Method Article

CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek

DOI:

10.3791/66581

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May 17th, 2024

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1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellen ein Protokoll für die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass) vor, eine Methode zum Hochdurchsatzaufbau von UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliotheken in Drosophila unter Verwendung öffentlich verfügbarer cDNA/ORF-Ressourcen. CRISPRmass kann zur Bearbeitung verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden.

Abstract

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Das funktionelle Genomik-Screening bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion und stützt sich auf den Aufbau genomweiter Plasmidbibliotheken. Herkömmliche Ansätze für den Aufbau von Plasmidbibliotheken sind zeitaufwändig und mühsam. Aus diesem Grund haben wir kürzlich eine einfache und effiziente Methode, die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass), für den Hochdurchsatzaufbau einer genomweiten Upstream-aktivierenden sequenzkomplementären DNA/Open Reading Frame (UAS-cDNA/ORF) Plasmidbibliothek entwickelt. Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, am Beispiel des Aufbaus einer GAL4/UAS-basierten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek. Das Protokoll umfasst massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen, gefolgt von einer bakteriellen Transformation. Der erste Schritt besteht darin, die vorhandenen komplementären DNA- (cDNA) oder Open Reading Frame (ORF)-cDNA- oder ORF-Bibliotheksplasmide zu linearisieren, indem die gemeinsam genutzten Upstream-Vektorsequenzen neben dem 5'-Ende von cDNAs oder ORFs unter Verwendung von CRISPR/Cas9 zusammen mit Single-Guide-RNA (sgRNA) geschnitten werden, und der zweite Schritt besteht darin, ein UAS-Modul in die linearisierten cDNA- oder ORF-Plasmide mit einer einstufigen Reaktion einzufügen. CRISPRmass ermöglicht den einfachen, schnellen, effizienten und kostengünstigen Aufbau verschiedener Plasmidbibliotheken. Die UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek kann für das Gain-of-Function-Screening in kultivierten Zellen und für den Aufbau einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila verwendet werden.

Introduction

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Das unvoreingenommene genetische Screening des gesamten Genoms ist ein leistungsfähiger Ansatz, um Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten biologischen Prozess beteiligt sind, und seinen Mechanismus aufzuklären. Daher ist es in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung weit verbreitet. Ungefähr 60% der Drosophila-Gene sind beim Menschen konserviert 1,2, und ~75% der menschlichen Krankheitsgene haben Homologe in Drosophila3. Das genetische Screening wird hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: Funktionsverlust (LOF) und Funktionsgewinn (GOF). LOF-Genetic Screens in Drosophila haben eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung von Mechanismen gespielt, die fast jeden Aspekt der Biologie steuern. Die Mehrzahl der Drosophila-Gene weist jedoch keine offensichtlichen LOF-Phänotypenauf 4, und daher ist das GOF-Screening eine wichtige Methode, um die Funktion dieser Gene zu untersuchen 4,5.

Das binäre GAL4/UAS-System wird häufig für die gewebespezifische Genexpression in Drosophila6 verwendet. In diesem System exprimiert das Gewebe spezifisch den Hefetranskriptionsaktivator GAL4, der an das GAL4-responsive Element (UAS) bindet und dadurch die Transkription der nachgeschalteten genetischen Komponenten (z. B. cDNA und ORF) aktiviert6. Um genomweite GOF-Screenings in Drosophila durchführen zu können, müssen wir eine genomweite UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek und anschließend eine transgene UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila konstruieren.

Der Aufbau einer genomweiten UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek mit herkömmlichen Methoden aus öffentlich zugänglichen cDNA/ORF-Klonen ist zeitaufwändig und mühsam, da jedes Gen ein individuelles Design erfordert, einschließlich Primerdesign und -synthese, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gelreinigung, Sequenzierung, Restriktionsverdau usw. 7,8. Daher ist der Aufbau einer solchen Plasmidbibliothek ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt bei der Erstellung einer genomweiten transgenen UAS-cDNA/ORF-Bibliothek in Drosophila. Vor kurzem haben wir dieses Problem erfolgreich gelöst, indem wir eine neuartige Methode entwickelt haben, die CRISPR-basierte modulare Anordnung (CRISPRmass)9. Der Kern von CRISPRmass besteht darin, die gemeinsam genutzten Vektorsequenzen einer Plasmidbibliothek durch eine Kombination aus Gen-Editing-Technologie und nahtloser Klonierungstechnologie zu manipulieren.

Hier stellen wir ein Protokoll für CRISPRmass vor, das massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen mit anschließender bakterieller Transformation umfasst. CRISPRmass ist eine einfache, schnelle, effiziente und kostengünstige Methode, die prinzipiell für den Hochdurchsatzaufbau verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden kann.

CRISPRmass-Strategie
Das Verfahren von CRISPRmass beginnt mit parallelen zweistufigen Reagenzglasreaktionen vor der Transformation von Escherichia coli (E. coli) (Abbildung 1). Schritt 1 ist die Spaltung der identischen Vektorrückgrate der cDNA/ORF-Plasmide durch Cas9/sgRNA. Eine ideale Spaltstelle befindet sich neben dem 5'-Ende der cDNA/ORF. Die Spaltprodukte müssen nicht gereinigt werden. Schritt 2 ist das Einfügen eines vektorspezifischen UAS-Moduls in die Cas9/sgRNA-linearisierten cDNA/ORF-Plasmide durch Gibson-Assemblierung (im Folgenden als Einzelschrittreaktion bezeichnet), was zu UAS-cDNA/ORF-Plasmiden führt. Die 5'- und 3'-terminalen Sequenzen eines UAS-Moduls überlappen sich mit denen der linearisierten cDNA/ORF-Plasmide, was die einstufige Reaktion ermöglicht.

Die einstufigen Reaktionsprodukte werden direkt der E. coli-Transformation unterzogen. Theoretisch können auf Luria-Bertani (LB)-Platten nur die gewünschten UAS-cDNA/ORF-Kolonien wachsen, die Selektionsantibiotika enthalten, die dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entsprechen. Das UAS-Modul besteht aus einem UAS-Kernmodul, einem Antibiotikaresistenzgen, das sich von dem der cDNA- oder ORF-Plasmide unterscheidet, und den 5'- und 3'-terminalen Sequenzen. Ein UAS-Kernmodul besteht aus 10 UAS-Kopien, einem Hsp70-Minimalpromotor, einer attB-Sequenz für die phiC31-vermittelte genomische Integration und einem Mini-White-Transformationsmarker für Drosophila7.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bestimmung der optimalen Cas9/sgRNA-Spaltstelle stromaufwärts von cDNA/ORF

  1. Präparation von cDNA- oder ORF-Plasmiden mit identischem Vektorrückgrat
    1. Kaufen Sie cDNA/ORF-Klone, die in öffentlichen Ressourcen verfügbar sind, wie z. B. dem Drosophila Genome Resource Center (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection10,11, der mouse mammalian gene collection (MGC, https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/) und der humanen CCSB-breiten Lentiviral-Expressionsbibliothek12. In diesem Protokoll nehmen wir als Beispiel die pOT2-Vektor-basierten cDNA/ORF-Klone, die in der DGRC Gold Collection verfügbar sind.
    2. Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Mini-Prep-Kit. Messen Sie die Konzentration von Plasmiden mit einem Spektralphotometer.
  2. Design von sgRNAs
    1. Besuchen Sie die CHOPCHOP-Website (https://chopchop.cbu.uib.no/). Klicken Sie auf die Schaltfläche Ziel einfügen und geben Sie dann die gewünschte DNA-Sequenz ein. Bei der interessierenden Sequenz handelt es sich um eine 20-100 bp große Region, die sich im pOT2-Vektorrückgrat stromaufwärts des cDNA/ORF 5'-Endes befindet.
    2. Wählen Sie die Art Drosophila melanogaster. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zielseiten suchen. Wählen Sie sgRNA-Kandidaten mit einer prognostizierten Effizienz von mehr als 80 %.
  3. Herstellung von sgRNAs
    1. Bestellen Sie PAGE-gereinigte Oligos, einen Forward Primer (5′ -TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTA
      GAAATAG-3′), wobei (N)20 die Zielsequenz einer sgRNA und eines sgRNA-Gerüst-Reverse-Primers sgRNA-REV (5′-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′) ist.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, PAGE-gereinigte, hochwertige Oligonukleotide zu verwenden.
    2. Bereiten Sie eine DNA-Vorlage durch PCR für die In-vitro-Transkription (IVT) von sgRNA vor. Richten Sie eine 100-μl-PCR-Reaktion wie folgt ein: 5 μl Template pX330 (Addgene-Plasmid 42230, ein Geschenk von Feng Zhang; 0,1 ng/μl), 5 μl Forward-Primer (10 μM), 5 μl sgRNA-REV (10 μM), 50 μl 2x High-Fidelity-PCR-Mastermix und 35 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser in einem PCR-Röhrchen.
    3. Führen Sie die PCR unter den folgenden Thermocycling-Bedingungen durch: 1 Zyklus mit 98 °C für 30 s; 5 Zyklen von 98 °C für 10 s, 51 °C für 10 s, 72 °C für 5 s; 30 Zyklen von 98 °C für 10 s, 72 °C für 15 s; 1 Zyklus von 72 °C für 2 min. Inkubieren Sie Reaktionen in einem Thermocycler.
    4. PCR-Produkte durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese trennen. Ein ~120-bp-DNA-Fragment sollte unter UV-Strahlung auf dem Gel sichtbar sein. Reinigen Sie das ~120-bp-DNA-Fragment mit einem Gel-Extraktionskit. Das aufgereinigte DNA-Fragment dient als Template für die IVT von sgRNA.
    5. Richten Sie eine 5-μl-IVT-Reaktion wie folgt ein: 165 ng ~120-bp gereinigtes Gel-DNA-Fragment, 1,65 μl NTP-Puffermix, 0,33 μl T7-RNA-Polymerase-Mix und DEPC-behandeltes Wasser. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für 4 h. Befolgen Sie die manuellen Anweisungen eines In-vitro-Transkriptionskits .
    6. Geben Sie 45 μl DEPC-behandeltes Wasser in das IVT-Reaktionsprodukt. Behandeln Sie die IVT-Reaktionsprodukte als RNA und verwenden Sie DEPC-behandeltes Wasser als Blindkontrolle. Messen Sie die Konzentration von sgRNA mit einem Spektralphotometer. Die Konzentration der verdünnten sgRNA liegt bei etwa 870 ng/μL.
    7. Verdünnen Sie das IVT-Reaktionsprodukt auf 20 ng/μl mit DEPC-behandeltem Wasser. Aliquotieren und lagern Sie sgRNA direkt bei -80 °C.
      HINWEIS: Nach der IVT-Reaktion ist die Entfernung des DNA-Templates durch DNase-Verdau nicht erforderlich, um die genaue Konzentration von sgRNA zu messen, da die Menge des DNA-Templates weniger als 0,4 % der Menge der sgRNA beträgt und das DNA-Template die nachfolgende CRISPRmass-Reaktion nicht beeinflusst. Daher ist eine sgRNA-Aufreinigung nicht erforderlich.
  4. Evaluierung von sgRNAs
    1. Verdau eines cDNA/ORF-Plasmids mit pOT2-Vektorrückgrat mit einem Restriktionsenzym. Trennen Sie die resultierenden DNA-Fragmente durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen Sie das DNA-Substrat mit einem Gel-Extraktionskit.
      HINWEIS: Ein resultierendes DNA-Fragment, das die sgRNA-Targeting-Sequenzen des pOT2-Vektorrückgrats enthält, dient als DNA-Substrat von Cas9/sgRNAs. Die Spaltstellen von Cas9/sgRNAs sind asymmetrisch im DNA-Substrat angeordnet, wodurch die Spaltung des DNA-Substrats durch Cas9/sgRNAs zwei DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe ergibt, was es einfacher macht, sie von dem ungespaltenen DNA-Substrat in der Verdauungsreaktion zu unterscheiden.
    2. Richten Sie eine 5 μl Cas9-Spaltreaktion wie folgt ein: 0,2 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,5 μl 20 ng/μl sgRNA, 0,015 pmol DNA-Substrat, 0,5 μl 10x Cas9-Puffer und DEPC-behandeltes Wasser. Reaktionen 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
    3. Trennen Sie die Spaltprodukte durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese. Laden Sie das intakte DNA-Substrat als Negativkontrolle für das verdaute DNA-Substrat.
      HINWEIS: Hier bezieht sich intaktes DNA-Substrat auf DNA-Substrat, das keinen Verdauungsreaktionen durch Cas9/sgRNAs unterzogen wird. Die Spaltung des DNA-Substrats durch Cas9/sgRNAs führt zu zwei DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe, wodurch sie in der Verdauungsreaktion leichter vom ungespaltenen DNA-Substrat unterschieden werden können.
    4. Analysieren Sie Spaltmuster mit einem digitalen Bildgebungssystem (Abbildung 2). Wählen Sie die effizienteste sgRNA für nachfolgende CRISPRmass-Experimente aus. Abbildung 2 zeigt, dass alle vier sgRNAs eine hohe Spaltungseffizienz aufweisen und für CRISPRmass verwendet werden können. Wählen Sie die unterstrichene sgRNA für nachfolgende Experimente aus.
      HINWEIS: Je weniger ungespaltenes DNA-Substrat vorhanden ist, desto effizienter ist die sgRNA für den Cas9/sgRNA-Verdau des DNA-Substrats.

2. Aufbau eines UAS-Moduls

HINWEIS: Ein UAS-Modul besteht aus einem Kern-UAS und etwa 20-40 bp der 5'- und 3'-Endsequenzen, die sich mit den 5'- bzw. 3'-Enden der Rückgratspaltstelle überlappen (Abbildung 1). Die 5'- und 3'-Endsequenzen des UAS-Moduls werden durch die Spaltstelle des Rückgrats des pOT2-Vektors bestimmt.

  1. Klonen Sie das vektorspezifische UAS-Modul pOT2 in die EcoRI-Stelle des pCR8GW-Vektors, was zu einem Plasmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 führt (Ergänzende Datei 1). Das vektorspezifische pOT2-UAS-Modul wird durch Aufschluss des Plasmids pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 mit EcoRI bei 37 °C für 1 h freigesetzt.
  2. Trennen Sie die Spaltprodukte durch 0,7 % Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen Sie das UAS-Modul 6178-bp mit einem Gel-Extraktionskit. Verdünnen Sie das UAS-Modul auf 23 ng/μl für nachfolgende Experimente. Dieses 6178-bp-Fragment dient als UAS-Modul für die Konstruktion von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden aus pOT2-Vektor-basierten cDNA/ORF-Klonen.

3. Großmaßstäbliche Konstruktion von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden mittels CRISPRmass

HINWEIS: CRISPRmass ist standardisiert als massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen vor der E . coli-Transformation (Abbildung 1).

  1. Reagenzglasreaktion Schritt 1
    1. Spaltung des identischen Vektorrückgrats der cDNA/ORF-Plasmide durch Cas9/sgRNA. Ordnen Sie die 0,2-ml-Röhrchen in einem Aluminiumkühlblock auf Eis an und beschriften Sie die Röhrchen sorgfältig. Bereiten Sie den Mastermix wie folgt vor.
      1. Für eine Einzelreaktion fügen Sie 0,16 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, 0,4 μl 20 ng/μl sgRNA, 0,24 μl 10x Cas9-Puffer und 1,2 μl DEPC-behandeltes Wasser hinzu. Für N-Reaktionen fügen Sie (N+1) x 0,16 μl 1,22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0,4 μl 20 ng/μl sgRNA, (N+1) x 0,24 μl 10x Cas9-Puffer, (N+1) x 1,2 μl DEPC-behandeltes Wasser hinzu.
    2. Vortexen, gut mischen und herunterschleudern. Aliquotieren Sie 2 μl Mastermix auf jedes Röhrchen. Geben Sie 0,4 μl 0,019 μM cDNA/ORF-Plasmid in jedes Röhrchen. Die Spaltreaktionen werden 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Verdünnen Sie jedes Plasmid auf 0,019 μM mit DEPC-behandeltem Wasser. Wenn die Konzentration eines Plasmids niedriger als 0,019 μM ist, fügen Sie Plasmid-DNA direkt zur Spaltungsreaktion hinzu. Verwenden Sie RNase-freie Schläuche und DEPC-behandeltes Wasser. Das Ausführen dieser Schritte in großem Umfang dauert mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie Reagenzien und Reaktionen auf Eis auf.
  2. Reagenzglasreaktion Schritt 2
    1. Einfügen eines vektorspezifischen UAS-Moduls aus Schritt 2 in die Cas9-linearisierten cDNA/ORF-Plasmide durch einstufige Reaktionsassemblierung. Richten Sie für jede Probe eine einstufige Reaktion von 1,4 μl ein. Ordnen Sie die 0,2 mL Röhrchen in einem Aluminiumkühlblock auf Eis an und beschriften Sie die Röhrchen sorgfältig.
      1. Bereiten Sie den Mastermix wie folgt vor. Für eine Einzelreaktion fügen Sie 0,07 μl 0,006 μM UAS-Modul und 0,7 μl einstufigen Reaktionsassemblierungs-Mastermix hinzu. Für N Reaktionen fügen Sie (N+1) x 0,07 μl 0,006 μM UAS-Modul und (N+1) x 0,7 μl einstufigen Reaktionsassemblierungs-Mastermix hinzu.
    2. Vortexen, gut mischen und herunterschleudern. Aliquotieren Sie 0,77 μl des Mastermixes auf jedes Röhrchen. Geben Sie 0,7 μl Cas9-linearisiertes cDNA/ORF-Plasmid in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 50 °C für 1 h.
      HINWEIS: Eine Reinigung von einstufigen Montagereaktionsprodukten ist nicht erforderlich. Das Ausführen dieser Schritte in großem Umfang dauert mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie Reagenzien und Reaktionen auf Eis auf.
  3. Umwandlung von einstufigen Assemblierungsreaktionsprodukten in großem Maßstab in E. coli .
    1. 10 μl Spitzen bei 4 °C vorkühlen. 1,5 mL Röhrchen in einem Aluminium-Kühlblock auf Eis vorkühlen.
    2. Kompetente E. coli-Zellen 5 min auf Eis auftauen. Aliquotieren Sie 10 μl kompetenter Zellen in jedes vorgekühlte 1,5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Es werden handelsübliche kompetente E. coli-Zellen mit einer Transformationseffizienz von mindestens 1 x 108 KBE/μg pUC19-DNA verwendet.
    3. 1 μl einstufiges Assemblierungsreaktionsprodukt zu 10 μl kompetenten Zellen geben, zum Mischen vorsichtig schwenken und 30 Minuten lang auf Eis legen.
    4. Inkubieren Sie die Röhrchen 1 min lang in einem 42 °C warmen Wasserbad und kühlen Sie sie dann sofort 2 min lang auf Eis.
    5. 100 μl SOC-Medium (vorgewärmt auf 37 °C) in jedes Röhrchen bei Raumtemperatur geben und in einem Schüttelinkubator (250 U/min) bei 37 °C für 1 h inkubieren.
    6. Erwärmen Sie die LB-Platten, die ein Antibiotikum enthalten, das dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entspricht, auf 37 °C. Die Zellen auf die Platten verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Das Ausführen dieser Schritte in großem Umfang dauert mehrere Stunden. Sofern nicht anders angegeben, bewahren Sie Reagenzien und Reaktionen auf Eis auf.
  4. Verifizierung von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden, die mit CRISPRmass konstruiert wurden
    1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie sie in 4,5 ml LB-Flüssigmedium, das mit der entsprechenden Auswahl an Antibiotika ergänzt wird, die dem Antibiotikaresistenzgen des UAS-Moduls entsprechen. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren.
    2. Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Mini-Prep-Kit. Eine 20-μl-Restriktionsaufschlussreaktion wie folgt einrichten: 300-500 ng/μl Plasmid, geeignete Restriktionsenzyme, Restriktionsverdauungspuffer und Reinstwasser. Reaktionen 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
    3. DNA-Fragmente werden durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese getrennt und mit einem digitalen Bildgebungssystem analysiert (Abbildung 3).

Results

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Wir haben CRISPRmass eingesetzt, um eine genomweite UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek unter Verwendung von 3402 cDNA/ORF-Klonen mit pOT2-Vektorrückgrat aus der DGRC Gold Collection zu generieren. Wir analysierten nach dem Zufallsprinzip nur eine Kolonie für jedes UAS-cDNA/ORF-Konstrukt, und die anschließende Restriktionsanalyse mit PstI zeigte, dass 98,6% der UAS-cDNA/ORF-Konstrukte erfolgreich erzeugt wurden9. Die Begründung für die Verwendung von PstI für die Restriktionsanalyse von UAS-cDNA/ORF-Konstrukten, die ein pOT2-Vektorrückgrat tragen, ist wie folgt. Es gibt zwei PstI-Stellen im UAS-Modul für die vektorbasierten pOT2-cDNA/ORF-Klone, und es gibt eine PstI-Stelle im pOT2-Vektor-Rückgrat. Dabei ergibt der Verdau eines pOT2-Vektor-basierten UAS-cDNA/ORF-Konstrukts mit PstI ein 408 bp UAS-Modul-spezifisches Fragment und ein 5649 bp UAS-Modul-Vektor-Assemblierungs-spezifisches Fragment. Die PstI-Fragmente mit einem Alter von 408 bp und 5649 bp deuten darauf hin, dass UAS-cDNA/ORF-Konstrukte für pOT2-Vektor-basierte cDNA/ORF-Klone erfolgreich erstellt wurden, und die repräsentativen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt.

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Abbildung 1: Flussdiagramm des Aufbaus von UAS-cDNA/ORF-Bibliotheken mit CRISPRmass. Die CRISPRmass-Pipeline für den Aufbau einer UAS-cDNA/ORF-Bibliothek. (1) Der erste Schritt der Reagenzglasreaktion. Die identischen Vektorrückgrate von cDNA/ORF-Plasmiden werden durch Cas9/sgRNA gespalten. Die Spaltstelle befindet sich in Vektorrückgraten, das stromaufwärts des cDNA/ORF 5'-Endes angrenzt. Die Spaltprodukte werden ohne Reinigung direkt dem zweiten Schritt der Reagenzglasreaktion unterzogen. Die in Spaltungsreaktionen verwendeten sgRNAs werden durch In-vitro-Transkription hergestellt und können ohne Aufreinigung direkt verwendet werden. Dann werden 28-40 bp des 5'-Endes der Spaltstelle (gelber Kasten) als 5'-Endüberlappung und 28-40 bp des 3'-Endes der Spaltstelle (roter Kasten) als 3'-Endüberlappung definiert. Das Vektorrückgrat trägt das Antibiotika-A-Resistenzgen (grüner Kasten). (2) Der zweite Schritt ist die Reagenzglasreaktion. Ein vektorspezifisches UAS-Modul wird direkt vor dem cDNA/ORF5'-Ende durch eine einstufige Reaktionsassemblierung mit den Cas9-linearisierten cDNA/ORF-Plasmiden verbunden, was zu UAS-cDNA/ORF-Konstrukten führt. Einstufige Reaktionsassemblierungsprodukte werden direkt der E. coli-Transformation unterzogen. Die Selektion der Transformanten erfolgt auf LB-Agarplatten, die das Antibiotikum B enthalten, das dem Antibiotika-B-Resistenzgen (Brownbox) des vektorspezifischen UAS-Moduls entspricht. Es können nur die gewünschten UAS-cDNA/ORF-Kolonien wachsen. Ein UAS-Modul besteht aus 10 UAS-Kopien, einem Hsp70-Minimalpromotor, einer attB-Sequenz für die phiC31-vermittelte genomische Integration, einem Mini-White-Transformationsmarker für die Drosophila-Transgenese , einem selektierbaren Antibiotika-B-Resistenzgen für die positive Selektion und der 5'-Endüberlappung und der 3'-Endüberlappung, die einen einstufigen Reaktionsaufbau ermöglicht. Die einstufige Reaktionsanordnung filtert mögliche Off-Target-DNA-Spaltungen heraus, die durch CRISPR/Cas9 verursacht werden. Diese Zahl wurde von9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Evaluierung von sgRNAs, die auf bestimmte Regionen des pOT2-Vektorrückgrats abzielen, durch in vitro Cas9-Spaltungsanalyse. Die unterstrichenen sgRNAs werden für CRISPRmass ausgewählt. M ist der DNA-Marker. Diese Zahl wurde von9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Restriktionsanalyse von 20 UAS-cDNA/ORF-Konstrukten, die mit CRISPRmass erzeugt wurden. Die Konstrukte wurden mittels PstI-Aufschluss analysiert. Die erwarteten Restriktionsmuster für alle UAS-cDNA/ORF-Konstrukte wurden beobachtet. M ist der DNA-Marker. Diese Zahl wurde von9 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Aufbau des Plasmids pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70. Das vektorspezifische UAS-Modul pOT2 mit dem Plasmid pCR8GW-Amp-W-attB-UAS-Hsp70 ist auf Basis der drei Plasmide pMartini-Amp, pBS-attB-UAS-Hsp70 und pCR8GW-Amp-attB-UAS-Hsp70 aufgebaut. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

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Die kritischsten Schritte von CRISPRmass sind das Design von sgRNAs und die Evaluierung von sgRNAs. Die Auswahl hocheffizienter sgRNAs für Cas9 ist der Schlüssel zum Erfolg von CRISPRmass. Wenn auf der Mehrzahl der antibiotikahaltigen LB-Platten nach der Transformation von E. coli mit einstufigen Reaktionsassemblierungsprodukten nur sehr wenige oder keine Kolonien beobachtet werden, ist der Plasmidverdau durch Agarosegelelektrophorese zu überprüfen. Wenn Plasmide nicht gut verdaut werden, überprüfen Sie die Cas9-Aktivität, den sgRNA-Abbau und die Plasmidqualität. Wenn die Plasmide gut verdaut sind, überprüfen Sie die Reagenzien für die einstufige Reaktionsassemblierung und stellen Sie sicher, dass die Transformationseffizienz kompetenter Zellen mindestens 1 x 108 KBE/μg pUC19-DNA beträgt. Bemerkenswert ist, dass die Verwendung eines Aluminium-Kühlblocks die großflächige bakterielle Umwandlung erleichtern kann.

Die Einschränkungen von CRISPRmass ergeben sich aus der Manipulation und dem Einbau von Vektor-Backbone-Sequenzen, was die Möglichkeit einschränkt, die cDNAs und ORFs entweder am 5'- oder 3'-Ende zu markieren.

Im Gegensatz zu allen anderen bestehenden Verfahren 7,8 manipuliert und integriert CRISPRmass Vektor-Backbone-Sequenzen9. Sobald die UAS-Module entworfen und vorbereitet sind, benötigt CRISPRmass daher kein individuelles Design oder eine Manipulation für jedes einzelne Plasmid, sondern massiv parallele zweistufige Reagenzglasreaktionen vor der bakteriellen Transformation, wodurch die PCR und die damit verbundenen Manipulationen vermieden werden. Darüber hinaus müssen sowohl die in vitro transkribierten sgRNAs als auch die einstufigen Reaktionsassemblierungsprodukte für die nachfolgenden Experimente nicht aufgereinigt werden. Im Vergleich zur Gateway-Klonierungstechnologie eignet sich CRISPRmass besser für die Erzeugung von UAS-cDNA/ORF-Konstrukten, insbesondere aus langen oder GC-reichen cDNAs/ORFs, da CRISPRmass die cDNAs oder ORFs selbst nicht PCR-amplifiziert9.

CRISPRmass kann sowohl für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek als auch für die Bearbeitung verschiedener genomweiter Plasmidbibliotheken verwendet werden. CRISPRmass kann zur Konstruktion einer Expressionsplasmidbibliothek verwendet werden, indem ein CMV-Promotor in die gemeinsam genutzten Vektorsequenzen neben dem 5'-Ende von cDNAs oder ORFs eingefügt wird. CRISPRmass verspricht, die Entwicklung der funktionellen Genomik zu beschleunigen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071135 und 31471010), dem Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400) gesponsert.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminium-KühlblockAikbbioADMK-0296Zur Durchführung der bakteriellen Transformation
DEPC-behandeltes WasserInvitrogenAM9906
Gel-ExtraktionskitOmegaD2500Zur Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gel
Gel-Imaging-SystemTanon2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA-Synthese-KitNEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621
Plasmid Mini KitOmegaD6943Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
Schüttel-InkubatorShanghai Zhichu ZQLY-180V
T-Serie Multi-Block-ThermocyclerLongGeneT20Zur Durchführung von PCR 
Trans10 Chemisch kompetente ZelleTranGen BioTechCD101
Ultraviolett-SpektralphotometerShimadzuBioSpec-nanoZur Messung der Konzentration von DNA oder RNA

References

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