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Methodenartikel

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

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DOI:

10.3791/66626

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19. April 2024

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1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zusammenfassung

Das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) wird häufig eingesetzt, um den Bottom-up-Aufbau synthetischer Zellen zu erleichtern. Es dient als Wirt für die Kernmaschinerie des Zentralen Dogmas und steht als optimales Chassis für die Integration und Montage verschiedener künstlicher zellulärer Mimikry-Systeme. Trotz seiner häufigen Verwendung bei der Herstellung von synthetischen Zellen bleibt die Etablierung eines maßgeschneiderten und robusten CFPS-Systems für eine bestimmte Anwendung eine nicht triviale Herausforderung. In diesem Methodenpapier stellen wir ein umfassendes Protokoll für das CFPS-System vor, das routinemäßig beim Bau synthetischer Zellen eingesetzt wird. Dieses Protokoll umfasst Schlüsselphasen bei der Vorbereitung des CFPS-Systems, einschließlich des Zellextrakts, der Template-Vorbereitung und der routinemäßigen Expressionsoptimierung unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporterproteins. Darüber hinaus zeigen wir repräsentative Ergebnisse, indem wir das CFPS-System in verschiedene Mikrokompartimente einkapseln, wie z.B. Monolayer-Tröpfchen, Doppelemulsionsvesikel und Kammern, die sich auf gestützten Lipiddoppelschichten befinden. Schließlich erläutern wir die kritischen Schritte und Bedingungen, die für den erfolgreichen Aufbau dieser CFPS-Systeme in verschiedenen Umgebungen erforderlich sind. Wir gehen davon aus, dass unser Ansatz die Etablierung guter Arbeitspraktiken in verschiedenen Labors innerhalb der ständig wachsenden Gemeinschaft synthetischer Zellen erleichtern und damit den Fortschritt auf dem Gebiet der Entwicklung synthetischer Zellen beschleunigen wird.

Einleitung

Die Synthese synthetischer oder künstlicher Zellen hat sich zu einem sehr prominenten Bereich der interdisziplinären Forschung entwickelt, der erhebliches Interesse von Wissenschaftlern aus allen Bereichen der synthetischen Biologie, Chemie und Biophysik auf sich zieht. Die Wissenschaftler eint das gemeinsame Ziel, eine minimale lebende Zelle zu konstruieren 1,2,3. Das schnelle Wachstum dieses Gebiets ging einher mit bedeutenden Fortschritten bei kritischen Technologien, wie z. B. der rekombinanten DNA-Manipulation4, biomimetischen Materialien5 und Mikrofabrikationstechniken für die Kompartimentierung6, einschließlich der Methode der zellfreien Proteinsynthese (CFPS)7. CFPS-Systeme umfassen die wesentliche zelluläre Maschinerie für die Transkription und Translation und bilden den grundlegenden Rahmen für die Entwicklung und Integration multifunktionaler künstlicher Zellen.

Obwohl CFPS-Techniken häufig bei der Assemblierung von synthetischen Zellen eingesetzt werden, bleibt die Entwicklung eines robusten und maßgeschneiderten CFPS-Systems für die Assemblierung verschiedener synthetischer Zellsysteme eine komplexe Herausforderung. Derzeit stehen zahlreiche CFPS-Systeme zur Verfügung, die sowohl von Prokaryoten als auch von Eukaryoten-Modellorganismenabgeleitet sind 8, die jeweils auf bestimmte Anwendungen in der synthetischen Zellsynthese spezialisiert sind. Abgesehen von ihrer zentralen Rolle bei der Transkription und Translation unterscheiden sich CFPS-Systeme in ihren Hauptkomponenten und den damit verbundenen Präparationsverfahren. Diese Variationen, zu denen Unterschiede in Zellextrakten, RNA-Polymerasen, Template-Präparationsmethoden und Pufferzusammensetzungen gehören, sind größtenteils auf die unterschiedlichen Entwicklungspfade zurückzuführen, die von Forschungsgruppen verfolgt werden, die ihre Systeme intensiv für eine maximale Proteinausbeute optimiert haben.

Unter den verschiedenen Komponenten des CFPS-Systems ist der Zellextrakt ein kritischer enzymatischer Pool für die Transkription und Translation und damit eine Schlüsseldeterminante für die CFPS-Leistung9. Das auf Escherichia coli (E. coli) basierende CFPS ist aufgrund seines Status als der am besten verstandene prokaryotische Organismus das am häufigsten verwendete System. Darüber hinaus hat Uedas Forschungsgruppe ein vollständig rekonstituiertes CFPS-System aus einzeln gereinigten Proteinen und Ribosomen entwickelt, bekannt als PURE10, das sich besonders für Anwendungen eignet, die einen klaren Hintergrund erfordern. Heute haben sich sogar E. coli-basierte CFPS-Systeme diversifiziert, insbesondere in Bezug auf die Ausgangsstämme für das extrac11 und die Präparationsmethoden12,13, die RNA-Polymerase14,15, die Energiequellen16,17 und die Puffersysteme18,19. Zu den am häufigsten verwendeten Stämmen gehören neben ihren gentechnisch veränderten Pendants K12- und B-Stammderivate wie A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 und Rossetta223.

Ursprünglich wurden E. coli-Stämme mit reduzierten RNase- und Proteaseaktivitäten ausgewählt, um die mRNA-Stabilität und die Stabilität neu synthetisierter rekombinanter Proteine zu verbessern, was zu einer erhöhten Endproteinausbeute führte24. Anschließend wurden E. coli-Extrakte entwickelt, um spezifische posttranslationale Modifikationen, einschließlich Glykosylierung25, Phosphorylierung26 und Lipidierung27, zu erleichtern, um die oben genannten posttranslationalen Modifikationen zu erreichen. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Additiven wie molekulare Chaperone28 und chemische Stabilisatoren integriert, um die Faltung von Zielproteinen zu unterstützen und so zur Diversifizierung der CFPS-Systeme beizutragen. Die für ihre hohe Prozessivität bekannte Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase wird überwiegend für die Transkription eingesetzt, obwohl auch andere Polymerasen wie SP629 verwendet wurden. Die endogene RNA-Polymerase von E. coli wurde für das Prototyping genetischer Schaltkreise unter Nutzung der Sigma-Faktoren30 angepasst. Schließlich wurden eine Vielzahl von Energievorläufern31, 32 und 33 sowie verschiedene Salze und Pufferkomponenten19, 34 und 35 systematisch optimiert, um die Produktivität zu steigern.

Neben dem CFPS-System selbst sind auch die Verkapselungsmethoden sowie die Kompartimentierungsmaterialien für den erfolgreichen Aufbau der synthetischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Zu den verschiedenen Systemen, die entwickelt wurden, um die CFPS-Reaktion erfolgreich zu verkapseln, gehören tensidstabilisierte Wasser-/Öltröpfchen, Lipide/Polymere und ihre hybriden unilamellären Vesikel (mit Durchmessern von 50 nm bis zu mehreren μm) sowie planar gestützte Lipiddoppelschichten. Aufgrund des komplexierten Molekülgehalts des CFPS-Systems hängt die Erfolgsrate der Verkapselung jedoch von spezifischen Fällen ab, insbesondere bei der Bildung von Vesikel. Um die Erfolgsrate und Effizienz der Verkapselung von CFPS zu verbessern, wurden verschiedene Mikrofluid-Chips entwickelt, die die Bildung von Tröpfchen und Vesikeln erleichtern36. Dennoch müssen weitere Chips und Geräte etabliert werden.

Dieses Protokoll beschreibt ein E. coli CFPS-System unter Verwendung des BL21(DE3)-Stammes, der ein häufig eingesetzter Wirt für die rekombinante Proteinproduktion ist. Das Protokoll umfasst eine detaillierte Darstellung der Zellextraktvorbereitung, der Template-Vorbereitung und der Standardexpressionsoptimierung unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporterproteins. Darüber hinaus präsentieren wir beispielhafte Ergebnisse, die durch die Verkapselung des CFPS-Systems in verschiedenen Mikrokompartimenten erzielt wurden, einschließlich Monolayer-Tröpfchen, Doppelemulsionsvesikeln und Kammern, die sich auf gestützten Lipiddoppelschichten befinden. Schließlich erläutern wir die zentralen Verfahrenselemente und die erforderlichen Bedingungen, die für die erfolgreiche Einrichtung dieser GFPS-Systeme in unterschiedlichen Umweltkontexten unerlässlich sind.

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Protokoll

1. Zubereitung des Extrakts

  1. Den E. coli BL21 (DE3)-Stamm aus einem Glycerinstamm auf eine Luria Bertani (LB)-Agarplatte streichen und mindestens 15 Stunden bei 37 °C inkubieren.
  2. Bereiten Sie eine Vorkultur über Nacht vor, indem Sie ein einzelnes Volk von der frisch vorbereiteten LB-Platte in einen 50-ml-Kolben mit Luria Bertani (LB) Medium inokulieren.
  3. 5 ml Vorkultur werden in 500 ml 2xYTPG-Medium in einem 3-Liter-Erlenmeyerkolben mit Schikane inokuliert. Bauen Sie sie bei 37 °C unter kräftigem Schütteln (zwischen 220 U/min und 250 U/min) an und ernten Sie die Zellen, wenn sie die mittlere Log-Phase (OD600 ~ 3) erreichen. Anschließend die Zellkulturen für 10 min in kaltes Eiswasser legen und bei 8.000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt kann die Glukose im 2xYTPG-Medium für bestimmte Anwendungen weggelassenwerden 9,12.
  4. Die resultierenden Zellpellets werden in 35 ml vorgekühltem S30-Puffer A resuspendiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  5. Wiederholen Sie Schritt 1.4 zweimal.
    HINWEIS: Die Zellpellets können bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
  6. Resuspendieren Sie die endgültigen Pellets in S30-Puffer B (z. B. verwenden Sie 1,1 ml S30-Puffer B pro 1 g Zellpellet) und brechen Sie die Zellen durch einen Durchgang durch French Press bei 17.000 psi auf.
    1. Befolgen Sie für die Verwendung der French Press die Bedienungsanleitung und übertragen Sie die Zellensuspension in die French Press Metallzerkleinerungskammer, wobei Sie sicherstellen, dass alle Komponenten montiert und das Bodenventil der Spaltkammer geschlossen ist.
    2. Übertragen Sie die montierte Sprengkammer auf die hydraulische Plattform und sichern Sie die Sicherheitsverriegelung.
    3. Schalten Sie die Hydraulikpumpe ein und starten Sie die Störung.
    4. Steuern Sie das Auslassventil, damit die Zellsuspension aus dem Auslassrohr in ein neues 50-ml-Röhrchen fließen kann. Passen Sie die Strömungsgeschwindigkeit an, um eine effiziente Unterbrechung zu gewährleisten, idealerweise Tropfen für Tropfen. Halten Sie den Druck über der unteren Grenze von 15.000 psi.
  7. Das resultierende Lysat wird bei 30.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Wiederholen Sie die Zentrifugation einmal und sammeln Sie den Überstand. 0,3 Volumen Vorinkubationspuffer in den gesammelten Überstand geben und unter leichtem Schütteln bei 37 °C für 80 min inkubieren.
    HINWEIS: Die Verwendung von Vorinkubationspuffer könnte die Endausbeute erhöhen, obwohl berichtet wurde, dass ein leerer Abfluss (ohne Vorinkubationspuffer) auch die Effizienz37,38 verbessern könnte, die vom entsprechenden Ausgangsstamm abhängt.
  8. Das resultierende Abflussgemisch wird 2 h lang gegen 2 l S30-Puffer C dialysiert, der Dialysepuffer wird einmal gegen 2 l frischer S30-Puffer C ausgetauscht und über Nacht bei 4 °C39 dialysiert.
    HINWEIS: Der zweite Schritt der Nachtdialyse kann auf ca. 3 h verkürzt werden.
  9. Entnehmen Sie die dialysierte Probe und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 30.000 × g bei 4 °C. Der Überstand und das Aliquot werden in geeigneten Volumina aufgefangen und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
    HINWEIS: Die gefrorene Probe kann bei -80 °C mindestens 6 Monate bis 1 Jahr gelagert werden, ohne dass die Effizienz beeinträchtigt wird.

2. T7-RNA-Polymerase

  1. Transformieren Sie das pAR1219-Plasmid in BL21(DE3)-Stern-E . coli-kompetente Zellen40.
  2. Impfen Sie 10 ml einer Übernachtkultur in 1 l LB-Medium (mit 100 μg/ml Ampicillin). Wachsen Sie die Zellen bei 37 °C, bis OD600 0,6-0,8 erreicht.
  3. Beginnen Sie die Induktion, indem Sie eine Endkonzentration von 1 mM IPTG hinzufügen. Die Zellen weitere 5 h induzieren und durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min bei 4 °C ernten. Lagern Sie die Zellpellets bis zu mehreren Wochen bei -80 °C.
  4. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 30 mL T7-Puffer A und brechen Sie die Zellen durch einen Durchgang durch die French Press bei 15.000 psi auf. Entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 °C.
  5. Streptomycinsulfat tropfenweise in den Überstand aus dem vorherigen Schritt geben, bis eine Endkonzentration von 4 % (w/v) erreicht wird. Nach einer kurzen Inkubation auf Eis bei 20.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  6. Der Überstand wird durch eine 0,45 μm Filtermembran filtriert und die filtrierte Probe über ein automatisiertes Flüssigkeitschromatographensystem auf eine Säule mit starkem Anionenaustauscher (Säulenvolumen von 40 mL) geladen, die mit 10 Säulenvolumina T7 Puffer B prääquilibriert wurde.
  7. Waschen Sie die beladene Säule mit 50 Säulenvolumina T7 Puffer B und eluieren Sie die Probe mit 10 Säulenvolumina mit T7 Puffer C Gemischen mit niedrigem Salzgehalt (50 mM NaCl) und hohem Salzgehalt (500 mM), wobei ein linearer Konzentrationsgradient von NaCl von 50 bis 500 mM bei einer Flussrate von ~3 mL/min41 hergestellt wird.
  8. Sammeln Sie die Peak-Fraktionen und analysieren Sie sie mit SDS-PAGE.
    HINWEIS: Die T7-Polymerase weist bei ~100 kDa eine vorherrschende Bande auf, während auf dem SDS-PAGE-Gel immer noch erhebliche Mengen an Verunreinigungen vorhanden sind.
  9. Die Fraktionen, die T7-Polymerase enthalten, werden gepoolt und über Nacht gegen 2 l T7-Puffer C dialysiert.
  10. Fügen Sie Glycerin hinzu, um eine Endkonzentration von 10 % zu erreichen, und konzentrieren Sie das resultierende Gemisch durch Ultrafiltration auf eine Endkonzentration von 3-4 mg/ml42.
    HINWEIS: Wenn während des Konzentrationsprozesses eine Ausfällung auftritt, stoppen Sie sofort und entfernen Sie die Ausfällungen durch Zentrifugation.
  11. Stellen Sie die Glycerinkonzentration auf 50% ein. Aliquotieren und schockfrosten der Probe mit flüssigem Stickstoff. Bei -80 °C für einen längeren Zeitraum lagern.
    HINWEIS: Ein kleines Aliquot kann auch mindestens 1 Monat lang bei -20 °C gelagert werden, ohne dass der Wirkungsgrad beeinträchtigt wird.

3. Vorbereitung des Puffers

  1. Bereiten Sie die Puffer wie in Tabelle 1 angegeben einen Tag vor der Anwendung vor.

4. Vorlagendesign und -vorbereitung

  1. Klonieren Sie das interessierende Gen in einen T7-Promotor-basierten Vektor oder generieren Sie ein lineares PCR-Produkt, das das interessierende Gen enthält.
    HINWEIS: Weitere Informationen zu den Konstruktionsprinzipien finden Sie im Abschnitt "Diskussionen".
  2. Bereiten Sie das Plasmid aus einer Übernachtkultur mit einem Plasmid-Extraktionskit vor.
    HINWEIS: Wir empfehlen die Auswahl eines Plasmid-Kits, das einen Isopropanol-Fällungsschritt umfasst, gefolgt von einem Waschverfahren mit 70 % Ethanol.
  3. Die getrocknete DNA wird in einem kleinen Volumen Reinstwasser auf eine Konzentration zwischen 200 μg/ml und 500 μg/ml aufgelöst, die mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer bestimmt wird.
  4. Optional: Direkte Expression von Proteinen aus linearen PCR-Produkten.
    HINWEIS: In diesem Fall ist ein PCR-Aufreinigungsschritt erforderlich.

5. Optimierung von Mg2+ und K+

  1. Bereiten Sie einen Mastermix für das Mg2+-Konzentrationsscreening vor, wie in Tabelle 2 angegeben, oder für das K+-Konzentrationsscreening, wie in Tabelle 3 angegeben.
  2. Übertragen Sie den Mastermix in einzelne Mikrofugenröhrchen oder eine V-förmige 96-Well-Platte.
  3. Pipettieren Sie das genaue Volumen der Mg2+ - oder K+ -Stammlösungen in einzelne Mikrofuge-Röhrchen oder die V-förmige 96-Well-Platte und schließen Sie die CFPS-Reaktionen mit Reinstwasser ab. Inkubieren Sie die Reaktionen mindestens 2 Stunden lang.
    HINWEIS: Wenn Sie eine V-förmige 96-Well-Platte verwenden, versiegeln Sie die Platte mit einer Kunststoffabdeckung, um eine Verdunstung zu verhindern.
  4. 2 μl des Reaktionsgemisches werden entnommen und in eine schwarze 96-Well-Platte für Fluoreszenzmessungen mit einem Plattenlesegerät überführt.
    HINWEIS: Wir verwenden einen fluoreszierenden Plattenleser mit folgendem Aufbau: Anregung/Emission: 485/528, Verstärkung: 50, Lesehöhe: 7,00 mm. Man müsste jedoch seinen Plattenleser so abstimmen, dass eine spezifische Kalibrierungskurve mit gereinigten fluoreszierenden Proteinen erstellt wird.

6. Verkapselung

  1. Tröpfchen
    1. Ein tensidhaltiges fluoriertes Öl (2% PFPE-PEG in HFE7500) oder eine Lipid-Mineralöl-Lösung durch Auflösen von Lipid in Mineralöl herstellen (siehe Schritt 6.2.1)
    2. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 100 μl CFPS-Reaktion vor, indem Sie die entsprechenden Reagenzien 2 bis 18 aus Tabelle 4 kombinieren. Geben Sie die CFPS-Reaktion auf 500 μl des zuvor vorbereiteten Öls in ein 1,5-ml-Röhrchen und reiben Sie das Röhrchen dann 50x kräftig auf dem Röhrchengestell, um feine Tröpfchen (Wasser-in-Öl) zu bilden. Das Röhrchen wird bei 30 °C inkubiert, um die Reaktion durchzuführen.
      ANMERKUNG: Einfache Mikrofluidik-Chips könnten auch verwendet werden, um homogene Tröpfchen zu erzeugen43.
  2. Riesige unilamelläre Vesikel (GUVs)
    1. Zubereitung der Lipid-Mineralöl-Lösung
      1. Geben Sie 57 μl Chloroform in ein 4-ml-Glasfläschchen und fügen Sie dann 18 μl 25 mg/ml 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycerol-3-phosphocholin (POPC)-Lipide hinzu, um die Chloroform-Lipidlösung zu bilden, wobei eine Endkonzentration von 8 mM erreicht wird (verwenden Sie andere Lipide mit ähnlichen Endkonzentrationen).
        HINWEIS: Dieser Mischschritt diente dazu, eine homogene Mischung der verschiedenen Lipide zu gewährleisten.
      2. Das Chloroform wird 15 min lang unter einem Argonstrom verdampft und anschließend 1 h lang unter Vakuum weiter verdampft.
      3. Die entstehenden trockenen Lipide werden in 1.500 μl Mineralöl aufgelöst, bis eine Endkonzentration von 400 μM erreicht ist. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
    2. Bildung einer Grenzflächenlipidschicht
      1. Geben Sie 500 μl der äußeren Lösung (siehe Tabelle 5) in ein 1,5-ml-Röhrchen und schichten Sie langsam 250 μl Lipid-Mineralöl-Lösung auf die äußere Lösung. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um eine stabile Grenzflächenlipidschicht zu bilden.
    3. Herstellung der inneren Lösung
      1. Mischen Sie alle Reagenzien in Tabelle 6 , um die Preinner-Lösung zu bilden, und bewahren Sie sie bis zur Verwendung auf Eis auf. Vervollständigen Sie die innere Lösung, indem Sie T7RNAP, S30-Extrakt und DNA-Template als in Tabelle 4 aufgeführte Reagenzien 16-18 in die vorinnere Lösung geben.
        HINWEIS: Eine Erhöhung der verkapselten Saccharosekonzentration über 250 mM kann die zellfreie Translation hemmen44.
    4. Bildung von GUVs
      1. Geben Sie 50 μl innere Lösung in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit 500 μl Lipid-Mineralöl, pipettieren Sie schnell auf und ab und wirbeln Sie kräftig auf.
      2. Lassen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis und geben Sie langsam 20 μl des Emulsionsgemisches an die Oberseite der Ölphase im 1,5 ml-Röhrchen aus Schritt 6.2.2.
      3. Bei 800 × g zentrifugieren (eine Zentrifugationsgeschwindigkeit von 100 × g bis 1000 × g verwenden) für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und die Bildung von GUVs am Boden des Röhrchens beobachten.
        HINWEIS: Es kann eine höhere spezifische Zentrifugationsgeschwindigkeit verwendet werden; man würde jedoch davon ausgehen, dass die Zentrifugationsgeschwindigkeit die Größe der gebildeten GUVs45 beeinflussen könnte.
      4. Entfernen Sie die obere Ölphase.
      5. Aspirieren Sie vorsichtig 30 μl GUVs am Boden des Röhrchens. Die gesammelten GUVs werden bei 30 °C inkubiert.
        HINWEIS: Die optimale Inkubationstemperatur variiert für verschiedene Proteine.
      6. Verwenden Sie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM), um die Expression fluoreszierender Proteine zu überwachen.
  3. Unterstützte Lipiddoppelschicht (SLB)
    1. Vorbereitung der SLB-Kammern
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1,5 Deckgläser durch Zugabe von sieben Tropfen Schwefelsäure und zwei Tropfen 50% Wasserstoffperoxid in die Mitte jedes Eindeckobjekts. Inkubieren Sie die Reaktanten auf den Deckgläsern mindestens 45 Minuten lang; Gründlich mit Reinstwasser abspülen.
      2. Bauen Sie die Rekonstitutionskammer zusammen, indem Sie ein geschnittenes 0,5-ml-Mikrofugenröhrchen mit optischem Klebstoff auf die gereinigten Deckgläser aufsetzen, der 10 Minuten lang unter einer UV-Lampe (365 nm) ausgehärtet wurde, um eine Reaktionskammer zu bilden.
    2. SLB-Gründung
      1. 80 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholin (DOPC), 19,95 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phospho-L-serin (DOPS) und 0,05 mol% Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin = DOPE) lösen, Chloroform einmischen, unter mildem Stickstofffluss trocknen und 1 h vakuumieren, um das Lösungsmittel vollständig zu entfernen.
      2. Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm in SLB-Puffer A, was zu einer endgültigen Lipidkonzentration von 4 mg/ml führt.
      3. Die resultierenden Proben werden vortexen und beschallt, bis sie klar werden.
      4. 4 mg/ml SUVs mit 130 μl SLB-Puffer A verdünnen, 75 μl der Suspension in die vorgeformten Reaktionskammern überführen und auf einem Heizblock bei 37 °C 1 min inkubieren. 150 μl SLB-Puffer A werden für eine weitere Inkubation von 2 Minuten in die Reaktionskammer gegeben.
      5. Waschen Sie die Kammer mit 2 mL SLB-Puffer B (SLB-Puffer A ohne MgCl2), bevor Sie einen Pufferaustausch zum S30-Puffer C mit 0,4 % (w/v) BSA für CFPS-Reaktionen durchführen, wobei 100 μl Puffer in der Kammer verbleiben, um ein Austrocknen des gebildeten SLB zu verhindern.
      6. Den restlichen S30-Puffer C entfernen und das CFPS-Reaktionsgemisch vorsichtig in die SLB-Kammer geben. Inkubieren Sie die Kammer bei 30 °C und überwachen Sie die Expression unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop.

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Ergebnisse

Für jede neue Charge von Zellextrakt und T7-RNA-Polymerase wird empfohlen, ein grundlegendes Screening sowohl der Mg2+- als auch der K+-Konzentrationen durchzuführen, um die optimale Leistung des CFPS-Systems sicherzustellen. Die Fluoreszenz von Superfolder GFP kann als Indikator für die Gesamtausbeute des CFPS-Systems unter verschiedenen Bedingungen dienen, wie in Abbildung 1A,B dargestellt. Darüber hinaus ist in Abbildung 1C

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Diskussion

Dieses Manuskript skizziert ein modifiziertes System zur zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das für den Einsatz in verschiedenen Mikrokompartimenten auf synthetischen Zellplattformen entwickelt wurde, einschließlich Wasser-in-Öl-Tröpfchen, GUVs und SLBs. Wir verwendeten den standardmäßigen rekombinanten Proteinexpressions-Wirtsstamm BL21(DE3) von E. coli als Ausgangsextrakt für den Aufbau proteinzentrierter synthetischer Zellsysteme. Dieser Ansatz ergab etwa 0,5 mg/ml Protein üb...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

M. Y. bedankt sich für die Finanzierung durch das Postgraduate Research & Practice Innovation Program der Provinz Jiangsu, China (Grant No. KYCX22_2803). L.K. ist dankbar für die Unterstützung durch die Natural Science Research of Jiangsu Higher Education Institutions of China, China (Grant No. 17KJB180003), die Natural Science Foundation der Jiangsu Normal University, China (Grant No. 17XLR037), das Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, China, und das Jiangsu Specially-Appointed Professor Program, China.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (Natriumsalz)(DOPS)Avanti840035P
1,4-dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC)Avanti850457P
3,5-zyklisches AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mL RöhrchenEppendorfRöhrchen BioBased
50% WasserstoffperoxidSigma-Aldrich516813
AcetatSigma-AldrichA6283
AgarPulver Sigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon RührzellenMerckMilliporeUFSC05001
Ammoniumacetat (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininSigma-AldrichA4474
AsparaginSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
ErlenmeyerkolbenShuniu250 mL, 1000 mL
Rinderserumalbumin (BSA)Roche10711454001
ZentrifugeröhrchenEppendorf EppendorfRöhrchen 3810X
ZentrifugeröhrchengestellEppendorf0030119819
Chemilumineszenz- und Epifluoreszenz-BildgebungssystemUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Zellzählkammer ObjektträgerThermo Fisher ScientificC10283
DeckglasThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
Kreatinkinase (CK)Roche10127566001
Kreatinphosphat (CP)Sigma-Aldrich10621714001
KulturschaleHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidin 5'-Triphosphat-Dinatriumsalz (CTP)AladdinC101487
DialysemembranSpectrumStandard RC Schläuche MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Elektroheizung Grubber mit stehendem TemperaturbereichYiheng InstrumentDHP-9602
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Biosharp
Fluoreszenzplatten-LesegerätBioTekSynergy 2
Fluoriertes ÖlSuzhou CChip wissenschaftliches Instrument2%HFE7500
FolinsäureSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminSigma-AldrichG5792
GlycerinSigma-AldrichG5516
GlycinSigma-AldrichG7126
Guanosin 5'-triphosphat Natriumsalzhydrat (GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
Magnesiumacetat-Tetrahydrat (Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661
Magnesiumchlorid(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
MikrozentrifugeEppendorf5424 R
MineralölSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
MehrzweckzentrifugeEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Nukleinsäure & Protein UV-Assay MessungenIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi Kit für Transfektionsplasmid DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 Well PolystyrolplattenSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
PhenylalaninSigma-AldrichP8740
Phosphoenolpyruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Kaliumacetat (KOAc)Sigma-AldrichP5708
Kaliumchlorid ( KCl)Sigma-AldrichP9541
Kaliumglutamat (K-Glutamat)Sigma-AldrichG1501
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Pyruvatkinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
SchüttlerZhichushakersZQZY-AF8
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-AldrichS5881
SaccharoseAladdinS112226
SchwefelsäureSigma-Aldrich339741
SpritzenvorsatzfilterJinteng0,45 μ m
ReagenzglasShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamid Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Tris BaseSigma-AldrichV900483
tRNARoche10109550001
TryptonSigma-AldrichT7293
TryptophanSigma-AldrichT8941
TyrosinSigma-AldrichT8566
UTP Trinatriumsalz (UTP)AladdinU100365
Vakuumpumpe mit UmwälzwassersystemZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Vortex-MischerKylin-BellVortex QL-861
WasseraufbereitungssystemMerckMilliporeDirect Reinstwasser (Typ 1)
HefeextraktSigma-Aldrich70161
β-MercaptoethanolSigma-Aldrich444203
1100027

Referenzen

  1. Elani, Y. Interfacing living and synthetic cells as an emerging frontier in synthetic biology. Angew Chem Int Ed Engl. 60 (11), 5602-5611 (2021).
  2. Cho, E., Lu, Y. Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond. ACS Synth Biol. 9 (11), 2881-2901 (2020).
  3. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2020).
  4. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (9), e2000187(2020).
  5. Lu, Y., Allegri, G., Huskens, J. Vesicle-based artificial cells: materials, construction methods and applications. Mater Horiz. 9 (3), 892-907 (2022).
  6. Fu, Z., Ochsner, M. A., De Hoog, H. P., Tomczak, N., Nallani, M. Multicompartmentalized polymersomes for selective encapsulation of biomacromolecules. Chem Commun (Camb). 47 (10), 2862-2864 (2011).
  7. Ayoubi-Joshaghani, M. H., et al. Cell-free protein synthesis: the transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices. Biotechnol Bioeng. 117 (4), 1204-1229 (2020).
  8. Yue, K., Chen, J. Y., Li, Y. Q., Kai, L. Advancing synthetic biology through cell-free protein synthesis. Comput Struct Biotechnol J. 21, 2899-2908 (2023).
  9. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci Rep. 5, 8663(2015).
  10. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  11. Schwarz, D., et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems. Nat Protoc. 2 (11), 2945-2957 (2007).
  12. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), e58882(2019).
  13. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synth Syst Biotechnol. 5 (4), 252-267 (2020).
  14. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. 4, 8(2010).
  15. Mcmanus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Arch Biochem Biophys. 674, 108045(2019).
  16. Kim, T. W., et al. Prolonged cell-free protein synthesis using dual energy sources: combined use of creatine phosphate and glucose for the efficient supply of ATP and retarded accumulation of phosphate. Biotechnol Bioeng. 97 (6), 1510-1515 (2007).
  17. Kim, D. M., Swartz, J. R. Regeneration of adenosine triphosphate from glycolytic intermediates for cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 74 (4), 309-316 (2001).
  18. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synth Biol. 4 (4), 454-462 (2015).
  19. Rasor, B. J., et al. Mechanistic insights into cell-free gene expression through an integrated-omics analysis of extract processing methods. ACS Synth Biol. 12 (2), 405-418 (2023).
  20. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239 (3), 881-886 (1996).
  21. Li, J. J., Li, P. X., Liu, Q., Li, J. J., Qi, H. Translation initiation consistency between in vivo and in vitro bacterial protein expression systems. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1201580(2023).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Biotechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  24. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  25. Jaroentomeechai, T., et al. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nat Commun. 9 (1), 2686(2018).
  26. Katsura, K., et al. Phosphorylated and non-phosphorylated HCK kinase domains produced by cell-free protein expression. Protein Expr Purif. 150, 92-99 (2018).
  27. Suzuki, T., et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry. Proteomics. 6 (16), 4486-4495 (2006).
  28. Chi, H., Wang, X., Li, J., Ren, H., Huang, F. Chaperonin-enhanced Escherichia coli cell-free expression of functional CXCR4. J Biotechnol. 231, 193-200 (2016).
  29. Endo, Y., Sawasaki, T. High-throughput, genome-scale protein production method based on the wheat germ cell-free expression system. Biotechnol Adv. 21 (8), 695-713 (2003).
  30. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  31. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 86 (1), 19-26 (2004).
  32. Ryabova, L. A., Vinokurov, L. M., Shekhovtsova, E. A., Alakhov, Y. B., Spirin, A. S. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal Biochem. 226 (1), 184-186 (1995).
  33. Guzman-Chavez, F., et al. Constructing cell-free expression systems for low-cost access. ACS Synth Biol. 11 (3), 1114-1128 (2022).
  34. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol Bioeng. 87 (4), 465-472 (2004).
  35. Caschera, F., et al. High-throughput optimization cycle of a cell-free ribosome assembly and protein synthesis system. ACS Synth Biol. 7 (12), 2841-2853 (2018).
  36. Yue, K., et al. Bottom-up synthetic biology using cell-free protein synthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol. 185, 1-20 (2023).
  37. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnol Prog. 21 (2), 460-465 (2005).
  38. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. J Biotechnol. 126 (4), 554-561 (2006).
  39. McPhie, P. [4] Dialysis. Methods Enzymol. 22, 23-32 (1971).
  40. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  41. Kai, L., et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins. Methods Mol Biol. 800, 201-225 (2012).
  42. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  43. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).
  44. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  45. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  46. Kai, L., Dotsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. Artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS One. 8 (2), e56637(2013).
  47. Kai, L., Sonal, H. T., Schwille, P. Reconstitution of a reversible membrane switch via prenylation by one-pot cell-free expression. ACS Synth Biol. 12 (1), 108-119 (2023).
  48. Foshag, D., et al. The E. Coli S30 lysate proteome: a prototype for cell-free protein production. N Biotechnol. 40, Pt B 245-260 (2018).
  49. Garenne, D., Beisel, C. L., Noireaux, V. Characterization of the all-E. coli transcription-translation system mytxtl by mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 33 (11), 1036-1048 (2019).
  50. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., Garcia-Vallve, S. Optimizer: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, Web Server issue W126-W131 (2007).
  51. RNAfold WebServer. Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna. , Available from: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi (2024).
  52. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium vibrio natriegens. J Vis Exp. (145), e59495(2019).
  53. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. An economical method for cell-free protein synthesis using glucose and nucleoside monophosphates. Biotechnol Prog. 21 (4), 1146-1153 (2005).
  54. Kim, D. M., Swartz, J. R. Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATP regeneration system. Biotechnol Bioeng. 66 (3), 180-188 (1999).
  55. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  56. Teh, S. Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), 044113(2011).

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