Erfahrungsabhängiger Umbau der synaptischen Konnektivität von olfaktorischen sensorischen Neuronen im juvenilen Gehirn in einer kritischen Phase im frühen Leben

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier Methoden zur Induktion und Analyse des olfaktorischen erfahrungsabhängigen Umbaus von synaptischen Glomeruli des Antennenlappens im juvenilen Gehirn von Drosophila .

Zusammenfassung

Die olfaktorische sensorische Erfahrung im frühen Leben induziert einen dramatischen synaptischen Glomeruli-Umbau im jugendlichen Gehirn von Drosophila , der erfahrungsabhängig dosisabhängig, zeitlich begrenzt und nur in einer kurzen, genau definierten kritischen Periode vorübergehend reversibel ist. Die Richtungsabhängigkeit des Umbaus der synaptischen Konnektivität von Gehirnschaltkreisen wird durch den spezifischen Geruchsstoff bestimmt, der auf die Rezeptorklasse der Befragten von olfaktorischen sensorischen Neuronen wirkt. Im Allgemeinen exprimiert jede Neuronenklasse nur einen einzigen Geruchsrezeptor und innerviert einen einzelnen olfaktorischen synaptischen Glomerulus. Im genetischen Modell von Drosophila wurde das gesamte Spektrum der olfaktorischen Glomeruli anhand der Reaktionsfähigkeit von Geruchsstoffen und der Verhaltensleistung genau kartiert. Der Geruchsstoff Ethylbutyrat (EB) aktiviert Or42a-Rezeptorneuronen, die den VM7-Glomerulus innervieren. Während der kritischen Phase im frühen Leben führt die EB-Erfahrung zu einer dosisabhängigen Synapseneliminierung in den olfaktorischen sensorischen Neuronen von Or42a. Zeitlich begrenzte Zeiträume der dosierten Exposition gegenüber EB-Odorstoffen ermöglichen die Untersuchung der erfahrungsabhängigen Beschneidung der Schaltkreiskonnektivität im juvenilen Gehirn. Die konfokale Mikroskopie der synaptischen Glomeruli des Antennenlappens erfolgt mit Or42a-Rezeptor-gesteuerten transgenen Markern, die eine Quantifizierung der Synapsenzahl und des Innervationsvolumens ermöglichen. Das ausgeklügelte genetische Toolkit von Drosophila ermöglicht die systematische Aufschlüsselung der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Umbau von Gehirnschaltkreisen vermitteln.

Einleitung

Der Umbau der Schaltkreise des juvenilen Gehirns während des frühen Lebens stellt die letzte Chance für großflächige Veränderungen der synaptischen Konnektivität dar, um der hochgradig variablen, unvorhersehbaren Umgebung, in die ein Tier geboren wird, gerecht zu werden. Als die am häufigsten vorkommende Gruppe von Tieren teilen Insekten diesen evolutionär konservierten, grundlegenden Mechanismus des Umbaus in der kritischen Periode¹. Kritische Perioden beginnen mit dem Einsetzen des sensorischen Inputs, weisen reversible Schaltkreisänderungen auf, um die Konnektivität zu optimieren, und schließen sich dann, wenn die Stabilisierungskräfte einer weiteren Umgestaltung widerstehen². Insekten sind besonders auf olfaktorische sensorische Informationen angewiesen und weisen eine gut definierte olfaktorische kritische Periode auf. Drosophila bietet ein hervorragendes genetisches Modell, um diese erfahrungsabhängige kritische Phase im juvenilen Gehirn zu untersuchen. Die Geruchserfahrung in den ersten Tagen nach der Eklosion führt zu auffälligen Veränderungen der Schaltkreiskonnektivität in individuell identifizierten synaptischen Glomeruli ^3,4. Die Richtung des Umbaus hängt von der spezifischen Geruchserfahrung des Eingangs ab. Einige Geruchsstoffe verursachen eine Zunahme des synaptischen Glomerulusvolumens für einige Tage nach der Eklosion (dpe)3,5,6,7, während andere Geruchsstoffe eine schnelle Eliminierung von Synapsen während der kritischen Periode von 0-2 dpe verursachen, was zu einer verminderten Innervationsvolumina führt ^8,9,10. Insbesondere führt die Erfahrung mit Ethylbutyrat (EB)-Odorierstoffen zu einer dosisabhängigen synaptischen Beschneidung der Or42a-Geruchsrezeptor-Neuronen nur während dieser kritischen Phase im frühen Leben⁸. Die Synapseneliminierung ist durch Modulation des EB-Geruchseintrags innerhalb der kritischen Periode vollständig reversibel, wird aber nach Abschluss der kritischen Periode dauerhaft. Diese von der olfaktorischen Erfahrung abhängige synaptische Beschneidung stellt ein wertvolles experimentelles System dar, um die zeitlich begrenzten Mechanismen aufzuklären, die dem Umbau der juvenilen Gehirnschaltkreise zugrunde liegen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das zur Induktion und Analyse des EB-erfahrungsabhängigen synaptischen Pruning von olfaktorischen sensorischen Neuronen des Or42a-Rezeptors während der kritischen Phase im frühen Leben verwendet wird. Wir zeigen, dass synaptische Or42a-Terminals im Antennenlappen VM7-Glomerulus spezifisch markiert werden können, indem ein membrangebundener mCD8::GFP-Marker transgen gesteuert wird, der entweder direkt mit dem Or42a-Promotor fusioniert ist (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ oder das binäre Gal4/UAS-Expressionssystem verwendet (Or42a-Gal4 treibt UAS-mCD8::GFP an)¹². Einzelne Synapsen von Or42a-Neuronen können auf ähnliche Weise markiert werden, indem präsynaptische aktive Zonenmarker gezielt transgenisiert werden, die mit einem Array von Fluoreszenz-Tags (z. B. Bruchpilot::RFP)⁸ oder einem elektronendichten Signal für ultrastrukturelle Synapsenanalysen (z. B. miniSOG-mCherry)⁸ fusioniert sind. Die synaptischen Terminals von Or42a können mit einer Kombination aus konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass die Beschneidung der synaptischen Glomeruli von Or42a EB-abhängig ist und mit der Konzentration des zeitlich festgelegten Geruchserlebnisses skaliert wird. Der prozentuale Anteil des in Mineralöl, das als Vehikel verwendet wird, gelösten EB-Odorstoffs kann variiert werden, ebenso wie die zeitlich festgelegte Dauer der Odorstoffexposition bei Tieren im Entwicklungsstadium. Schließlich zeigen wir die Methoden, mit denen das Ausmaß der synaptischen Glomeruli-Beschneidung durch Messung der Intensität und des Volumens der Innervationsfluoreszenz VM7 analysiert wird. Die Synapsenzahl kann auch durch Zählen markierter synaptischer Punkte und durch Messung synaptischer Ultrastrukturparameter mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie⁸ quantifiziert werden. Insgesamt ist das hier gezeigte Protokoll ein leistungsfähiger Ansatz, der die systematische Dissektion sowohl zellulärer als auch molekularer Mechanismen ermöglicht, die den olfaktorischen Konnektivitätszyklus von Drosophila während einer juvenilen kritischen Phase vermitteln. Das in dieser Studie beschriebene allgemeine Geruchsexpositions-Setup wurde in früheren Studien mit anderen Gerüchen und der Bestimmung anderer Glomeruli verwendet ^3,7.

Protokoll

1. Exposition gegenüber Geruchsstoffen

1. Mit einem feinen Pinsel werden 40-50 Tiere im Entwicklungsstadium als dunkle Puppen (90+ h nach der Pupariation bei 25 °C) in 25 mm x 95 mm große Styropor-Drosophila-Fläschchen mit Standardfutter aus Maismehlmelasse sortiert (Abbildung 1A).
2. Legen Sie feines Edelstahldrahtgeflecht über das Ende der Drosophila-Fläschchen , um die Fliegen einzudämmen und gleichzeitig eine gute Luftzirkulation zu ermöglichen. Befestigen Sie die Drahtgeflechtkappen mit einer transparenten Folie an der Seite der Drosophila-Fläschchen .
3. Geben Sie in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 1 ml 100 % Mineralöl (Fahrzeugsteuerung) oder lösen Sie das Odormittel Ethylbutyrat (EB) in Mineralöl in einem anderen Röhrchen auf, um die gewünschte Konzentration zu erzeugen (z. B. 15 % (150 μL) oder 25 % (250 μL)).
4. Platzieren Sie die Röhrchen für die Fahrzeugsteuerung oder die Odorierungsmittel-Mikrozentrifuge aufrecht in einem luftdichten 3700-ml-Glasslock-Behälter. Verankern Sie die Röhrchen mit Klebeband zusammen mit den Drosophila-Fläschchen sicher in der Mitte der Odoriermittelkammern (Abbildung 1B).
5. Die versiegelten Fahrzeugsteuerungs- und EB-Odormittelkammern mit den in der Phase befindlichen Drosophila-Pharat-Puppenfläschchen werden in einen befeuchteten (70 %) temperaturgesteuerten (25 °C) Inkubator für einen 12-h/12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gestellt.
6. Entfernen Sie die neu geschlossenen Fliegen nach 4 h Exposition in der Odorierstoffkammer und setzen Sie 20-25 Fliegen schnell in frische Drosophila-Fläschchen in Kammern mit frisch hergestelltem Odorant um (Abbildung 1A, B). Entsorgen Sie die nicht geschlossenen Puppen.
7. Bewahren Sie die Fliegen in ihren verschlossenen Odorierkammern in den Brutschränken insgesamt 24 h auf. Für eine längere Dosierung des Odoriermittels können Sie die Fliegen alle 24 Stunden schnell in neue Drosophila-Fläschchen in frisch hergestellten Odoriermittelkammern umfüllen.
8. Betäuben Sie die in der Entwicklung befindlichen Fliegen, indem Sie sie 1 Minute lang in eine Schale mit 70 % Ethanol tauchen, um sie für die sofortige Hirndissektion und immunzytochemische Verarbeitung vorzubereiten.

2. Dissektion des Gehirns

1. Kennzeichnen Sie Fläschchen als Vehikelkontrolle (nur 100 % Mineralöl) oder EB-exponiert (% EB), indem Sie diese Bezeichnungen kennzeichnen und für die gesamte Dauer der Hirndissektion und anschließenden Verarbeitung beibehalten. Verarbeiten Sie 10-20 Tiere für jeden Genotyp/Geruchszustand.
2. Übertragen Sie mit einer Pinzette eine einzelne betäubte Fliege in eine kleine Schale mit frisch hergestellter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)¹³. Tauchen Sie die Fliege in PBS ein und fahren Sie mit der vollständigen Gehirndissektion fort, wobei die Fliege vollständig untergetaucht ist.
3. Legen Sie mit einer feinen (#5) geschärften Pinzette in beiden Händen die Fliege mit der Bauchseite nach oben und fassen Sie mit einer Pinzette den oberen Brustkorb und mit der anderen Pinzette den Kopf unter dem Rüssel. Achten Sie darauf, nicht in das Gehirn einzudringen.
4. Entferne den Kopf vom restlichen Körper, indem du mit beiden Händen sanft in entgegengesetzte Richtungen ziehst. Der Kopf sollte sich leicht vom Brustkorb lösen; Lassen Sie den isolierten Kopf zum Sezieren (Abbildung 1C).
5. Schieben Sie die Pinzette, mit der Sie zuvor den Brustkorb gefasst haben, unter die gegenüberliegende Seite des Rüssels. Beginnen Sie, die Kutikula des Exoskeletts sanft in entgegengesetzte Richtungen zu ziehen, so dass sie zwischen den Augen tränen, um das Gehirn freizulegen.
6. Beim Ziehen können sich die Sehlappen des Gehirns zusammen mit dem Exoskelett trennen. Um dies zu verhindern, ziehen Sie mit den beiden Pinzetten langsam, gleichmäßig, während Sie die Nagelhaut des Exoskeletts entfernen (Abbildung 1C, Mitte).
7. Fahren Sie fort, die Nagelhaut des Exoskeletts vom Kopf zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass alle Teile des Exoskeletts entfernt sind. Entferne jegliches Gewebe, das mit dem Gehirn verbunden ist, einschließlich des Fettkörpers und aller vorstehenden Luftröhren.
8. Um ein Verkleben zu verhindern, spülen Sie eine P20-Pipettenspitze mit PBS + 0,2 % Triton-X 100 (PBST). Unmittelbar nach der Dissektion wird das Gehirn in die Fixierlösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) + 4 % Saccharose) in einem verschlossenen Röhrchen überführt (Abbildung 1C, D).

3. Immunzytochemie des Gehirns

1. Fixieren Sie das Gehirn für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) mit einer End-over-End-Rotation. Während Sie das Gehirn in der Tube aufbewahren, pipettieren Sie das gefährliche Fixiermittel ab und entsorgen Sie es ordnungsgemäß. Waschen Sie fixierte Gehirne schnell 3x mit PBS (Abbildung 1D).
2. Das Gehirn steckt nach der Rotation oft in der Kappe der Röhren fest. Um einen versehentlichen Verlust des Gehirns zu vermeiden, der bei allen Transfers eine ständige Gefahr darstellt, verwenden Sie beim Pipettieren von Flüssigkeiten ein Präpariermikroskop.
3. Zur Vorbereitung auf die Antikörpermarkierung blockieren Sie das fixierte Gehirn für 1 h bei RT in PBST + 1 % Rinderserumalbumin (BSA) + 0,5 % normalem Ziegenserum (NGS) mit konstanter End-over-End-Rotation (Abbildung 1D).
4. Entfernen Sie den Block und inkubieren Sie das Gehirn mit dem ausgewählten Primärantikörper, der entsprechend in PBST + 0,2 % BSA + 0,1 % NGS verdünnt ist. Inkubieren Sie das Gehirn über Nacht (14-16 h) bei 4 °C mit konstanter Rotation.
   HINWEIS: Verwendete Beispiel-Antikörper: Anti-CadN (Verdünnung 1:50)¹⁴ der Ratte zur Markierung synaptischer Glomeruli und Anti-GFP (1:1000)⁸ des Huhns zur Markierung von Or42a-mCD8::GFP (Abbildung 1D).
5. Pipettieren Sie den primären Antikörper ab. Waschen Sie die Gehirne 3x für jeweils 20 min mit PBST. Inkubieren Sie Gehirne mit Sekundärantikörpern, verdünnt in PBST mit 0,2 % BSA + 0,1 % NGS für 2 Stunden bei RT mit konstanter Rotation.
   HINWEIS: Alternativ können Sie das Gehirn über Nacht (14-16 h) bei 4 °C inkubieren. Verdünnte Antikörper in PBST mit 0,2 % BSA + 0,1 % NGS; Hier verwendete Sekundärantikörper: 488 Ziegen-Anti-Huhn (1:250) und 546 Ziegen-Anti-Ratte (1:250).
6. Pipettieren Sie die Sekundärantikörper ab. Waschen Sie die Gehirne 3x für jeweils 20 min mit PBST. Zum Schluss waschen Sie das Gehirn 20 Minuten lang mit PBS (Abbildung 1D).
7. Bereiten Sie Glasobjektträger (75 mm x 25 mm) vor, indem Sie zwei dünne Streifen doppelseitiges Klebeband im Abstand von ~25 mm auf den Objektträger aufbringen. Dies bietet einen Abstandshalter, um ein Zerquetschen des Gehirns zu vermeiden.
8. Pipettieren Sie ~10-15 μl Eindeckmedium zwischen die beiden Klebebandstreifen, um das Gehirn zu befestigen. Übertragen Sie mit einer P20-Pipettenspitze, die mit PBST vorgespült wurde, die markierten Gehirne auf den Objektträger (Abbildung 1E).
9. Sobald die Gehirne übertragen wurden, richten Sie sie mit einem feinen Pinsel aus und stellen Sie sicher, dass die Antennenlappen nach oben zeigen. Achte auf die Seite mit dem gewölbten Höcker, der die Fühlerlappen enthält.
10. Sobald die Gehirne richtig ausgerichtet sind, decken Sie sie mit einem Glasdeckglas (Nr. 1,5H) ab und stellen Sie sicher, dass das Deckglas sicher auf dem Klebeband sitzt. Füllen Sie dann die Seiten des Deckglases mit zusätzlichem Eindeckmedium aus (Abbildung 1E).
11. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. Lassen Sie den Objektträger gründlich trocknen und bewahren Sie ihn dann für die anschließende Bildgebung im Kühlschrank auf.

4. Konfokale Bildgebung

1. Verblinden Sie alle Objektträger des Gehirns sowohl für den Genotyp als auch für die Erfahrungsbedingungen vor der Bildgebung, indem Sie den Objektträger für die spätere Dekodierung mit einem codierten Etikett markieren.
2. Verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 63-fach-Ölimmersionsobjektiv. In allen hier gezeigten Bildern verwenden wir ein Zeiss 510 META Mikroskop (Abbildung 1F).
3. Verwenden Sie geeignete Laserlinien für die verwendeten Fluorophore. Verwenden Sie hier einen Argon-488- und einen HeNe-543-Laser für die synaptischen Glomeruli des Antennenlappens und die olfaktorische sensorische Neuronenbildgebung von Or42a (Abbildung 2).
4. Bestimmen Sie die optimale Verstärkung und den optimalen Offset für beide Kanäle, wobei Sie idealerweise die Verstärkung für beide Kanäle <750 und den Offset ≈0 halten. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass das Signal-Rausch-Verhältnis optimal ist und gleichzeitig der Hintergrund begrenzt wird.
5. Positionieren Sie die Bildgebung in der Mitte des Gehirns. In der Bildgebung befinden sich die VM7-Glomeruli proximal zu dem Loch in der Mitte des Gehirns, nachdem die Speiseröhre während der Dissektion entfernt wurde (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Die VM7-Glomeruli befinden sich immer in der Nähe der Öffnung der Speiseröhre. Die genaue Lage und Größe variieren jedoch leicht je nach Hirndissektion und zunehmenden Unterschieden, also berücksichtigen Sie dies bei der Bildgebung.
6. Wählen Sie die Bildauflösung und die Dicke der optischen Schicht. Hier wird eine Auflösung von 1024 x 1024 mit einer Z-Stapel-Schichtdicke von 0,37 μm verwendet.
7. Nehmen Sie eine gesamte konfokale Z-Stack-Projektion durch den Antennenlappen und stellen Sie sicher, dass die vollständige Innervation des Or42a-Neurons der VM7-Glomeruli erfasst wird.

5. Synaptische Messungen

1. Laden Sie das Genotyp-/zustandsverblindete Bild in Fidschi (1.54f). Teilen Sie die Laserlinienkanäle, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilen klicken.
2. Bestimmen Sie im olfaktorischen Sinneskanal von Or42a, welche Scheiben die Or42a-Innervation enthalten, indem Sie durch den gesamten Z-Stapel scrollen und dort angeben, wo die Fluoreszenz beginnt und endet.
3. Erstellen Sie eine Summenschichtprojektion, die nur Schichten enthält, die Or42a-Neuroneninnervation enthalten, indem Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt > Summenschichten klicken und den gewünschten Bereich eingeben.
4. Klicken Sie in Fidschi auf das Lasso-Werkzeug in der oberen Leiste, um den Umriss der Innervation des Or42a-Neurons im VM7-Glomerulus nachzuzeichnen, wobei jeder Glomerulus auf der Gehirnseite unabhängig voneinander behandelt wird (Abbildung 3).
5. Multiplizieren Sie den Umfang mit der Anzahl der Z-Stapel-Scheiben und der Dicke jeder Scheibe, um das VM7-Synapsen-Glomerulus-Innervationsvolumen zu erhalten. Um die Synapsenzahl zu quantifizieren, kann das Werkzeug "Maxima suchen" zusammen mit dem Makro "Maxima Stacks suchen" verwendet werden, um Synapsen-Puncta in der umrissenen Region ^8,15 zu zählen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die von der Geruchserfahrung abhängige Geruchsstoffexposition in der kritischen Periode und bildgebende Verfahren des Gehirns. Das Protokoll beginnt mit der Altersanpassung von dunklen Puppen pharate unmittelbar vor der Eklosion (Abbildung 1A). Die Puppen werden für 4 Stunden in Odoriermittelkammern gelegt, und dann werden neu eingeschlossene Erwachsene in frische Fläschchen entweder in der Fahrzeugkontrolle oder in dosierten EB-Odormittelkammern umgedreht (Abbildung 1B). Wir setzen das Odormittel in der Regel 24 Stunden lang aus, obwohl jede Dauer möglich ist. Nach der Exposition mit Geruchsstoffen beginnt die Dissektion des Gehirns mit der Entfernung des Kopfes aus dem Thorax und dann mit der Entfernung des Exoskeletts der Nagelhaut mit einer feinen Pinzette (Abbildung 1C). Das isolierte Gehirn wird von allen assoziierten Geweben gereinigt, die die Bildgebung beeinträchtigen könnten, und dann sofort in 4 % Paraformaldehyd und 4 % Saccharose in PBS fixiert. Eine kurze Fixzeit von 30 Minuten ist ausreichend für eine gute Integrität des Hirngewebes. Das immunzytochemische Protokoll beginnt mit einem 1-stündigen Block (z. B. BSA, NGS), einer Inkubation über Nacht in primären Antikörpern (z. B. anti-GFP, -CadN) und einer anschließenden kurzen 2-stündigen Inkubation in sekundären Antikörpern (Abbildung 1D). Die markierten Gehirne werden auf Objektträgern unter versiegelten Deckgläsern mit der Rückenfläche des Gehirns nach oben montiert, um eine optimale Abbildung der Antennenlappen zu ermöglichen (Abbildung 1E). Beachten Sie, dass alle Proben sowohl für den Genotyp als auch für die Erfahrungsbedingungen verblindet werden, indem der Objektträger mit einer codierten Bezeichnung für die spätere Dekodierung markiert wird. Ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv wird verwendet, um die Antennenlappen des Zentralhirns abzubilden (Abbildung 1F). Es werden Laserlinien ausgewählt, die für die verwendeten Fluorophore optimal sind (z. B. Argon 488 und HeNe 543), um die olfaktorische sensorische Neuroneninnervation von VM7 in Or42a im Kontext der umgebenden Glomeruli abzubilden.

Es ist wichtig, die optimale Verstärkung, den optimalen Offset, die optimale Bildauflösung und die optische Schichtdicke auszuwählen, um die gesamte Z-Stapel-Projektion der Or42a-Neuroneninnervation in den VM7-Glomeruli zu erfassen. Alle zu vergleichenden Genotypen und Erfahrungsbedingungen werden mit identischen Mikroskopeinstellungen abgebildet. Die Z-Stacks werden mit der ImageJ-Software verarbeitet, wobei die erfahrungsabhängigen Veränderungen hauptsächlich anhand des Innervationsvolumens ^7,14 bewertet werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, volumetrische Messungen zu berechnen. Man berechnet die Innervationsfläche Schicht für Schicht mit der Lasso-Funktion ImageJ und multipliziert dann jeden Wert mit der Dicke jeder Scheibe (μm)^8,9. Die andere verwendet Z-Projektionen für Summenschichten und multipliziert die Anzahl der Z-Stapel-Schichten mit der Schichtdicke, um das durchschnittliche Volumen zu bestimmen. Beide Methoden liefern konsistente Ergebnisse. Zusätzlich zu den Volumenmessungen kann auch die Fluoreszenzintensität mit der maximalen Intensitätsprojektion von VM7 glomeruli¹⁶ bestimmt werden. Die gewichtete Summe aller Pixel wird über die maximale Projektion der ImageJ-Summenschicht bewertet, wobei die Pixelanzahl auf jeder Intensitätsstufe summiert wird, um die Gesamtintensität ^8,9 zu berechnen. Der Hintergrund kann subtrahiert werden, indem eine extraglomeruläre Region identischer Größe quantifiziert wird. Diese Subtraktionsmethode ist zeitaufwändiger, aber genauer, da sie unterschiedliche Niveaus der Hintergrundantikörpermarkierung in jeder Gehirnprobe berücksichtigt, um eine repräsentativere Quantifizierung der Innervationsfluoreszenzintensitätswerte zu erzielen. Intensitätsmessungen werden in einem typischen Bereich von 18-30 optischen Schichten (0,37 μm/Schicht) innerhalb eines Z-Stapels durchgeführt, gemittelt für jedes Gehirn¹⁶. In fast allen Fällen liefern die Messungen der Innervationsfluoreszenzintensität und des Volumens konsistente Ergebnisse.

Über alle Messmodalitäten hinweg bleiben die repräsentativen Ergebnisse unerschütterlich; Die frühe Erfahrung mit EB-Odorierstoffen führt zu einem signifikanten Verlust der Innervation von Or42a-Neuronen. Der VM7-Glomerulus kann zuverlässig anhand von Größe, Form und Lage unter anderen präzise kartierten olfaktorischen Glomeruli des Antennenlappens identifiziert werden (Abbildung 2A) und durch gezielte Expression der Or42a-mCD8::GFP-Membranmarkierung, die an die glomeruläre Markierung mit antineuralem Cadherin (CadN; Abbildung 2B). Die zeitgesteuerte Exposition gegenüber dem Odorierungsmittel (Mineralöl) führt zu einer Innervation von Or42a-Neuronen, die von einem unbehandelten, normalen Tier nicht zu unterscheiden ist. Dennoch führt die Erfahrung von EB-Odoriermitteln in den ersten Tagen nach der Eklosion (dpe) zu einer synaptischen Glomeruli-Beschneidung (Abbildung 2C). Dieser Beschneidungsmechanismus ist vollständig auf die kurze kritische Periode im frühen Leben beschränkt ^8,10. In der Regel verwenden wir heute eine 24-stündige Odorstoffexposition, um die synaptische Beschneidung von VM7-Glomeruli und die daraus resultierende Abnahme des Innervationsvolumens im juvenilen Drosophila-Gehirn zu beurteilen. Eine 24-stündige Exposition (0-1 dpe) gegenüber der Odorierungsmittelkontrolle (Mineralöl) hält die normale, dichte Or42a-mCD8::GFP-Innervation (grün) in den synaptischen Glomeruli VM7 (weiße gestrichelte Kreise) in beiden Antennenlappen der Gehirnhemisphäre aufrecht (Abbildung 2D, links). Im auffälligen Gegensatz dazu führt eine 24-stündige Exposition (0-1 dpe) mit 25 % EB-Odorant, gelöst im Mineralöl, zu einem starken Rückschnitt der Or42a-mCD8::GFP-Innervation (grün) und einem Verlust des synaptischen glomerulären Volumens (Abbildung 2D, rechts). Diese Ergebnisse sind sowohl visuell offensichtlich als auch durchweg klar. Eines der größten Attribute dieses Odorant-Experience-Protokolls ist die Klarheit der bildgebenden Ergebnisse des Gehirns, die sich auch hervorragend für eine einfache Quantifizierung der Innervationsfluoreszenzintensität und des Volumens eignen.

Der Hauptvorteil dieses Odorant-Erfahrungsprotokolls ist die Möglichkeit, es für die Untersuchung der zeitlichen Restriktion und der dosisabhängigen Mechanismen des Odoriermittels während des synaptischen Pruning in kritischen Perioden zu nutzen. Für die EB-getriebene Eliminierung von Or42a-Neuronensynapsen im VM7-Glomerulus ist der Umbaumechanismus hauptsächlich auf das frühe Jugendtier (0-2 dpe) beschränkt, wobei kein nachweisbares erfahrungsabhängiges synaptisches Pruning bei Reife (7-9 dpe) nachweisbar ist, mit Ausnahme einer geringfügigen Modulation bei den höchsten EB-Expositionsniveaus⁸. Eine solche zeitliche Beschränkung definiert eine kritische Periode, und das Verständnis dieses Zeitmechanismus ist ein wichtiges Ziel. Ein weiteres Merkmal dieses Protokolls ist, dass das erfahrungsabhängige synaptische Pruning EB-dosisabhängig ist (Abbildung 3). Die zeitgesteuerte Exposition gegenüber dem Odorierungsmittel control (Mineralöl) mit 0 % EB-Odorant führt zu einer normalen Innervation des synaptischen Glomerulus VM7 in einem Or42a-Neuron, das von einem unbehandelten Tier nicht zu unterscheiden ist. Die Berechnung des 3-dimensionalen Volumens der Innervation des Or42a-Neurons zeigt eine für ein normales juveniles Gehirn typische Größe (2260 μm³; Abbildung 3A, links). Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass eine Erhöhung der EB-Geruchsstoffkonzentration zu einer zunehmend stärkeren Beschneidung der synaptischen Glomeruli führt. Zum Beispiel führt eine 24-stündige Exposition (0-1 dpe) gegenüber 15 % EB-Odorstoff zu einem deutlichen und konsistenten Innervationsverlust (Abbildung 3A, Mitte). Die Quantifizierung des 3D-Innervationsvolumens zeigt eine auffällige Reduktion im Vergleich zu Fahrzeugkontrollen (760 μm³ vs. 2260 μm³). Eine 24-stündige Exposition (0-1 dpe) gegenüber 25 % EB-Geruchsstoff führt zu einem noch stärkeren Innervationsverlust (281 μm³; Abbildung 3A, rechts). Repräsentative Quantifizierungen für diesen Bereich der EB-Odorantenkonzentrationen zeigen konsistente Ergebnisse für die Fluoreszenzintensität (Abbildung 3B) und das Innervationsvolumen (Abbildung 3C). Diese Dosisabhängigkeit ermöglicht die Untersuchung der Mittel zur Verhinderung des synaptischen Beschneidens sowie zur Verbesserung des Beschneidungsvermögens mit geringerer Geruchsstoffexposition, um einen erhöhten Umbau der synaptischen Glomeruli zu demonstrieren. Einige frühere Studien haben den gegenteiligen Effekt eines erhöhten glomerulären Volumens unter Verwendung anderer Geruchsstoffe mit diesem Protokoll gezeigt¹⁰. Die Exposition gegenüber EB-Odorstoffen in der kritischen Phase führt immer zu einem auffälligen und leicht nachweisbaren synaptischen Glomeruli-Schnitt.

Abbildung 1: Flussdiagramm von Studien zur Exposition von Geruchsstoffen im juvenilen Gehirn von Drosophila . (A) Dunkle Puppen (90+ h nach der Pupariation bei 25 °C) werden gesammelt und in Odoriermittelkammern gelegt. Unter Geruchsbedingungen werden 4 Stunden für die Eklosion zugelassen, und dann werden junge Fliegen in ein frisches Fläschchen umgefüllt. (B) Altersangepasste Fliegen werden entweder in die Fahrzeugkontrolle (100 % Mineralöl) oder die Ethylbutyrat (EB; % v/v in Mineralöl) unterteilt. Ein feines Drahtgeflecht (Einschub) ermöglicht den Zugang zum Odormittel. Fliegen werden in der Regel für weitere 20 Stunden exponiert, also insgesamt 24 Stunden Exposition, 0-1 Tag nach der Eklosion (dpe). (C) Fliegen werden präpariert, indem zuerst der Kopf entfernt wird, und dann werden feine Pinzetten verwendet, um das Exoskelett der Kutikula vorsichtig zu entfernen und das jugendliche Gehirn zu isolieren. Das isolierte Gehirn wird von allen umliegenden Geweben und der hervorstehenden Luftröhre befreit. (D) Isolierte Gehirne werden fixiert, blockiert und dann nacheinander in primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Die Palette der verwendeten Antikörper umfasst typischerweise eine allgemeine Membransonde zur Darstellung der synaptischen Glomeruli des Antennenlappens und eine spezifische Membransonde für die olfaktorischen sensorischen Neuronen von Or42a. (E) Markierte Gehirne werden in einem Eindeckmedium auf einen Glasobjektträger mit Klebebandabstandshaltern unter einem versiegelten Deckglas gelegt. Die korrekte Ausrichtung des Gehirns (Rückenfläche nach oben) ist entscheidend für eine optimale Abbildung der Antennenlappen. (F) Die Gehirne werden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Alle Proben werden vor der Bildgebung und den anschließenden quantifizierten Analysen auf den Genotyp und die Erfahrungsbedingungen verblindet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beschneidung der synaptischen Glomeruli in der kritischen Periode. (A) Die olfaktorischen Glomeruli des Antennallappens (AL) sind genau kartiert. Einige repräsentative synaptische Glomeruli sind dargestellt. Die Or42a-Rezeptorklasse der olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSN) innerviert spezifisch die VM7-Glomeruli. (B) Or42a-mCD8::GFP-markierte Neuronen (grün) innervieren dicht die gepaarten VM7-Glomeruli auf der linken (L) und rechten (R) Seite des Gehirns, wobei alle synaptischen AL-Glomeruli (magenta) mit N-Cadherin (CadN)-Antikörpern markiert werden. Die Fliegenschnur ist w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Schematische grafische Darstellung der Or42a OSN-Innervation der synaptischen Glomeruli VM7 unter der Vehikelkontrollbedingung (100 % Mineralöl; links) und der Ethylbutyrat-Exposition (% EB v/v in Mineralöl; rechts) während der juvenilen kritischen Phase. Ein erfahrungsabhängiger Innervationsschnitt tritt nur bei einer EB-Exposition im frühen Leben auf, wobei Synapsen eliminiert und Axone verloren gehen, was zu einem reduzierten Innervationsvolumen führt. (D) Repräsentative konfokale Bilder der Or42a OSN-Innervation der gepaarten synaptischen VM7-Glomeruli (gestrichelte weiße Umrisskreise; Or42a-mCD8::GFP, grün) nach der Kontrolle des Ölfahrzeugs (links) und 25 % EB-Exposition (rechts) für 24 h (0-1 dpe). Die Erfahrung mit dem EB-Odorant führt zu einer synaptischen Beschneidung und dem Verlust des Innervationsvolumens. Dieser erfahrungsabhängige Mechanismus ist zeitlich begrenzt und nur innerhalb einer genau definierten olfaktorischen kritischen Periode in den ersten Tagen nach der Eklosion vorübergehend reversibel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Quantifizierung der dosisabhängigen Intensität und des Volumens der Innervationsfluoreszenz der synaptischen Gloperuli. (A) Or42a-mCD8::GFP-markierte Innervation in einem synaptischen Glomerulus VM7 (grün), der von 0-1 dpe der Mineralölkontrolle des Odorierungsträgers (0 % EB, links), 15 % EB (Mitte) oder 25 % EB (rechts) ausgesetzt war. Unten: Die gleichen Bilder mit umrandeter glomerulärer Innervation (weiße Kreise) und dem berechneten 3-dimensionalen Innervationsvolumen. Die Vehikelkontrolle weist eine synaptische Glomerulus-Innervation von VM7 durch Or42a-Neuronen auf, die von den unbehandelten Tieren nicht zu unterscheiden ist. Kritische Periodenerfahrungen mit 15 % EB-Geruchsexposition führen zu einer offensichtlichen Beschneidung des synaptischen Glomerulus, in diesem Fall mit einer Abnahme des 3-dimensionalen Innervationsvolumens um 66 %. Die Exposition gegenüber dem höheren Niveau von 25 % EB führt zu einer stärkeren Beschneidung, in diesem Fall mit einem Verlust des synaptischen Glomerulusvolumens von fast 90 %. So kann man sich einen dosisabhängigen Schnitt vorstellen, wenn das Geruchserlebnis zunimmt. (B) Repräsentative Ergebnisse der Or42a-mCD8::GFP-markierten Fluoreszenzintensität in synaptischen VM7-Glomeruli, die von 0-1 dpe an die Kontrolle des Odorierungsmittels (Öl, grün), 15 % EB (Mitte, orange) oder 25 % EB (rechts, schwarz) exponiert wurden. (C) Repräsentative Ergebnisse der 3-dimensionalen Innervationsvolumina von VM7-Glomeruli unter den gleichen Bedingungen unter den gleichen Bedingungen der kritischen Periode der Odoriermittelexposition. Die Streudiagramme zeigen alle einzelnen Datenpunkte mit dem Mittelwert ± SEM. Die Signifikanz wird mit p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) und p ≤ 0,0001 (****) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll zur Exposition gegenüber Geruchsstoffen und zur Bildgebung des Gehirns kann verwendet werden, um die erfahrungsabhängige Beschneidung der synaptischen Glomeruli durch olfaktorische sensorische Neuronen während einer kritischen Phase im frühen Leben zuverlässig zu induzieren und zu quantifizieren. Frühere Studien, die dieses Behandlungsparadigma zur Erforschung des Umbaus des olfaktorischen Schaltkreises verwendeten, begannen mit der Geruchsexposition am 2^. Tag nach der Eklosion ^3,4,5. Im Gegensatz dazu beginnen wir mit der Exposition von Geruchsstoffen in pharaten Puppen vor der adulten Eklosion und stellen fest, dass der überwiegende Teil des Umbaus innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Eklosion stattfindet ^8,9. Ein wesentlicher Schritt in diesem Odorstoffexpositionsprotokoll besteht daher darin, inszenierte dunkle Puppen vor der Elosion in Geruchskammern zu legen (Abbildung 1). Dies gilt nicht für die Exposition von Puppen gegenüber Geruchsstoffen an sich, sondern um die Exposition gegenüber Geruchsstoffen unmittelbar nach der Auslösung bei Erwachsenen sicherzustellen. Wir wählten geschlossene juvenile adulte Erwachsene 4 Stunden nach dem Staging aus, um das Alter innerhalb eines engen Zeitfensters zu synchronisieren und Unterschiede in den Expositionszeiten von Geruchsstoffen zu vermeiden. Dieses frühere Erfahrungsintervall steht im Einklang mit neueren Studien, die zeigen, dass sich die Gewöhnung an den Geruchssinn von EB nach nur 2 Tagen nach der Eklosion schließt¹⁰. Die Folgen von zeitlichen Unterschieden bei der Exposition von Odorierstoffen innerhalb des kritischen Zeitraums (z. B. 0-1 vs. 1-2 Tage) wurden jedoch nicht gut charakterisiert. Or42a olfaktorische sensorische Neuronen innervieren selektiv den VM7-Glomerulus im Antennenlappen, was auf der Grundlage der präzisen glomerulären Karten und der gezielten Innervationsmarkierung (z. B. Or42a-mCD8::GFP; Abbildung 2). Die Exposition gegenüber EB-Odorstoffen während der kritischen Periode verändert weder die Or42a-Promotorexpression noch die Reporterspiegel⁸. Die zeitgesteuerte Exposition gegenüber Odorstoffen führt zu einer sequentiellen Synapseneliminierung und einem Verlust der Axoninnervation von Or42a-Rezeptorneuronen. Dieser Rückschnitt ist innerhalb der kritischen Phase im frühen Leben (0-2 dpe) vollständig reversibel, aber nicht in der adulten Reife (7-9 dpe), wenn Veränderungen in der Geruchsumgebung die Innervation nicht mehr verändern. Die enge zeitliche Begrenzung dieses sensorischen erfahrungsabhängigen Mechanismus ist eine wichtige offene Frage auf diesem Gebiet. Es werden viele Versuche unternommen, die kritische periodenhafte Plastizität bei der Reife wieder zu öffnen. Das hier gegebene Protokoll ist ein mächtiger Weg zur Untersuchung.

Die hier beschriebene Leichtigkeit des Protokolls für die Exposition gegenüber Geruchsstoffen und die Bildgebung des Gehirns ermöglichen eine breite Zugänglichkeit und eine breite Anpassungsfähigkeit. Der Beginn, die Beendigung und die Dauer der Geruchsstoffexposition liegen vollständig im Ermessen des Prüfarztes, um gezielte Untersuchungen der Eigenschaften kritischer Perioden, der Remodellierung der Reversibilität und der Wiedereröffnung der kritischen periodenähnlichen Plastizität zu ermöglichen. Ebenso kann die Stärke des Geruchsempfindens für die Untersuchung der dosisabhängigen synaptischen Glomeruli-Beschneidung leicht manipuliert werden (Abbildung 3). Wichtig ist, dass Studien, die niedrigere EB-Konzentrationen (z. B. 15 % EB) verwenden, verwendet werden können, um Manipulationen zu testen, die die Rate oder das Ausmaß des synaptischen Glomeruli-Umbaus verbessern könnten. Zum Beispiel könnten die Ergebnisse zeigen, dass synaptisches Pruning bei niedrigeren EB-Spiegeln (z. B. 15 %) nicht von höheren EB-Spiegeln (z. B. 25 %) zu unterscheiden ist. Über verschiedene Manipulationen hinweg können die Ergebnisse mit der konsistenten Innervation der Odormittel-Vehikel-Kontrollen und der robusten synaptischen Glomeruli-Beschneidung bei 25% EB verglichen werden (Abbildung 3). Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Exposition gegenüber Odoriermitteln vollständig von der Flüchtigkeit des gelösten Odoriermittels abhängt. Variable Faktoren wie Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit beeinflussen die Wirksamkeit der Odoriermittelexposition⁸. Die Fliegendichte in den Geruchskammern könnte sich möglicherweise auch auf die Geruchsstoffexposition auswirken, beispielsweise durch die Herstellung von Geruchsstoffen aus Fliegen. Es wird eine Dichte von nicht mehr als 20-25 Fliegen pro Fläschchen empfohlen. Die Geruchsstoffkonzentration, die erforderlich ist, um eine sehr starke synaptische Glomeruli-Beschneidung zu induzieren, ist wahrscheinlich höher als das, was typischerweise in der Natur zu beobachten ist^10,17. Wesentlich höher aufgelöste bildgebende Verfahren wären erforderlich, um die Synapsenelimination bei niedrigeren Odorantenkonzentrationen zu testen. Das derzeitige Protokoll erlaubt jedoch konsistente und zuverlässige Studien für eine Reihe von Manipulationen.

Dieses Protokoll zur Exposition gegenüber Geruchsstoffen und das Bildgebungsprotokoll des Gehirns bieten immense Vorteile. Drosophila ist ein enorm vorteilhaftes Tiermodell, das auf einem umfangreichen und ausgeklügelten genetischen Baukasten basiert, der systematisch für die umfassende Untersuchung der Gen-Umwelt-Wechselwirkungen beim Umbau kritischer olfaktorischer Schaltkreise genutzt werden kann. Beispiele hierfür sind die transgene Treiberlinie Or42a-Gal4, der UAS-mCD8::GFP-Membranmarker und die direkte Fusion von Or42a-mCD8::GFP. Es gibt keine unterscheidbaren Unterschiede zwischen dem synaptischen Glomeruli-Pruning mit der direkten Or42a-Fusion und den indirekten Gal4/UAS-Markierungsansätzen ^8,9. Der Or42a-Gal4-Treiber bietet die Möglichkeit, sowohl die anvisierten olfaktorischen Rezeptorneuronen zu manipulieren als auch erfahrungsabhängige Veränderungen in der VM7-Innervation sichtbar zu machen, während die direkte Fusionslinie das binäre transgene UAS-Gal4-System für andere zellspezifische Manipulationen freigibt. Viele andere mutierte und transgene Linien aus dem umfangreichen Drosophila-Toolkit können verwendet werden, um zeitliche Restriktions- und erfahrungsabhängige Mechanismen zu testen, einschließlich der Identifizierung von Zellen, die synaptisches Pruning vermitteln, der interzellulären Signalwege, die Informationen über olfaktorische Erfahrungen weiterleiten, und der intrazellulären Maschinerie, die für eine gezielte Synapseneliminierung erforderlich ist. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll die systematische Untersuchung vieler Mechanismen, die den Umbau von Geruchsstoffwechseln in Abhängigkeit von der Geruchserfahrung des Gehirns antreiben. Dieses Protokoll zur Exposition gegenüber Geruchsstoffen und zur Bildgebung des Gehirns kann auch verwendet werden, um kritische periodenspezifische Geruchserfahrungen, Verhaltensmodifikationen, genetische und pharmazeutische Manipulationen, die die Wiedereröffnung der kritischen periodenähnlichen Plastizität bei der Reife ermöglichen könnten, und andere Aspekte der Plastizität des Geruchskreislaufs über die Beschneidung der synaptischen Glomeruli hinaus zu untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
For Odor Exposure
Drosophila fläschchen	Genesee Scientific	32-110
Ethylbutyrat	Sigma Aldrich	E15701
Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Wissenschaftlich	05-408-129
Mineralöl	Sigma Aldrich	M3516
Geruchskammern	Glasslock
Pinsel	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Drahtgeflecht	Scienceware	378460000<
strong>Brain Dissection
Ethanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Verdünnt auf 70%
Pinzette	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskop Wissenschaften	157-8	Verdünnt auf 4%
Petrischalen	Fisher Scientific	08-757-100B
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Verdünnt auf 1x
Saccharose	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Elektronenmikroskop Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488	Anti-Hühner-Invitrogen	A11039
546 Anti-Ratte	Invitrogen	A11081
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	A9647
Huhn Anti-GFP	Abcam	13970
Deckgläser	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Doppelseitiges Klebeband	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Elektronenmikroskop Sciences	17984-25
Objektträger	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Nagellack	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normales Ziegenserum	Sigma Aldrich	G9023
Ratte Anti-CadN	Entwicklungsstudien Hybridom Bank	AB_528121
Konfokal/Analyse
Jeder Computer/Laptop
Konfokalmikroskop	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fidschi Software	Fidschi		Version 2.14.0/1.54f