Methodenartikel

In-vitro-Kultivierungstechnik zur Untersuchung der zellulären Dynamik in Zebrafischschuppen

DOI:

10.3791/66619

⸱

10. Januar 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der zellulären Dynamik mit einer einfachen In-vitro-Kulturtechnik . Es bietet Zebrafischforschern und Pädagogen die Möglichkeit, zelluläre Prozesse, wie z. B. solche, die mit der Knochenhomöostase und der grundlegenden Zellbiologie zusammenhängen, zu untersuchen, indem fluoreszierende Zellkerne und apoptotische Zellen innerhalb der Skalen sichtbar gemacht werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafischschuppen bieten eine Vielzahl von Vorteilen für den Einsatz in Standardlaboren für Lehr- und Forschungszwecke. Die Schuppen lassen sich leicht und ohne Euthanasie sammeln, regenerieren sich innerhalb weniger Wochen und sind durchscheinend und klein, so dass sie mit einem Standardmikroskop betrachtet werden können. Zebrafischschuppen sind besonders nützlich in Bildungsumgebungen, da sie den Schülern eine einzigartige Gelegenheit bieten, praktische Lernerfahrungen zu machen, insbesondere im Verständnis der Zelldynamik und der In-vitro-Kultivierungsmethoden . Das Hauptziel dieses Protokolls besteht darin, eine Methode zur Entnahme und Konservierung von Zebrafischschuppen in Kultur zu beschreiben, die in einer Vielzahl von biologischen Studien unter Verwendung grundlegender Laborgeräte verwendet werden kann. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll ihre Verwendung zum Verständnis der Knochenhomöostase durch die Untersuchung der Aktivität von Knochenzellen, die an der Knochenresorption und -ablagerung beteiligt sind. Es enthält auch zusätzliche Protokolle für allgemeine Techniken, wie z. B. die Visualisierung von Zellkernen und apoptotischen Zellen. Das In-vitro-Kultivierungsprotokoll liefert zuverlässige Ergebnisse mit minimalen Reagenzien und Geräten. In diesem Artikel werden die Vorteile der Verwendung von In-vitro-Kulturen von Zebrafischschuppen zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung diskutiert und die Ressourcen skizziert, die zur Unterstützung ihrer Integration in Bildungseinrichtungen erforderlich sind.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahren hat sich der Zebrafisch (Danio rerio) zu einem wertvollen Modellorganismus in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen entwickelt, darunter Genetik, Entwicklungsbiologie und Toxikologie 1,2,3. Zebrafische sind kleine tropische Süßwasserfische, die in den Flüssen Südostasiens beheimatetsind 4. Sie sind aufgrund ihrer einfachen Pflege, ihrer geringen Größe, ihres schnellen Fortpflanzungszyklus und ihrer durchscheinenden Embryonen zu einem beliebten Modellorganismus in der Biologie geworden1. Dies ermöglicht eine einfache Beobachtung ihrer inneren Entwicklung und macht sie ideal für die Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse in der Entwicklungsbiologie. Zebrafische haben genetische Ähnlichkeiten mit dem Menschen; Etwa 70 % der menschlichen Gene haben mindestens ein Zebrafisch-Gegenstück, was sie zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung genetischer Störungen und Krankheiten beim Menschen macht 5,6. Durch die Manipulation spezifischer Gene im Zebrafisch können Forscher wertvolle Einblicke in die Funktion und das Verhalten von Genen gewinnen, die dann auf die menschliche Gesundheitsforschung 6, die Geneditierung und die Schaffung transgener Linien übertragen werden können 7,8.

Zebrafischschuppen regenerieren sich nach der Entnahme 9,10 und können ein bis drei Tage lang mit einem basischen (nichtCO 2) Inkubator kultiviert werden, während sie für Experimente verwendet werden11. Die Verwendung von Zebrafischschuppen ist in Grundlagenlaboratorien von Vorteil, da sie aus betäubten Fischen entnommen werden können, ohne dass eine Euthanasie erforderlich ist. Zebrafischschuppen sind ein Bestandteil des Hautskeletts, das hauptsächlich aus zwei Schichten besteht: der inneren Schicht, die dick ist und aus teilweise mineralisiertem Gewebe besteht, das aus Schichten von Kollagenfibrillen besteht, und der äußeren Schicht, die stark mineralisiert ist und ein Netzwerk von miteinander verwobenen Kollagenfibrillen12,13 enthält (Abbildung 1A-C). Diese morphologischen und zellulären Merkmale der Skala lassen sich leicht unter einem Standard-Verbundmikroskop beobachten. Diese Eigenschaften machen Zebrafischschuppen zu einem guten Modell für die Untersuchung von zellulären und molekularen Zellen. Zum Beispiel wurden Zebrafischschuppen verwendet, um die Homöostase der Knochen, einschließlich der Knochenzellaktivität, zu untersuchen11,12. Sie wurden auch verwendet, um die Geweberegeneration 9,14,15, Genwege und Signalwege14,16, den Stoffwechsel17, Mikrobiota-Studien18 usw. zu verstehen. Zebrafische sind, ähnlich wie andere Teleosten, auch sehr empfindlich gegenüber Umweltfaktoren wie Schadstoffen und Toxinen 19,20,21,22. Daher werden Fischschuppen verwendet, um die Exposition gegenüber Toxinen in Fischpopulationen zu untersuchen. Diese Eigenschaften machen Waagen zu einem hervorragenden Modell, um den Schülern die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf lebende Organismen näher zu bringen. Darüber hinaus könnten Schuppen von transgenen Zebrafischlinien wie Tg(osterix:mCherry) und Tg(runx2a:GFP)) den Experimenten der Studenten eine weitere Komplexitätsstufe hinzufügen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Forscher mit Hilfe von Zebrafischschuppen Experimente entwerfen und durchführen können, um verschiedene Aspekte der Biologie zu untersuchen, von zellulären Mechanismen bis hin zu Umweltveränderungen. Zebrafische sind auch eine wertvolle Ressource in der Hochschulbildung, da sie praktische Erfahrungen in der Versuchsplanung, Datenerfassung und -analyse vermitteln können. Zebrafische können auch in fortgeschrittenen Kursen und forschungsorientierten Programmen eingesetzt werden, um bestimmte Interessengebiete zu erkunden. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Verwendung von Zebrafischschuppen in Forschungs- und Lernumgebungen im Klassenzimmer beschrieben.

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Protokolle folgen den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und wurden jährlich vom Tierpflegeausschuss der Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University unter den Protokollnummern 20-14 und 21-12 genehmigt. Vor der Durchführung dieses Protokolls müssen die Anwender sicherstellen, dass die Richtlinien des Bundes und der Länder zur Verwendung von Tieren in Forschung und Lehre befolgt werden23. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Reagenzien für die Schuppenkultur

  1. DMEM-Medium mit HEPES (10 g DMEM-Pulver, 5,95 g HEPES, in 1 l destilliertem Wasser oder dH2O, pH-Wert: 6,91) herstellen, aliquotieren und bei 4 °C lagern.
  2. Bereiten Sie das Nährmedium vor - Arbeitslösung (88 % DMEM-Medium mit HEPES, 10 % fötales Rinderserum und 2 % Penicillin-Streptomycin [5000 Einheiten Penicillin und 5 mg Streptomycin pro ml], angepasst an das am Tag der Durchführung des Experiments erforderliche Volumen.
    HINWEIS: Die Arbeitslösung muss täglich frisch zubereitet werden und kann nicht gelagert werden. Der Nährboden muss bis zur Verwendung kalt (bei 4 °C oder auf Eis) aufbewahrt werden.
  3. Aliquotieren Sie die einarbeitende Lösung des Nährmediums in die Behälter, in denen der Versuch durchgeführt wird. In diesem Fall wurden 0,2 mL-Röhrchen oder eine 96-Well-Platte verwendet. Bewahren Sie diese Aliquots bis zur Verwendung auf Eis auf.
    HINWEIS: Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden und darf nicht länger als 1 Tag gelagert werden. In Tabelle 1 finden Sie alle Reagenzien.

2. Entfernen von Schuppen von lebenden Fischen

  1. Bereiten Sie für den Zebrafisch einen Behälter oder ein Becken mit einem Wasservolumen von ca. 2 L für 4-5 erwachsene Fische vor.
    HINWEIS: Die typischen Parameter des Wassers, die für Zebrafische geeignet sind, sind pH 7,5, Temperatur 28,5 °C, Leitfähigkeit 640-781 μS und ein 12-12-stündiger Dunkel-Licht-Zyklus. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur im Tank konstant gehalten wird.
  2. Fangen Sie mit einem Fischernetz 4-5 erwachsene Zebrafische und setzen Sie sie in das oben vorbereitete Zebrafisch-Auffangbecken.
  3. Bereiten Sie einen Behälter mit mindestens 60 ml Wasser vor, in dem der Fisch betäubt wird.
    HINWEIS: Der Fisch muss sich im Behälter bewegen können und tief genug sein, um ein Herausspringen zu verhindern. Dieser Behälter sollte gepuffertes 0,01 % Tricain-Methansulfonat (MS222) enthalten, das aus Zebrafischwasser bestehen sollte (Verdünnen Sie 0,1 % MS222, das mit 0,3 g MS222 hergestellt wird, 615 μl 1 M NaOH in 300 mL Zebrafischwassersystem, zehnmal).
    ACHTUNG: Personen, die diese Experimente durchführen, müssen die Genehmigung des institutionellen Tierethikrats haben, um Zebrafische zu fangen, zu betäuben und zu behandeln. In ähnlicher Weise handelt es sich bei dem verwendeten Anästhetikum um eine niedrige Konzentration von Tricain-Methansulfonat (MS222), einer Chemikalie, die häufig in der Fischbiologie verwendet wird, aber eine angemessene Handhabung erfordert, wie z. B. geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Einweg-Nitrilhandschuhe, Schutzbrille/Spritzschutzbrille und Laborkittel (Weitere Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt von MS222).
  4. Bereiten Sie einen Auffangbehälter mit den gleichen Spezifikationen wie zuvor in Schritt 1 (mindestens 2 l Wasser) vor, in den der Fisch nach der Entfernung der Schuppen gesetzt wird. Dieser Behälter sollte genügend Platz und die richtigen Wasserparameter haben, wie oben erwähnt.
  5. Setzen Sie einen einzelnen erwachsenen Zebrafisch vorsichtig mit einem Netz in den Behälter mit 0,01 % MS222 um. Warten Sie, bis der Fisch völlig unbeweglich ist und nur minimale operative Bewegungen aufweist (dies dauert in der Regel weniger als 10 Minuten).
    HINWEIS: Dieser gesamte Schritt wird Fisch für Fisch ausgeführt. Betäuben Sie den nächsten Fisch erst, wenn die Schuppen erfolgreich von dem Fisch entfernt wurden, der gehandhabt wird, und bis dieser Fisch in den Auffangbehälter umgefüllt wurde.
  6. Legen Sie den erwachsenen Zebrafisch einzeln auf eine umgedrehte Petrischale, die mit einem feuchten Papiertuch ausgelegt ist.
  7. Entnehmen Sie unter einem Präparierstereomikroskop und mit einer feinen Pinzette maximal 10-12 Schuppen von einem einzelnen Fisch. Die Schuppen werden aus dem lateralen Bereich des Fisches entfernt, wo die Schuppen größer sind und im Vergleich zu den anderen Körperteilen eine konstantere Größe haben (Abbildung 2). Beide Seiten des Fisches können verwendet werden.
    1. Entfernen Sie die Schuppen nacheinander, indem Sie vorsichtig in die natürliche Richtung der Schuppe ziehen (d. h. in Richtung von anterior nach posterior). Dies sollte so schnell wie möglich geschehen.
  8. Jede einzelne Waage wird in ein separates 0,2-ml-Röhrchen gegeben, das die in Schritt 1.1 hergestellte Lösung für das Zinnkulturmedium enthält, um eine Zersetzung der Waagen zu verhindern. Alternativ kann eine 96-Well-Platte verwendet werden.
    HINWEIS: Die Isolierung einzelner Skalen in separaten Röhrchen oder Vertiefungen verhindert das Zusammenkleben der Schuppen und ermöglicht die Verfolgung einzelner Skalen, die für mehrere Experimente benötigt werden können.
  9. Wenn für das spezifische Experiment eine Skalenbehandlung erforderlich ist, wenden Sie diese in diesem Schritt an. Beispiele für einige Protokolle finden Sie in den Schritten 4 und 5.
  10. Legen Sie die Röhrchen mit der Waage in einen Inkubator bei 28 °C. Das Kulturmedium sollte alle 24 Stunden gewechselt werden (mit der Kulturmedium-Arbeitslösung). Für die hier skizzierten Experimente wurde ein Nicht-CO2 -Inkubator verwendet.
  11. Bringen Sie den Zebrafisch nach dem Entfernen der Schuppen vorsichtig in das Auffangbecken zurück und überwachen Sie, bis die Bewegung wieder aufgenommen wird. Eine Pipette oder ein Belüftungsstein wird verwendet, um Luft in den Tank zu bringen und so die Genesung zu beschleunigen.
  12. Sobald die Bewegung wiederhergestellt ist, setzen Sie den Zebrafisch in ein normales Aufzuchtbecken zurück. Denken Sie daran, die Fische, die verwendet wurden, getrennt von allen anderen Fischen zu halten, damit sie sich getrennt erholen können und um zu verfolgen, welche Fische ihre Schuppen aktiv regenerieren.
  13. Warten Sie ~2 Wochen, bevor Sie die Schuppenentfernung von denselben Fischen wiederholen. Dies gibt ihnen Zeit, ihre Schuppen auf natürliche Weise zu regenerieren.

3. Fixierung der Skalen

  1. Waschen Sie die Waage dreimal mit 200 μl 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die aus 10x PBS hergestellt wurde (für 1 l 80 g NaCl, 2 g KCl und 11,2 g Na2HPO4 hinzufügen, dH2O bis 1 l hinzufügen).
  2. Entfernen Sie das 1x PBS und fügen Sie über Nacht bei 4 °C 200 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu. Für 100 ml PFA fügen Sie 4 g Paraformaldehyd und 0,1 g NaOH hinzu und fügen Sie dann 1x PBS bis 100 ml hinzu. Auf einer auf schwache Hitze eingestellten Platte mischen und rühren, bis die Lösung klar ist, dann die Lösung abkühlen lassen und den pH-Wert auf 7,4 stabilisieren. Bei -20 °C lagern. Näheres siehe Zusatzdatei 1 (Tabelle 1).
  3. Waschen Sie die Waage nach der Fixierung dreimal mit 200 μL 1x PBS. Lagern Sie die Waage bei 4 °C.
    ACHTUNG: PFA ist schädlich. Weitere Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt. Alle diese Prozesse erfordern eine ordnungsgemäße Handhabung, wie z. B. geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Einweghandschuhe aus Nitril, Schutzbrille/Spritzschutzbrille und einen Laborkittel.

4. Homöostase der Knochen

HINWEIS: Im Folgenden werden zwei Verfahren zur Knochenhomöostase beschrieben. Die Färbung mit tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) und alkalischem Phosphat (AP) wird in der Regel zur Identifizierung aktiver Osteoklasten bzw. Osteoblasten verwendet. Osteoklasten resorbieren die Knochenmatrix, während Osteoblasten die Knochenmatrix ablagern. AP ist das Hauptenzym, das von Osteoblasten während der Knochenbildung freigesetzt wird, während TRAP von Osteoklasten in den sauren Raum zwischen Osteoklasten und Knochenmatrix sezerniert wird und den Knochenabbau und die Knochenresorption unterstützt 24,25,26. Dieses Protokoll ist auch im Zebrafish Information Network27verfügbar und wurde zuvorveröffentlicht 28. Die alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das von mehreren Zelltypen als Teil des Stoffwechselprozesses produziert wird. Dieser Prozess ist nicht vollständig spezifisch für Osteoblasten, aber im Knochengewebe wird er als Marker für die Funktion von Osteoblasten verwendet.

  1. Färbung der tartratresistenten sauren Phosphatase (TRAP)
    1. Legen Sie jede feste Waage in ein 0,2-ml-Röhrchen oder eine 96-Well-Platte mit 200 μl dH2O. Waschen Sie die Waage, indem Sie dreimal 15 Minuten lang etwa 150 μl dH2O hinzufügen und entfernen. Einzelheiten finden Sie in der Zusatzdatei 1 (Tabelle 2).
    2. Entfernen Sie die Schuppen aus dem 0,2-ml-Röhrchen oder der Vertiefung und legen Sie sie in ein neues Röhrchen, das 200 μl 50 mM Tartratpuffer enthält. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
      1. Für 100 mM Tartratpuffer bereiten Sie einen Glasbehälter vor, fügen Sie 2,3 g Weinsäure hinzu und mischen Sie es mit 0,2 M Acetatpuffer (pH 5,5) bis 100 ml Lösung. Gut umrühren und bei 4 °C lagern. Zur Herstellung von 50 mM Tartratpuffer werden gleiche Volumina dH2O und 100 mM Tartratpuffer zugegeben. Näheres siehe Zusatzdatei 1 (Tabelle 3 und Tabelle 4).
    3. Entfernen Sie den Tartratpuffer aus dem Röhrchen und fügen Sie 200 μl TRAP-Substratlösung hinzu. Inkubieren Sie die Proben 1 h lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Dunkeln bleiben.
      1. Bereiten Sie einen dunklen Glasbehälter vor und fügen Sie 30 ml 100 mM Tartratpuffer, 1 ml hexazotisierte PRS (Pararosanilinhydrochloridlösung) und 2 ml Enzymsubstratlösung hinzu. Gut umrühren.
        HINWEIS: Diese Lösung kann nicht gelagert werden. Bewahren Sie es während des Gebrauchs bei Raumtemperatur im Dunkeln auf. Für die Lösungen, die zur Herstellung der TRAP-Substratlösung benötigt werden, siehe Zusatzdatei 1 (Tabellen 5-9).
    4. Entfernen Sie die TRAP-Substratlösung und waschen Sie die Schuppen, indem Sie dreimal 150 μl dH2O für 15 min hinzufügen und entfernen.
    5. Nehmen Sie die Schuppen aus der Tube und legen Sie sie in ein neues Röhrchen oder eine Vertiefung mit 200 μl 80 % Glycerin (für 100 mL mischen Sie 80 mL Glycerin mit 20 mL dH2O), die in Aluminiumfolie eingewickelt sind, um ein Ausbleichen zu vermeiden, und lagern Sie sie bei 4 °C.
    6. Um die Schuppen unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, verwenden Sie eine Vertiefung oder einen konkaven Objektträger.
  2. Färbung von alkalischem Phosphat (AP)
    1. Legen Sie jede fixierte Skala in ein 0,2-ml-Röhrchen oder eine 96-Well-Platte mit 200 μl dH2O und waschen Sie sie, indem Sie 15 Minuten lang dreimal etwa 150 μl dH2O hinzufügen und entfernen. Einzelheiten finden Sie in der Zusatzdatei 1 (Tabelle 2).
    2. Nehmen Sie die Schuppen aus den 0,2-ml-Röhrchen oder -Vertiefungen und geben Sie sie in ein neues Röhrchen, das 200 μl Tris-Maleat-Puffer enthält, und inkubieren Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur.
      1. Für diesen Puffer bereiten Sie einen Glasbehälter vor und fügen Sie 0,605 g Trispuffer und 0,55 g Maleinsäure hinzu. dH2O bis 25 mL zugeben und gut umrühren. Stabilisieren Sie sich auf pH 8,3. Bei 4 °C lagern. Näheres siehe Zusatzdatei 1 (Tabelle 10).
    3. Entfernen Sie den Tris-Maleat-Puffer aus dem Röhrchen und fügen Sie 200 μl AP-Substratlösung hinzu. Inkubieren Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Dunkeln bleiben.
      1. Bereiten Sie für diese Lösung einen dunklen Glasbehälter vor, fügen Sie 8 mg Diazoniumsalz hinzu und mischen Sie es mit 0,1 ml Nathol-AS-TR-phosphat in N,N-Dimethylformamid und 10 ml Trismaleatpuffer (pH 8,3) und rühren Sie gut um. Bereiten Sie diese Lösung frisch zu. Näheres siehe Zusatzdatei 1 (Tabelle 11).
    4. Entfernen Sie die AP-Substratlösung und waschen Sie die Schuppen, indem Sie dreimal 15 Minuten lang 200 μl dH2O hinzufügen und entfernen.
    5. Nehmen Sie die Schuppen aus der Tube und legen Sie sie in ein neues Röhrchen oder eine Vertiefung mit 200 μl 80% Glycerin, die in Aluminiumfolie eingewickelt sind, um ein Ausbleichen zu vermeiden. Bei 4 °C lagern.
    6. Um die Skalen mit einem Mikroskop zu visualisieren, platzieren Sie die Schuppen auf einem konkaven oder vertieften Objektträger.
      ACHTUNG: Die meisten Reagenzien, die bei der TRAP- und AP-Färbung verwendet werden, können schädlich sein. Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt der jeweiligen Chemikalie. Alle diese Verfahren erfordern eine ordnungsgemäße Handhabung, wie z. B. geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Einweg-Nitrilhandschuhe, Schutzbrille/Schutzbrille und einen Laborkittel.

5. Visualisierung der Zelldynamik in Zebrafischschuppen

HINWEIS: Eine Reihe von Färbemethoden kann verwendet werden, um Unterschiede zwischen Skalen zu visualisieren und Zellen innerhalb der Skala zu markieren (Abbildung 3B). Zum Beispiel werden im Folgenden Methoden zur Färbung von Zellkernen und Lysosomen in den Zellen der Skala skizziert.

  1. DAPI-Färbung zur Visualisierung von Zellkernen
    HINWEIS: DAPI wird verwendet, um die Zellkerne aller Zellen durch Markierung der DNA zu markieren. DAPI ist ein fluoreszierender Marker, der stark an Regionen bindet, die in DNA-Sequenzen mit Adenin und Thymin angereichert sind.
    1. Stellen Sie vor der Verwendung von DAPI sicher, dass die Schuppen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert sind (Schritt 3). Waschen Sie die Schuppen mit 200 μL 1x PBS für 5 min nach dem Fixieren.
    2. Bereiten Sie eine DAPI-Arbeitslösung in einer Verdünnung von 1:10 wie folgt vor. Mischen Sie 1 μl DAPI mit 9 μl 1x PBS, um ein Gesamtvolumen von 10 μl zu erhalten.
    3. Nachdem Sie die DAPI-Lösung hergestellt haben, verwenden Sie eine Pinzette oder eine Kunststoffpipette, um die Waage auf einen konkaven Objektträger zu setzen, entfernen Sie überschüssiges PBS und fügen Sie etwa 10 μl der vorbereiteten DAPI-Lösung hinzu.
      HINWEIS: DAPI färbt die Skala sofort, so dass sie mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 352-402 nm und einer Emissionswellenlänge von 417-477 nm sichtbar gemacht werden kann. DAPI färbt alle Zellkerne hellblau. Um die gesamte Skala im Sichtfeld zu sehen, wurde das 4x Objektiv verwendet. Einzelne gefärbte Zellkerne sind mit dem 20x-Objektiv sichtbar.
    4. Zählen Sie die Anzahl der DAPI-gefärbten Zellkerne, um die Anzahl der Zellen in der Skala zu bestimmen.
  2. Apoptotische Färbung zur Visualisierung des Zelltods in lebenden Proben
    HINWEIS: Fluoreszierende Färbungen können zur Markierung apoptotischer Zellen verwendet werden. Zum Beispiel ist das hier verwendete Fluoreszenzmarkerprotokoll für saure Umgebungen und kann zur Markierung und Verfolgung von sauren Organellen wie Lysosomen verwendet werden. Eine Zunahme der Anzahl dieser Organellen korreliert mit einem erhöhten Zelltod. Diese Beize sollte auf nicht fixierte Schuppen aufgetragen werden, die entweder frisch gezogen oder bis zu 2 Tage lang kultiviert wurden.
    1. Bereiten Sie eine Lösung des Fluoreszenzflecks für die Apoptose-Verfolgung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, indem Sie das Kulturmedium als Verdünnungsmittel verwenden.
      HINWEIS: Die Konzentration des Fluoreszenzflecks kann sich je nach verwendeter Apoptosemethode drastisch ändern. Genaue Informationen zu den empfohlenen Konzentrationen finden Sie im Handelsprotokoll für den Fleck der Wahl.
    2. Entfernen Sie das Nährmedium vorsichtig aus jedem 0,2-ml-Röhrchen oder aus einer 96-Well-Platte, wenn die Waagen zuvor kultiviert wurden.
    3. Fügen Sie so viel fluoreszierende Färbelösung hinzu, dass die gesamte Skala bedeckt ist (ca. 50 μl).
    4. Decken Sie alle Tuben mit Alufolie ab, um ein Ausbleichen zu vermeiden, und lassen Sie sie 30 Minuten einwirken.
    5. Entfernen Sie die fluoreszierende Färbelösung aus den Röhrchen oder Vertiefungen.
    6. Waschen Sie die Proben, indem Sie 200 μl 1x PBS für 5 Minuten in die Röhrchen oder Vertiefungen geben.
    7. Entfernen Sie das PBS und geben Sie 200 μl 4 % PFA in die Röhrchen oder Vertiefungen, um die Proben 1 h lang bei Raumtemperatur zu fixieren.
    8. Waschen Sie die Proben, indem Sie 200 μL 1x PBS für 5 Minuten in die Röhrchen oder Vertiefungen geben.
    9. Übertragen Sie die Waage in ein neues 0,2-ml-Röhrchen oder eine Vertiefung und fügen Sie 200 μl frisches 1x PBS hinzu. Decken Sie diese Rohre/Vertiefungen mit Alufolie ab, um ein Ausbleichen zu vermeiden. Bei 4 °C lagern.
    10. Um die Skalen mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen, verwenden Sie einen konkaven oder Depressionsobjektträger und den richtigen Filter. Das hier verwendete Fluoreszenzsignal hat ein Anregungs- und Emissionsmaximum von 577-590 nm. Die Fluoreszenzfärbung zeigt apoptotische Zellen, die Lysosomen in Rot enthalten.
    11. Zählen Sie die Anzahl der gefärbten Zellen, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, die sich einer Apoptose unterziehen.
      HINWEIS: Aluminiumfolie wird während des Färbens und Lagerns verwendet, um ein Ausbleichen zu vermeiden. Die Proben können einige Stunden oder sogar Tage im Dunkeln gelagert werden, je nachdem, welcher fluoreszierende Farbstoff verwendet wird. Um fluoreszierende Proben über einen längeren Zeitraum zu lagern, verwenden Sie ein Fixierungs- und Einbettungsprotokoll, das mit dem Fluoreszenzfleck kompatibel ist. Alle Fluoreszenzfärbungen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit mindestens 20-facher Vergrößerung sichtbar gemacht. Der verwendete Filter war wie folgt: für DAPI 417-477 nm; für Apoptose-Tracking 577-590 nm.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kürzlich wurde dieses Skalenkultivierungsprotokoll verwendet, um die Knochenhomöostasezu untersuchen 11. Schuppen können mindestens 2 Tage im Nährmedium überleben. Die Anzahl der apoptotischen Zellen wurde an jedem Kulturtag bis zu einem Maximum von drei Tagen analysiert, indem die markierten Zellen gezählt wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die apoptotischen Zellen am dritten Tag der Kultivierung signifikant zunahmen, was darauf hindeutet, dass die Kulturzeit mit der hier beschriebenen Method...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafischschuppen sind ein leicht zugängliches In-vitro-Modell zur Untersuchung einer Vielzahl verschiedener biologischer Prozesse, die mit einer Kultivierungsmethode und einem Inkubator zur Simulation ihrer natürlichen Umgebung bis zu 2 Tage lang aufrechterhalten werden können11. Die Waagen haben eine regelmäßige und proportionale Verteilung der vorhandenen Zellen, was es den Forschern ermöglicht, Zellen zu betrachten, zu zählen und zu markieren und ein...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken den Mitarbeitern der Mount Saint Vincent University Aquatic Facility und allen Mitgliedern des Franz-Odendaal Bone Development Lab für die notwendige Pflege der Fische. Besonderer Dank geht an Alisha McNeil, Keely A. MacLellan und Shirine Jeradi für die Unterstützung bei der Optimierung einiger Protokolle. Diese Forschung wurde mit Mitteln der Canadian Space Agency (CSA) [19HLSRM01] und des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 mL Röhrchenn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4Für die pH-Stabilisierung und Vorbereitung von PRS
Konkave Objektträgern/an/a
DAPIVectashieldH-1200Für die Visualisierung von Zellkernen
Diazoniumsalz (Fast Blue B)SigmaD9805Für AP-Substratlösung
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Pulver Sigma D5523Für Scale-Kulturmedien 
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (MS222)  Sigma E10521zur Herstellung von 0,1 % MS222
fötalem Rinderserum Sigma F4135Für Scale-Kulturmedien 
Fluoreszenzmikroskopn/an/a
Eisessig Fischer A38 212Für Acetatpuffer
GlycerinVWRBDH1172-4LPFür 80% Glycerin - Lagerwaage
HEPES ThermoFisher 15630106Für Scale-Kulturmedien 
Heizplatten/an/a
KCl SigmaP217-10Zur Herstellung von PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Zur Visualisierung von Lysosomen
MaleinsäureSigmaM0375Für Tris-Maleat-Puffer
Mikropipetten/an/a
N,N-DimethylformamidSigma319937Für AP-Substratlösung
N,N-DimethylformamidSigma319937für Enzymsubstrat
Lösung Na2HPO4 EMDSX0720-1Zur Herstellung von PBS
NaCl Sigma S9888Zur Aufbereitung von PBS
NaNO2SigmaS-2252Für 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881Zur Herstellung von 4 % PFA
NaOH Sigma S5881Zur Kesselsteinfixierung und pH-Stabilisierung
Napthol-AS-TR-phosphatSigmaN6125Für AP-Substratlösung
Napthol-AS-TR-phosphat SigmaN6125für Enzymsubstratlösung
Pararosanilinhydrochlorid SigmaP3750Für PRS
Penicillin-Streptomycin 5000 Einheiten Penicillin und 5mg Streptomyocin/mlThermoFisher 15140122Für Scale-Kulturmedien 
Persönliche Schutzausrüstung (PSA): Einweghandschuhe aus Nitril, Schutzbrille/Spritzschutzbrille und Laborkittel.n/an/a
PFA Sigma P6148Zur Fixierung
Kalkablagerungen Natriumacetat Sigma S2889Für Acetatpuffer
Standard-Verbundmikroskopn/an/a
Rührplatten/an/a
WeinsäureSigmaT6521Für Tartratpuffer
Tris-BaseRoche03 118 142 001Für Tris-Maleat-Puffer 
von

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
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