorid enthielt, und dann durch Größenausschlusschromatographie gereinigt wurden, wie zuvor beschrieben (siehe Ref. 36, 37). Alternativ können einzelne Histonproteine und fertige Histon-Oktamere kommerziell erworben werden (z.B. Epicypher). 
BildpufferN/AN/A20 mM Trishydrochlorid pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid
Klenow-Fragment (3' bis 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (Mutter-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Methylierungsfrei λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimid-funktionalisiertes LD655 Fluorophor
Linker Histon H1.4 (A4C)N/AN/AAufgereinigtes rekombinantes Protein aus eigener Herstellung (siehe Ref. 38)
LUMICKS C-TrapDymo LUMICKSN/ADual-Trap-Konfiguration; Standardmaterialien für das Instrument vom Hersteller zur Verfügung gestellt
Magnesiumacetat-LösungMillipore Sigma63052-100MLZur Herstellung von HR-Puffer
verwenden NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIm Lieferumfang enthalten Klenow Fragment Kit
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GIn H2O auflösen und durch 0,22 μm Filter laufen
KaliumchloridMillipore SigmaP3911Zur Herstellung von PBS und HR-Puffer
verwenden Kaliumphosphat monobasischMillipore SigmaP0662Zur Herstellung von PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 wurde wie zuvor beschrieben hausintern gereinigt (siehe Ref. 33, 34). Alternativ kann Nap1 im Handel erworben werden (z. B. Active Motif).
NatriumacetatMillipore Sigma241245Lösen in H2O bis 3 M
NatriumchloridMilliporeSigma S9888Zur Herstellung von PBS und Bildpuffer verwenden
Natriumphosphat zweibasischMillipore SigmaS9763Zur Herstellung von PBS
verwenden SPHERO Biotin beschichtete Partikel (3,0-3,4 & Mikro; m)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerFisher ScientificND2000NanoDrop Spektralphotometer
Tris BaseFisher ScientificBP152-500In H2O auflösen und auf den entsprechenden pH-Wert einstellen; zur Herstellung von Bildpuffer und Trisacetat verwenden

Referenzen

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