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Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

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DOI:

10.3791/66580

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24. Mai 2024

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.

Zusammenfassung

Die adaptive Immunantwort beruht auf der Fähigkeit einer T-Zelle, als Reaktion auf Krankheitserreger und Fremdkörper durch Blut, Lymphe und Gewebe zu wandern. Die T-Zell-Migration ist ein komplexer Prozess, der die Koordination vieler Signaleingänge aus der Umwelt und lokalen Immunzellen erfordert, einschließlich Chemokinen, Chemokinrezeptoren und Adhäsionsmolekülen. Darüber hinaus wird die Motilität von T-Zellen durch dynamische Umgebungsreize beeinflusst, die den Aktivierungszustand, die Transkriptionslandschaft, die Expression von Adhäsionsmolekülen und vieles mehr verändern können. In vivo macht es die Komplexität dieser scheinbar miteinander verflochtenen Faktoren schwierig, einzelne Signale zu unterscheiden, die zur T-Zell-Migration beitragen. Dieses Protokoll bietet eine Reihe von Methoden, von der T-Zellisolierung bis hin zur computergestützten Analyse, um die T-Zellmigration in Echtzeit unter hochspezifischen Umweltbedingungen zu bewerten. Diese Bedingungen können dazu beitragen, Mechanismen aufzuklären, die die Migration regulieren, unser Verständnis der T-Zell-Kinetik zu verbessern und starke mechanistische Beweise zu liefern, die durch Tierversuche nur schwer zu erlangen sind. Ein tieferes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen, die sich auf die Zellmigration auswirken, ist wichtig, um verbesserte Therapeutika zu entwickeln.

Einleitung

T-Zellen sind die Haupteffektoren der adaptiven, antigenspezifischen Immunantwort. Auf Populationsebene sind T-Zellen heterogen und bestehen aus zellulären Untergruppen mit unterschiedlichen spezialisierten Funktionen. Wichtig ist, dass CD8+ T-Zellen die wichtigsten zytolytischen Effektoren des Immunsystems sind, die infizierte oder dysfunktionale Zellen direkt eliminieren1.

Reife CD8+ T-Zellen befinden sich im Gewebe und zirkulieren auf der Suche nach Antigenen durch Blut und Lymphgefäße. Während der Infektion werden T-Zellen mit Antigenen im Blut oder Gewebe präsentiert und fließen schnell in die Milz oder den nächstgelegenen drainierenden Lymphknoten ab, um eine produktive Immunantwort zu starten. In beiden Fällen werden T-Zellen aktiviert, durchlaufen eine klonale Expansion und verlassen das Lymphsystem, um ins Blut zu gelangen, falls dies nicht bereits der Fall ist. Während dieses Prozesses bewirkt die intrazelluläre Signalübertragung die Herunterregulierung der lymphatischen Homing-Rezeptoren und die Hochregulierung zahlreicher Integrin- und Chemokinrezeptoren, die für die gewebespezifische Migration unerlässlich sind2. Letztendlich wird die gerichtete Migration von T-Zellen zu den Infektionsherden durch konvergierende Umweltsignale angetrieben, zu denen auch Integrin- und Chemokin-Signale gehören.

Chemokine können grob in zwei Hauptklassen eingeteilt werden: (1) homöostatische Signale, die für die Differenzierung, das Überleben und die Basalfunktion essentiell sind, und (2) Entzündungssignale wie CXCL9, CXCL10 und CCL3, die für die Chemotaxis benötigt werden. Im Allgemeinen erzeugen Chemokine einen Signalgradienten, der die gerichtete Migration, die sogenannte Chemotaxis, antreibt und zusätzlich die Integrin-Expression1 aktiviert. Die Chemotaxis ist fein reguliert und hochempfindlich, wobei T-Zellen in der Lage sind, auf winzige Änderungen des Gradienten zu reagieren, die sie in eine bestimmte Richtung oder einen bestimmten Ort führen können.

Zusätzlich zu diesen T-Zell-bezogenen Faktoren wird die Migration auch von der Zusammensetzung und Dichte der extrazellulären Matrix (EZM) beeinflusst. Die EZM besteht aus einem dichten Netzwerk von Proteinen, darunter Kollagen und Proteoglykane, die das Gerüst für adhäsive Integrinrezeptoren auf T-Zellen bilden. Integrine sind eine vielfältige Familie von Transmembranproteinen, jedes mit hochspezialisierten Bindungsdomänen und nachgeschalteten Signaleffekten. Die dynamische Expression von Integrinrezeptoren auf der Oberfläche einer T-Zelle ermöglicht eine schnelle Anpassung an ihre sich verändernde Umgebung3. Wichtig ist, dass Integrine die EZM und intrazelluläre Zytoskelett-Aktinnetzwerke verbinden, die zusammenarbeiten, um die für die T-Zellbewegung erforderliche Antriebskraft zu erzeugen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Migrationsmuster je nach Phänotyp der Immunzellen oder Umweltsignalen variieren. Diese komplexen biologischen Prozesse werden durch die Expression von Zytokinen, Chemokinen und Integrinen auf der Oberfläche der T-Zelle, den umgebenden Zellen und dem lokalen, infizierten Gewebe streng reguliert. In vivo können diese Migrationsmechanismen komplex sein und sich aus mehreren additiven Signalen ergeben4. Aufgrund dieser Komplexität kann es unmöglich sein, einen kausalen Zusammenhang zwischen scheinbar ineinandergreifenden Variablen herzustellen. Um dies zu überwinden, gibt es mehrere In-vitro-Ansätze , um spezifische Aspekte der T-Zell-Migration zu untersuchen, wie z. B. die Reaktion auf spezifische Chemokinsignale und die Interaktion zwischen T-Zell-Integrinen und EZM-bindenden Proteinen. Dieses Protokoll befasst sich mit Methoden zur Isolierung und Aktivierung von murinen CD8+ T-Zellen mit In-vitro-Migrationsassays im zweidimensionalen Raum und computergestützten Analysewerkzeugen zur Analyse der spezifischen T-Zellmigration. Diese Verfahren sind für den Benutzer vorteilhaft, da sie keine ausgeklügelten Materialien oder Vorrichtungen erfordern, wie bei einigen anderen Zellmigrationsassays, die in der Literatur beschrieben sind. Die mit diesen Methoden erzeugten Zellmigrationsdaten können auf vereinfachte Weise Hinweise auf Immunantworten liefern, die eine weitere, fundierte Untersuchung in vivo ermöglichen.

Protokoll

Die Tierprotokolle wurden vom University Committee on Animal Resources an der University of Rochester genehmigt. Die Mäuse in dieser Studie wurden im pathogenfreien Raum der Tiereinrichtung der University of Rochester gehalten. Für die vorliegende Studie wurden männliche/weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen (15-30 g) verwendet. Die Isolierung des Gewebes von Mäusen kann auf einem Labortisch mit Handschuhen zum Bedecken der Hände und einer Gesichtsmaske zum Bedecken von Nase und Mund oder in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Alle Zellkultur- und Plattenvorbereitungen müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. CD8+ T-Zellreinigung und -aktivierung

  1. Vorbereitung der Materialien
    1. Für die negative Selektion von CD8+ T-Zellen: Bereiten Sie ein negatives Selektionsmedium aus dem Überstand der Hybridom-Zelllinien GK1.5 und M5/114 Antikörper her, die Anti-CD4 bzw. Anti-MHCII produzieren. Mischen Sie den Überstand im Verhältnis 1:1, filtrieren Sie ihn und lagern Sie ihn bei 4 °C für die zukünftige Verwendung (>0,5 μg jedes Antikörpers/eine Million Zellen insgesamt). Alternativ sind kommerzielle CD8+ T-Zell-Isolationskits erhältlich.
    2. Zur Aktivierung von T-Zellen: 500 μl CD3 (10 μg/ml) und CD28 (16 μg/ml) Antikörper in 1x DPBS (ohne Calcium und Magnesium) in eine mit Nicht-Gewebekultur (TC) behandelte 24-Well-Platte geben und über Nacht bei 4 °C lagern, um die Plattenbindung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Antikörper und Proteine beschichten nicht TC-behandelte Kulturplatten/-schalen besser als normale TC-behandelte, daher werden nicht TC-behandelte Kulturplatten für die T-Zell-Generierung verwendet.
  2. Bereiten Sie eine 10-cm-Kulturschale (oder ein gleichwertiges Gefäß) vor, indem Sie ein 70-μm-Zellsieb in die Schale geben und 2 mL R9-Medium in den Filter abgeben (R9-Medium: RPMI 1640x, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, 20 mM HEPES-Puffer, 1 % MEM-nicht-essentielle Aminosäuren, 50 μM β-Mercaptoethanol).
  3. Erhalten Sie eine Maus mit entsprechendem genetischen Hintergrund, Geschlecht, Alter und Gewicht, wie durch das Versuchsdesign bestimmt.
  4. Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 , gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation oder geeigneten Euthanasiestrategien, wie sie in den örtlichen Tierpflege- und -verwendungsprotokollen definiert und von der Einrichtung genehmigt sind.
  5. Bringen Sie die Maus in Rückenlage, strecken Sie alle vier Gliedmaßen senkrecht zum Körper und befestigen Sie die Fußpolster mit Maus-Dissektions-T-Stiften oder Ähnlichem an einem Sezierbrett. Machen Sie mit einer chirurgischen Präparierschere der Maus einen oberflächlichen, zentralen Schnitt durch die Hautschicht am ventralen Unterbauch und schneiden Sie gerade bis zum Kinn (~8 cm). Trennen Sie die Haut von der Bauchfellschleimhaut, um die Lymphknoten freizulegen. Dehnen Sie die Haut senkrecht vom Rumpf weg und stecken Sie sie fest5.
    1. Schneiden Sie die zervikalen, axialen, brachialen und leistenförmigen Lymphknoten vorsichtig bilateral mit einer stumpfen Pinzette (oder dem bevorzugten Typ aus einem chirurgischen Präparierset für die Maus) heraus. In das in Schritt 1.2 vorbereitete Zellsieb umfüllen.
    2. Öffnen Sie das Bauchfell und entfernen Sie die Milz. In das in Schritt 1.2 vorbereitete Zellsieb umfüllen.
    3. Entsorgen Sie den Mauskadaver in dem entsprechenden Behälter für biologische Gefahren.
  6. Bereiten Sie eine einzellige Suspension des sekundären lymphatischen Gewebes durch mechanischen Aufschluss über dem 70 μm Zellsieb mit 2 mL R9-Medium aus Schritt 1.2 vor, indem Sie das Gewebeaufschlusswerkzeug wiederholt um eine halbe Umdrehung im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn drehen.
    HINWEIS: Das Kolbenende einer Luer-Lock-Spritze, entweder 3 mL oder 10 mL, eignet sich gut, um das Gewebe zu zerkleinern und zu homogenisieren. Alternative Materialien können nach Ermessen des Benutzers verwendet werden.
  7. Waschen Sie die Zellen, das Spritzenende, das Sieb und die Kulturschale mit 7 ml Medium und stellen Sie sicher, dass das Sieb aufrecht bleibt, um die Übertragung größerer Gewebestücke oder zellulärer Aggregate, die möglicherweise vorhanden sein könnten, in die Einzelzellsuspension zu verhindern.
  8. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
  9. Die Zellen bei 270 x g bei Raumtemperatur (20 °C) 5 min pelletieren und den Überstand dekantieren.
  10. Fügen Sie 1 Minute lang 500 μl Lysierungspuffer hinzu, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Mit 9,5 mL R9 Medium verdünnen und bei 270 x g (20 °C) 5 min schleudern. Dekantieren Sie den Überstand.
  11. Das Pellet wird in 10 ml des zuvor vorbereiteten negativen Selektionsmediums, das Anti-MHCII und Anti-CD4 enthält, resuspendiert (Schritt 1.1.1). Bei Raumtemperatur (20 °C) 30 min schaukeln.
  12. Die Zellen bei 270 x g 5 min pelletieren und den Überstand dekantieren. 3x mit 10 mL R9 Medium waschen.
  13. Waschen Sie gleichzeitig in einem konischen 15-ml-Röhrchen 200 μl Anti-Ratten-IgG-Kügelchen für Schafe in 7 mL Medium. Setzen Sie die Tube auf einen Magneten, entfernen Sie das Medium und wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 7 mL R9 Medium.
  14. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 270 x g (20 °C) pelletiert, der Überstand dekantiert und das Pellet dann in 7 mL Bead-Suspension aus Schritt 1.13 resuspendiert. Bei Raumtemperatur (20 °C) 45 min schaukeln.
  15. Anreicherung von CD8+ T-Zellen durch Depletion magnetischer Beads. Legen Sie das konische Röhrchen 3 Minuten lang direkt auf den Magneten ohne Deckel, um Antikörper-/Kügelchen-gebundene Zellen zu entfernen. CD8+ -Zellen sollten erhalten bleiben. Während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, entnehmen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Pipette oder einem gleichwertigen Gerät und geben Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen. Bei 270 x g (20 °C) 5 min zentrifugieren und 3x bei mittlerer Hitze waschen.
  16. Waschen Sie die vorbeschichtete Aktivierungsplatte (Schritt 1.1.2) zweimal mit 1x DPBS, ohne direkt auf die Unterseite der Platte zu pipettieren.
  17. Optional: Führen Sie eine Trennung von lebenden/toten Lymphozyten durch, um abgestorbene Zellen zu entfernen.
    1. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Geben Sie vorsichtig 2 ml Lymphozytentrennmedium auf den Boden der Zellsuspension. Zentrifugieren bei 900 x g für 10 min (bei Raumtemperatur) bei geringer Beschleunigung und Verzögerung.
      HINWEIS: Lebende Zellen trennen sich an der Grenzfläche von Medium und Trennmedium (mittlere weiße Schicht). Abgestorbene Zellen pelletieren am Boden des Röhrchens und können am Ende entsorgt werden.
    2. Die mittlere Schicht mit lebenden Lymphozyten in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 270 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand.
  18. Resuspendieren Sie das Pellet in 12 mL Medium mit 10 U/mL rekombinantem Maus-IL-2. 1 ml pro Vertiefung in eine nicht TC-behandelte 24-Well-Platte einfüllen und über Nacht auf 37 °C erhitzen.

2. Anheben der aktivierten CD8+ T-Zellen

  1. Visualisieren Sie Zellen mit einem Standard-Tischlichtmikroskop mit dem 4x- oder 10x-Objektiv.
    HINWEIS: Aktivierte T-Zellen erscheinen im Vergleich zu inaktivierten T-Zellen größer und rund oder länglich und sollten im gesamten Well dichte Zellcluster aufweisen.
  2. Um die aktivierten Zellen anzuheben, brechen Sie die Zellen mit einer 1-ml-Pipette auf und achten Sie darauf, dass sie an den Rändern der Platte gut vermischt sind. Übertragen Sie die Zellen in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Aktivierte Zellen sind klebriger und erfordern ein kräftigeres Pipettieren.
  3. Waschen Sie die Vertiefungen mit 1 ml R9-Medium, um alle verbleibenden Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf noch einmal. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 270 x g (20 °C) für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
  4. Führen Sie eine Trennung von lebenden/toten Lymphozyten durch, um abgestorbene Zellen zu entfernen, wie in den Schritten 1.17-1.18.
  5. Pflegen Sie die T-Zellen durch Entnahme lebender/toter Zellen alle 3-4 Tage in R9-Medium mit IL-2 in einer 6-Well-Platte ohne TC.
    HINWEIS: T-Zellen vermehren sich während der frühen Aktivierung besser in Vertiefungen mit kleinen Abmessungen, möglicherweise aufgrund von T-Zell-T-Zell-Kontakten oder von T-Zellen abgeleiteten löslichen Faktoren, die ihre Aktivierung unterstützen. Eine schnelle T-Zell-Proliferation führt dazu, dass das Kulturmedium innerhalb von 24-48 Stunden nach der Kultur gelb wird. Heben Sie zu diesem Zeitpunkt die Zellen an und überführen Sie sie in eine größere Vertiefung (unbeschichtete, nicht TC 6-Well-Platte) mit ausreichend frischem Kulturmedium, um die Zellen zu füttern (typischerweise 5 ml pro Vertiefung). Ersetzen Sie erschöpftes Medium durch frisches, wenn dies durch eine Farbänderung des gelben Mediums angezeigt wird, oder alle 3-4 Tage.

3. Zubereitung der Glasschale

  1. Bereiten Sie die Migrationskammern oder -platten der Glaszellen vor, indem Sie über Nacht bei 4 °C mit 300 μl/cm 2 Protein A (0,1 mg/ml) beschichten, zweimal mit 1x DPBS waschen, indem Sie auf die Schale geben und dekantieren, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.
  2. Beschichten Sie die Migrationskammer oder -platte mit 300 μl/cm 2 rekombinanten Maus-ICAM-1- oder VCAM-1-Fc-Chimären (0,1-2,75 mg/ml) zusammen mit einem rekombinanten Maus-Chemokin (0,1-10 μg/ml) für 2-3 h bei Raumtemperatur. Andere Integrin-Liganden wie Fibronektin, Maus-Kollagen IV und Maus-E-Cadherin werden so gerendert, dass sie die Kammer bei 2,5-10 μg/ml über Nacht bei 4 °C direkt beschichten.
    1. Spülen Sie die Kammern zweimal mit 1x DPBS, indem Sie auf die Schale geben und unmittelbar danach dekantieren, bevor Sie Zellen hinzufügen.
      HINWEIS: T-Zellen können in unterschiedlichen Konzentrationen von Integrin-Liganden und Chemokinen je nach Status der Aktivierung, Differenzierung, Sensibilisierung und des Primings unterschiedlich migrieren. Es wird dringend empfohlen, die Zellmigration in mehreren verschiedenen Konzentrationen zu untersuchen.
  3. Plattieren Sie die adhärenten Zellen 24 Stunden vor Beginn der Bildgebung auf glasbeschichteten Platten, wenn T-Zellen mit anderen Zellen, wie z. B. Krebszellen, kokultiviert werden, um die T-Zell-Abtötung von Krebszellen in Echtzeit zu messen.

4. Vorbereitung der Zellen

  1. Optional: T-Zellen und adhärente Zellen mit einem Zelltracker-Farbstoff nach Wahl bei 1 μg/mL pro 1 x 107 Zellen in 1x DPBS für 15 min bei 37 °C oder nach Herstellerprotokoll färben.
  2. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem gleichwertigen Messgerät.
  3. Platte: 1 x 105 CD8+ T-Zellen (oder gewünschte Menge) in Leibovitz' L-15-Medium, ergänzt mit 1-5 g/L Glukose in einer 37 °C Kammer.
    HINWEIS: L-15-Medium ist für die Verwendung ohne CO 2-Natriumbicarbonat-System formuliert. Es wird mit freien basischen Aminosäuren, Phosphatpuffern und Galaktose gepuffert, um den pH-Wert aufrechtzuerhalten.
  4. Optional: Führen Sie eine Integrin-Blockierung durch.
    1. T-Zellen mit einem blockierenden Antikörper gegen ein Integrin (1-10 μg/ml, Anti-Maus-CD11a (M17/4), Anti-Maus-CD18 (M18/2), Anti-Maus-VLA-4 (9C10) für 10 min vorinkubieren und in Gegenwart desselben Antikörpers kriechen lassen.

5. Zeitraffer-Mikroskopie

  1. Führen Sie eine Videomikroskopie durch.
  2. Bei T-Zellen können Sie alle 10-60 s Hellfeld- und Fluoreszenzbilder für 10-60 Minuten oder die gewünschten Aufnahmeeinstellungen aufnehmen.
    HINWEIS: Die T-Zell-Migration ist temperaturempfindlich, und die optimale Temperatur für die T-Zell-Migration der Maus beträgt 37 °C. Das Temperiersystem, das in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus einem geschlossenen und isolierten Mikroskopdeck mit angeschlossenem Heizsystem. Die Bildgebungskammer befindet sich auf dem Bildgebungsdeck. Der Umfang dieser Kammer besteht aus einem mit destilliertem Wasser gefüllten Brunnen, der eine gleichmäßige Hitze und Luftfeuchtigkeit während der Bildgebung ermöglicht. Die Mikrovertiefung befindet sich in der Mitte der Bildgebungskammer.

6. Softwaregestützte Analyse der T-Zell-Migration

  1. Verwenden Sie die Volocity-Software, um die T-Zell-Migration zu bewerten.
    1. Öffnen Sie Volocity und erstellen Sie eine neue Bildsequenz.
    2. Wählen Sie alle Zeitraffer-Videomikroskopiefilme aus und verschieben Sie sie in den blauen Bereich in Volocity.
    3. Passen Sie Helligkeit und Kontrast mit dem Kontrastverbesserungswerkzeug an die gewünschten Einstellungen des Forschers an.
    4. Überprüfen Sie die Bildgrößen: 0,325 μm für 20x, 0,65 μm für 10x.
    5. Reihenfolge: Setzen Sie Zeitpunkte (z. B. 81 Bilder, wenn alle 15 s für 20 Minuten ein Bild aufgenommen wird, 4 pro Minute).
    6. Deaktivieren Sie alle Zeitpunkte auf der Registerkarte "Messung".
    7. Suchen Sie Objekte mit der Intensität – schieben Sie die Leiste so, dass sie sich genau rechts vom Peak befindet.
    8. Objekte nach Größe ausschließen: alle Zellen mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm und mehr als 100 μm, um Zellreste oder nicht-zelluläre Partikel auszuschließen. Schließen Sie T-Zellen aus, die weniger als 20 % der Aufzeichnungszeit wandern (was je nach Definition des jeweiligen Prüfarztes variieren kann).
    9. Statische Objekte ignorieren (Kontrollkästchen).
    10. Unterbrochene Bezirke automatisch verbinden (Kontrollkästchen).
    11. Stellen Sie den kürzesten Pfad auf nicht mehr als 20 μm ein.
    12. Die Spur einer Zellmigration ist die Linie, die die Position derselben Zelle im Laufe der Zeit verbindet. Stellen Sie sicher, dass der Tracking-Algorithmus die Verfolgung durchführt, indem Sie durch Segmentierung in jedem Frame erkennen, wo einzelne Objekte erkannt werden, und die Objekte über Frames hinweg abgleichen.
    13. Speichern Sie ein neues Protokoll, indem Sie Messungen > Protokoll speichern > Namen Neues Protokoll auswählen.
    14. Klicken Sie auf der Registerkarte "Messung" auf "Alle Zeitpunkte messen".
    15. Sortieren Sie Tracks nach Zeitspanne, von hoch nach niedrig.
    16. Notieren Sie die Spur-ID-Nummern für alle Zellen mit guten Spuren, wie vom Untersucher definiert. Nach der automatischen Zellverfolgung ist eine manuelle Auswertung jeder Zellspur notwendig, um falsch identifizierte oder defekte Spuren auszuschließen. Schließen Sie Zellen mit fehlerhaften Spuren aus.
    17. Exportieren Sie die Datei als kommagetrennten Text und übertragen Sie die Daten an die gewünschte Analysesoftware.
      HINWEIS: Grundlegende Parameter: Geschwindigkeit (μm/min), Verschiebung (Nettobewegung, μm), Gleislänge (Gesamtweglänge, μm) und Mäanderindex (MI; Nettoverschiebung/Gleislänge). MI = 1 steht für eine vollständig gerade lineare Bahn).
  2. Führen Sie eine manuelle Nachverfolgung mit Image J durch.
    1. Öffnen Sie Plugins und wählen Sie Tracking und manuelles Tracking aus. Stellen Sie die Parameter ein - Zeitintervalle, x/y-Kalibrierung (Pixelgröße) und z-Kalibrierung (im manuellen Tracking-Modus). Starten Sie die Verfolgung einzelner Zellen, indem Sie auf Spur hinzufügen klicken, eine Zelle zum ersten Zeitpunkt auswählen und über alle Zeitpunkte hinweg fortsetzen. Klicken Sie anschließend auf Track beenden. Wiederholen Sie dies für alle interessierenden Zellen.
      HINWEIS: Trackmate, ein weiteres Tool für die Zellverfolgung, ist eine automatische Tracking-Software, die über das ImageJ-Plugin verfügbar ist.

Ergebnisse

Die Bestätigung der T-Zell-Aktivierung kann durch Durchflusszytometrie erreicht werden, wobei nach einer erhöhten Expression von CD69 und CD44 gesucht wird, die kanonische Marker für die Aktivierung in murinen T-Zellen sind6. Zusätzlich kann die Reinheit der T-Zellpopulation durch Durchflusszytometrie für CD3+ CD8+ T-Zellen bestimmt werden. Diese Methode ergibt >90 % CD8+ T-Zellpopulation.

Die T-Zell-Migration kann mit softwaregestützten Zellverfolgungsprogrammen bewertet werden, die sowohl reproduzierbar als auch auf die Bedürfnisse des Prüfarztes abgestimmt sind. Zu den grundlegenden Parametern, die zur Bestimmung experimenteller Effekte verwendet werden, gehören die zelluläre Geschwindigkeit (Migrationslänge pro einer bestimmten Zeit, um zu bestimmen, wie schnell sich eine Zelle bewegt), die Verschiebung (Migrationsentfernung, eine gerade Linie vom Startpunkt zum Endpunkt, um zu bestimmen, wie weit eine Zelle wandert), die Spurlänge (Migrationsentfernung, die Gesamtlänge des Migrationspfads, um zu bestimmen, wie weit eine Zelle wandert), und mäandernder Index (MI liegt zwischen 0 und 1, um die Geradlinigkeit der Migration zu bestimmen, 1 = gerade). Diese Parameter werden verwendet, um Migrationsunterschiede zwischen naiven und aktivierten CD8+ T-Zellen zu bewerten, die entlang von ICAM-1-beschichtetem Glas mit CXCL12 kriechen (Abbildung 1). Eine erhöhte durchschnittliche Geschwindigkeit, Verschiebung und ein erhöhter Mäanderindex wurden bei aktivierten CD8+ T-Zellen im Vergleich zu naiven Zellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass aktivierte T-Zellen eine erhöhte Migrationsfähigkeit aufweisen. Ebenso kann mit diesen Methoden der Einfluss verschiedener Chemokine auf zelluläre Migrationsmuster aufgeklärt werden. Zum Beispiel zeigen aktivierte CD8+ T-Zellen eine erhöhte Migration in Gegenwart von CXCL12, aber nicht von CCL2 oder CCL22, und die Migration nimmt dosisabhängig bis zu einer Sättigungskonzentration zu (Abbildung 2). Darüber hinaus ermöglicht die softwaregestützte Zellverfolgung die Charakterisierung der individuellen Zellmigration, was ein Verständnis der Auswirkungen einzelner Liganden auf das Verhalten von T-Zellen ermöglicht. Repräsentative Zellverläufe sind in Abbildung 3 zu sehen.

Zusammengenommen unterstützen diese Daten die Wirksamkeit der aktuellen Methoden, indem sie bestätigen, dass wir (1) die Zellmigration auf individueller Zellbasis verfolgen und (2) Unterschiede in der Migration von CD8+ T-Zellen basierend auf dem Aktivierungsstatus und in Gegenwart verschiedener Chemokine und Adhäsionsmoleküle unterscheiden können. Dieser Assay ist ein entscheidender Schritt bei der Entschlüsselung komplexer Signalmechanismen und der Information über fokussierte In-vivo-Experimente , die die biologischen Beiträge spezifischer Signale auf zelltypspezifische Weise weiter untersuchen können.

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Abbildung 1: In vitro Assays für naive und aktivierte CD8+ T-Zellmigration. Naive oder CD3/CD28-aktivierte CD8+ T-Zellen der Maus durften 10 Minuten lang auf ICAM-1 plus CXCL12 migrieren. Geschwindigkeit, Verschiebung und Mäanderindex der Zellmigration wurden mittels Zeitraffermikroskopie und Volocity analysiert. Jede Gruppe hat 36 einzelne T-Zellen (Mittelwert ± SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: In vitro Assays zur Chemokin-abhängigen Migration von aktivierten CD8+ T-Zellen. CD3/CD28-aktivierte CD8+ T-Zellen der Maus durften auf ICAM-1 plus einem indizierten Chemokin migrieren. Die Verhältnisse der Anzahl der Zellen, die 20 min lang mehr als 50 μm kriechen (prozentual von der Gesamtmenge), wurden in einem Sichtfeld bestimmt. Ein einzelner Assay analysierte >10 Zellen (n = 3 Assays pro Gruppenmittelwert ± SEM). Ungekoppelter t-Test, *p< 0,05 im Vergleich zur Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Migrationsspuren von aktivierten CD8+ T-Zellen auf ICAM-1 plus CXCL12 für 20 min. Jede farbige Linie zeigt die Zugbahn jeder T-Zelle in einer Richtung vom Punkt der Zelle in die entgegengesetzte Richtung an. In diesem speziellen Assay wanderten 24 von 38 Zellen in einer signifikanten Länge (mindestens dem Abstand ihrer Zellbreite nach unserer Definition). T-Zellen wanderten in unterschiedlich langen Abständen, was darauf hindeutet, dass sich jede Zelle in einem anderen Aktivierungs- oder Priming-Status befand. Alle wandernden Zellen bewegten sich in unterschiedliche Richtungen, unter der Bedingung, dass die Oberfläche gleichmäßig beschichtet war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das Verständnis der biologischen Auswirkungen konvergierender Signale in vivo ist eine Herausforderung und nicht einfach zu interpretieren. Die hierin vorgestellten Protokolle stellen eine vernünftige Methode dar, um die T-Zell-Migration unter hochdefinierten und biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen. Diese Bedingungen können nach Ermessen des Prüfarztes festgelegt werden, und die Protokolle können an die Bedürfnisse verschiedener T-Zellpopulationen, des Aktivierungsstatus und des Zellphänotyps angepasst werden. Darüber hinaus können viele Liganden und Rezeptoren durch diesedefinierten antikörperblockierenden 7,8 und ligandenbeschichteten Glasverfahren 8,9,10 abgefragt werden. Diese Technik war auch eine wichtige Plattform für die Entwicklung von gentechnisch veränderten Immunzellen11,12.

Zu den wichtigen Schritten des Protokolls gehören die Isolierung des sekundären lymphatischen Gewebes, die Aktivierung der T-Zellen, die Beschichtung der Glas-Bildgebungsschalen und die Datenanalyse. Für das unerfahrene Auge können im Gewebe eingebettete Lymphknoten schwer zu identifizieren und zu extrahieren sein. Dies kann mit Übung überwunden werden. Sobald die T-Zellen isoliert und gereinigt wurden, führt der Aktivierungsschritt zu klebrigen Zellen, die, wenn sie nicht richtig angehoben werden, zu einer geringen Ausbeute führen können. Dies kann durch großzügiges und sorgfältiges Waschen der Brunnen vermieden werden. Glasschalen müssen ordnungsgemäß mit dem interessierenden Liganden beschichtet und vor der Zugabe von Zellen gewaschen werden. Dadurch wird sichergestellt, dass den Zellen eine robuste Proteinschicht zur Verfügung steht, an der sie haften können, und gleichzeitig wird sichergestellt, dass überschüssiges Reagenz die Biologie nicht stört. Die Bindung der Protein-A-Glasoberfläche und der Fc-Protein-A-Bindung im physiologischen pH-Wert und in der Salzkonzentration sind stark genug, um beim schonenden Gießen und Dekantieren des Puffers nicht abgewaschen zu werden. Restproteine, falls vorhanden, verursachen keine Toxizität, auch wenn sie die Zellinteraktion mit gebundenen Liganden stören könnten, wenn ungebundene Liganden in hohen Konzentrationen vorliegen. Wir schließen diese Möglichkeit aus, indem wir das beschichtete Glas ein paar Mal spülen. Schließlich gibt es viele benutzerfreundliche kommerzielle und nicht-kommerzielle Software, die es Forschern ermöglicht, selbst subtile Unterschiede im zellulären Verhalten und in der Morphologie zu erkennen. Es kann nicht genug betont werden, wie wichtig es ist, die analysierten Ergebnisse manuell zu bestätigen, um Fehler auszuschließen, die die Software machen könnte.

Die Methoden zur Reinigung und Aktivierung von T-Zellen können modifiziert werden, um den Bedürfnissen des Forschers gerecht zu werden, um den richtigen Zellzustand und Phänotyp für die Rekapitulation von In-vivo-Beobachtungen zu erhalten. Verschiedene Zelltypen und -zustände können verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der Infektion und Immunantwort zu adressieren 7,8,9,10,11,13, einschließlich der Adressierung des naiven und Gedächtnisverhaltens von T-Zellen und verschiedener Aspekte der Gedächtnisreaktion, wie z. B. Priming und Rekrutierung, unter gewebespezifischen Bedingungen14. Diese Methode kann für die Co-Kultur mit verschiedenen Zelltypen verwendet werden, um zelluläre Wechselwirkungen besser zu verstehen, einschließlich Zell-Zell-Kontaktzeiten und -dauer 7,9, Antigenpräsentation 9,13 und Zielzellabtötung6. Zusätzliche Reporter und Markierungen können verwendet werden, um subzelluläre Strukturen7, Granulate15, Apoptose6 und mehr zu beurteilen.

Das Protokoll ist ein hervorragendes Werkzeug, um zusätzliche In-vivo-Experimente auf der Grundlage von Beobachtungen unter vereinfachten und hochdefinierten Bedingungen zu leiten. Während die In-vitro-Beurteilung der Zellmotilität sehr reduktiv sein kann, ist sie ein wichtiger Schritt beim Abbau komplexer biologischer Aktivitäten. Mit den Ergebnissen dieser Experimente können die Forscher die Arbeit in vivo physiologisch relevanter und gezielter angehen.

Die Einfachheit dieser Methode stellt auch ihre größte Einschränkung dar; Obwohl sie repräsentativ für In-vivo-Aktivitäten sind, können alle Ergebnisse z. B. durch intravitale Multiphotonenmikroskopie weiter bestätigt werden. Das hierin beschriebene Verfahren ist eines der einfachsten, das Forschungslaboratorien mit einem Hellfeldmikroskop und/oder Epifluoreszenzmikroskop mit einer in das Mikroskopsystem integrierten Digitalkamera vollständig zur Verfügung steht oder separat auf das Objektiv des Zielfernrohrs aufgesetzt ist. Auf der anderen Seite gibt es mehr Möglichkeiten für eine fortgeschrittene Analyse der In-vitro-Immunzellmigration. Erstens werden Immunzellen oft von Chemokin-Gradienten im biologischen System angetrieben. Die Analyse des Verhaltens von Immunzellen unter Chemokingradienten kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Eine einfache Methode ist die Verwendung einer speziell entwickelten Folie (siehe Materialtabelle). Dieses kanalisierte Well-System ermöglicht, wenn sein Boden mit Integrin-Liganden beschichtet ist, die Analyse der Immunzellmigration unter statischem Chemokingradienten. Andere einfache Assays für die Chemotaxis von Immunzellen umfassen die Zeitraffermikroskopie der Zellmigration zu einer Mikropipettenspitze, die Chemokine16 freisetzt, unter dem Agarose-Assay17 und der Zigmond-Kammer18. Für anspruchsvollere Migrationsassays unter kontrollierten Chemokingradienten sind kundenspezifische Objektträger mit mikrofluidischen Gradientengeneratoren erforderlich19,20. Zweitens können Immunzellen unter einzigartigen physikalischen Bedingungen mit unterschiedlichen Mechanismen migrieren, manchmal ohne Integrin-abhängige Adhäsion an Liganden. Der in vitro Migrationsassay in einer Dimension kann mit oder ohne Integrin-Ligandenbeschichtung durchgeführt werden und reproduziert die Motilität von Immunzellen in Kapillargefäßen21,22. Eine weitere Option ist der Zellmigrationsassay im dreidimensionalen Raum23,24 zur Untersuchung der Mechanismen, die der interstitiellen Migration von Zellen zugrunde liegen25,26. Insgesamt haben wir einfache, reproduzierbare und zuverlässige Methoden zur Untersuchung dynamischer zellulärer Migrationsereignisse skizziert.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass alle Recherchen und die Erstellung des Manuskripts in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurden, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Wir danken früheren und aktuellen Mitgliedern des Kim-Labors, die im Laufe der Zeit zur Entwicklung dieser Protokolle beigetragen haben. Repräsentative Daten wurden durch P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Vereinigte Staaten und P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Vereinigte Staaten ermöglicht. Diese Veröffentlichung wurde zum Teil durch die Fördernummer T32 ermöglicht, die GM135134 des Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award vergeben wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm SchaleCorning353003oder gleichwertig
15 mL konisches RöhrchenThermoFisher339650oder gleichwertig
1x DPBSGibco14190144ohne Calcium und ohne Magnesium
6-Well-Platte nicht TC-behandeltCorning3736oder gleichwertig
70 & Mikro; m ZellsiebFisherScientific352350oder gleichwertig
ACK Lysing PufferThermoFisherA1049201oder gleichwertige
Allegra 6KR ZentrifugeThermoScientificsorvall 16R mit tx400 3655 Rotor und Eimeroder gleichwertiges
Beta MercaptoethanolSigmaM3148oder gleichwertig
CellTrace VioletThermoFisherC34571oder gleichwertig
ZentrifugeThermoScientificSorvall ST 16Roder gleichwertig
Kollagen (IV)Corning354233oder gleichwertige
DeltaT-Kulturschale .17 mm dickes Glas klarBioptechs04200417C
Dynabeads Schafe Anti-RatteIgG Invitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Doder gleichwertig
Easy sep Maus T-Zell-IsolationskitStammzelle19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLoder gleichwertig
FibronektinSigmaAldrich10838039001oder gleichwertig
Fidschihttp://fiji.sc/Weblink
FilterwürfelNikon oder Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080oder gleichwertige
HQ CCD-KameraCoolSNAPoder gleichwertig
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hWeblink
ImageJ automatisches Tracking-Plug-inhttp://imagej.net/TrackMateWeblink
ImageJ manuelles Tracking plug inhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15VerschiedenesSiehe MaterialienMedium Rezept: Leibovitz' s L-15 Medium ohne Phenolrot (Gibco) ergänzt mit 1-5 g/L Glukose
Liebovitz's L-15 Medium, kein PhenolrotThermoFisher21083027
Luer Lok EinwegspritzeFisher Scientific14-955-459oder gleichwertig
LymphozytentrennmediumCorning25-072-CIoder gleichwertig
M5/114ATCCTIB-120
MEM Nicht-essentielle AminosäurenThermoFisher11140050oder gleichwertig
Mikroskop-HeizsystemOkolabokolab.comSonderanfertigungen verfügbar
Millicell EZ ObjektträgerMilliporeC86024
Mojosort Maus CD8+ Naï ve T-Zell-IsolationskitBiolegend480043
Maus E-CadherinR& D systems8875-EC-050oder gleichwertig
Chirurgisches Dissektionsset für MäuseFisher Scientific13-820-096oder gleichwertige
NIS-ElementeNikonSoftware
non-TC 24wpCorning353047oder gleichwertiges
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122oder gleichwertiges
Protein AThermoFisher Scientificoder gleichwertig
R9VerschiedeneSiehe MaterialienMedium Rezept: RPMI 1640x ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum-Antimykotikum (Gibco), 20 mM HEPES-Puffer (Gibco), 1 % MEM nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco), 50 μ M β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Rekombinante Maus ICAM-1 Fc ChimäreR& D systems796-IC-050oder gleichwertig
Rekombinante Maus IL2Biolegend575410oder gleichwertig
RPMI 1640xThermoFisher11875093oder gleichwertige
T-PinsFisher ScientificS99385oder gleichwertig
TE2000-U MikroskopNikonoder gleichwertig
Verschiedene rekombinante Maus ChemokinR& D-Systemeoder gleichwertige
VCAM-1 Fc-ChimäreF& D systems643-VM-050oder gleichwertig
VolocityPerkinElmerSoftware

Referenzen

  1. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  2. Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
  3. Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815(2021).
  4. Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
  5. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739(2015).
  6. Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850(2023).
  7. Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
  8. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352(2015).
  9. Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
  10. Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
  11. Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231(2021).
  12. Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
  13. Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
  14. Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
  15. Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239(2013).
  16. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
  17. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
  18. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), Pt 1 606-616 (1977).
  19. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
  20. Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
  21. Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
  22. Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379(2014).
  23. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963(2014).
  24. Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
  25. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  26. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).

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