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Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

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DOI:

10.3791/66631

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8. März 2024

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1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zusammenfassung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Dieser Prozess ist entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns, und seine Fehlregulation kann zu neurologischen Entwicklungsstörungen und psychiatrischen Störungen nach der Geburt führen. Tatsächlich wurde festgestellt, dass viele Gene, die für diese Krankheiten verantwortlich sind, an diesem Prozess beteiligt sind, und daher ist es wichtig zu zeigen, wie diese Mutationen die zelluläre Dynamik beeinflussen, um die Pathogenese dieser Krankheiten zu verstehen. Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in Hirnschnitten vor, die aus Mausembryonen gewonnen wurden. Die Zellen werden mit fluoreszierenden Proteinen mittels In-utero-Elektroporation markiert, die die Migration einzelner Zellen aus der ventrikulären Zone mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert. Darüber hinaus ermöglicht uns dieses in vivo Gentransfersystem die einfache Durchführung von Gain-of-Function- oder Gain-of-Function-Experimenten an den gegebenen Genen durch Co-Elektroporation ihrer Expressions- oder Knockdown/Knockout-Vektoren. Mit diesem Protokoll können das Migrationsverhalten und die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen analysiert werden, Informationen, die niemals von festen Gehirnen gewonnen werden.

Einleitung

Während der Entwicklung der Großhirnrinde produzieren die (apikalen) radialen Gliazellen in der pallidialen ventrikulären Zone (VZ), die den lateralen Ventrikel auskleiden, zuerst Neuronen und dann gliale Vorläuferzellen mit einer gewissen Überlappung der Periode1. Neuronen werden auch aus intermediären Vorläuferzellen oder basalen radialen Gliazellen in der an die VZ angrenzenden subventrikulären Zone (SVZ) erzeugt, die beide aus den (apikalen) radialen Gliazellen stammen 2,3. Bei Mäusen produzieren radiale Gliazellen nur Neuronen am Embryonaltag (E) 12-14, sowohl Neuronen als auch gliale Vorläuferzellen an E15-16 und gliale Vorläuferzellen ab E174. Die Hauptpopulation von Gliavorläuferzellen, die in diesen embryonalen Stadien erzeugt werden, differenziert sich bevorzugt in Astrozyten, obwohl sich einige Zellen auch in Oligodendrozyten differenzieren5. Neuronen und Astrozyten-Vorläuferzellen, die in diesen Stadien gebildet werden, wandern zur Gehirnoberfläche und gelangen in die kortikale Platte (zukünftige kortikale graue Substanz). Die neuronale Migration von der VZ zur kortikalen Platte erfolgt in mehreren Phasen. Neuronen nehmen zunächst eine multipolare Morphologie knapp über der multipolaren Zellakkumulationszone (MAZ) an, die die SVZ oder Zwischenzone überlappt, wo sie mehrere dünne Prozesse kräftig aus- und zurückziehen und langsam wandern (multipolare Migration)6,7. Nach etwa 24 Stunden verwandeln sich die Neuronen in eine bipolare Morphologie, die einen dicken Führungsfortsatz zur Gehirnoberfläche und einen dünnen Nachlauffortsatz nach hinten verlängert und linear zur Hirnoberfläche wandert, wobei ein radialer Prozess verwendet wird, der sich von der radialen Gliazelle bis zur Pialoberfläche als Gerüst erstreckt und als Lokomotionsmodusbezeichnet wird 2,8. Da Neuronen im Fortbewegungsmodus immer die äußerste Oberfläche der kortikalen Platte erreichen und ihre Vorgänger knapp unterhalb der Marginalzone durchlaufen, sind die Neuronen in der kortikalen Platte 9,10,11 geburtsdatumsabhängig von innen nach außen ausgerichtet.

Im Gegensatz dazu wandern Astrozyten-Vorläuferzellen schnell in die Zwischenzone und die kortikale Platte, mit häufigen Richtungswechseln. Dieses Migrationsverhalten unterscheidet sich grundlegend von der neuronalen Migration und wird als unregelmäßige Migrationbezeichnet 5. Astrozyten-Vorläuferzellen wandern auch entlang der Blutgefäße, in einem Prozess, der als blutgefäßgesteuerte Migration bezeichnet wird. Astrozyten-Vorläuferzellen wechseln zwischen diesen Migrationsmodi und erreichen die kortikale Platte 5,12. Obwohl die Positionierung von Astrozyten nicht streng durch ihr Entstehungsdatum bestimmt ist, wurde eine leichte Tendenz bei frühgeborenen Astrozyten beobachtet, sich im oberflächlichen Teil der kortikalen Platteanzusiedeln 5. Interessanterweise werden Astrozyten, die sich in der kortikalen Platte ansiedeln, in embryonalen Stadien erzeugt und differenzieren sich schließlich zu protoplasmatischen Astrozyten, während postnatal erzeugte Astrozyten nicht aktiv wandern, in der weißen Substanz verbleiben und sich in fibröse Astrozyten differenzieren5. Wie diese stadienabhängige Spezifizierung astrozytärer Subtypen zustande kommt, bleibt unklar.

Eine wachsende Anzahl von Genen, die an der neuronalen Migration beteiligt sind, wurde identifiziert, einschließlich solcher, die an neurologischen Entwicklungsstörungen und psychiatrischen Störungen beteiligt sind13,14. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen von Mutationen in diesen Genen auf das Verhalten migrierender Neuronen aufzuklären. Wie bereits erwähnt, verläuft die neuronale Migration in mehreren Phasen. Zeitrafferbeobachtungen können direkt bestimmen, welche Phase hauptsächlich betroffen ist (Zellzyklusaustritt, multipolar-bipolarer Übergang, Migrationsgeschwindigkeit der Fortbewegung, etc.). Die molekularen Mechanismen, die der Spezifizierung, Migration und Positionierung von Astrozyten zugrunde liegen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Angesichts der Tatsache, dass Astrozyten eine entscheidende Rolle bei der Synaptogenese15 und der Bildung der Blut-Hirn-Schranke während der Gehirnentwicklung spielen16, können Entwicklungsdefekte in Astrozyten zu neurologischen Entwicklungsstörungen führen. Zeitrafferstudien an Astrozyten-Vorläuferzellen können diese molekularen Mechanismen und ihre Beziehung zu psychischen Erkrankungen klären.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Zeitrafferbeobachtung von kortikalen VZ-abgeleiteten Zellen. Ein ähnliches Videoprotokoll zur Beobachtung der neuronalen Migration wurde bereits veröffentlicht17. Hier beschreiben wir die Methode sowohl für die Migration von Neuronen als auch für Astrozyten-Vorläuferzellen. Um diese Zellen mit fluoreszierenden Proteinen, wie z. B. grün und rot fluoreszierenden Proteinen (GFP und RFP), zu markieren, werden Plasmidgemische, die geeignete Komponenten enthalten, durch In-utero-Elektroporation in den entsprechenden Stadien 18,19,20,21 in die kortikale VZ eingebracht. Die manipulierten Embryonen werden in den gewünschten Stadien entnommen, die Gehirne werden in Scheiben geschnitten und für Zeitrafferbeobachtungen mit einem Laser-Scanning-Mikroskop verwendet. Die Migrationsgeschwindigkeit, -richtung und andere Verhaltensweisen, die niemals mit festen Gehirnproben behandelt werden, können mit dieser Methode untersucht werden. Durch die Verwendung von In-utero-Elektroporation können Expressions- und Knockdown-/Knockout-Vektoren leicht gleichzeitig mit fluoreszierenden Proteinvektoren übertragen werden, was es uns ermöglicht, Funktionsgewinn- und Funktionsverluststudien spezifischer Gene durchzuführen.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Animal Care and Use Committee des Institute for Developmental Research, des Aichi Developmental Disability Center (#2019-013) und der Keio University (A2021-030) durchgeführt. Zeitlich trächtige ICR-Mäuse (Wildtyp) wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle). Um den Zusammenhang zwischen wandernden Zellen und Blutgefäßen zu beobachten, wurden Flt1-DsRed-Mäuse verwendet, bei denen die Endothelzellen DsRed22 exprimieren. Männliche Flt1-DsRed-Mäuse wurden mit weiblichen ICR-Mäusen gekreuzt (beide Mäuse waren im Alter von 8-24 Wochen). Alle Tiere wurden bis zur Probenahme unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht und manipuliert. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. In-utero-Elektroporation

  1. Bereiten Sie HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) vor, indem Sie ein gleiches Volumen autoklaviertes Wasser zu handelsüblichen 2x HBS hinzufügen.
  2. Es gibt zwei Möglichkeiten der Anästhesie; Isofluran (Inhalation) und MMB (Injektion). Wenn Sie MMB verwenden, bereiten Sie es wie folgt vor. Fügen Sie 0,75 ml Medetomidin (1 mg/ml), 2 ml Midazolam (5 mg/ml) und 2,5 ml Butorphanol (5 mg/ml) in 19,75 ml autoklaviertem Wasserhinzu 23.
    HINWEIS: Diese Anästhesielösung wird innerhalb von 2 Monaten weniger aktiv. Bei 4 °C mit Lichtschutz lagern.
  3. Bereiten Sie Atipamezol-Lösung vor. Verdünnen Sie 0,75 ml Atipamezol (5 mg/ml) mit 24,25 ml autoklaviertem Wasser.
  4. Bereiten Sie 0,2 % (w/v) Fast Green Lösung in autoklaviertem Wasser vor. Mit einem Filter (Porengröße 0,22 μm) sterilisieren.
  5. Das Plasmid ist unter Verwendung eines herkömmlichen Plasmidaufreinigungskits auf der Grundlage der alkalischen Lyse und der Säulenaufreinigung23 gemäß den Anweisungen des Herstellers herzustellen (siehe Materialtabelle). Das gereinigte Plasmid aus 100 mL Bakterienkultur wird in 30-50 μl HBS gelöst, um den Plasmidbestand (3-5 μg/μL) herzustellen (Ergänzende Datei 1).
    1. Mischen und verdünnen Sie die Plasmidbestände mit HBS und fügen Sie 1/10 Volumen von 0,2 % Fast Green hinzu, um das Injektor zu färben. Die Bestandteile und Endkonzentrationen der Plasmide werden entsprechend ihrem Verwendungszweck bestimmt (Tabelle 1).
  6. Stellen Sie die Mikropipetten her, indem Sie mit einem Pipettenabzieher an den Glaskapillaren ziehen.
    HINWEIS: Die Spitze der Pipette wird mit einer feinen Pinzette schräg abgeschnitten. Der Außendurchmesser der Spitze beträgt ca. 70 μm. Markieren Sie die Mikropipetten im Abstand von 2 μL, indem Sie 2 μl Wasser ansaugen.
  7. Injizieren Sie einer trächtigen Maus zu einem geeigneten Zeitpunkt (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen) ein MMB-Anästhetikum in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht intraperitoneal.
    HINWEIS: Die zu manipulierenden Embryonalstadien sollten je nach Verwendungszweck bestimmt werden. Um zukünftige II/III-Pyramidenneuronen zu markieren, eignet sich E14.5. Zur Markierung von Gliavorläuferzellen muss eine Elektroporation an E15-16 durchgeführt werden. Alternativ können die Mäuse durch Inhalation von Isofluran (1%-2%) betäubt werden.
  8. Nachdem die Maus tief betäubt wurde, legen Sie sie auf eine warme Platte bei 38 °C.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf das Einklemmen des Schwanzes reagiert.
  9. Nach der Entfernung des Fells um die Operationsstelle mit Enthaarungscreme desinfizieren Sie das Operationsgebiet mehrmals in kreisenden Bewegungen sowohl mit einem Peeling auf Jodbasis als auch mit 70% Alkohol. Machen Sie einen 2 cm langen Hautschnitt entlang der Mittellinie von der Höhe deszweithintersten Brustwarzenpaares nach vorne, gefolgt von einem 2 cm langen Schnitt in der Bauchdecke entlang der Linea alba (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Heben Sie die Bauchdecke beim Schnitt mit einer feinen Zange leicht an, um die inneren Organe nicht zu durchtrennen.
  10. Legen Sie eine sterile Plastikfolie auf die Haut und ein Stück steriles Seidenpapier darauf (Abbildung 1A). Erstellen Sie ein Loch in der Mitte, um den Operationsbereich freizulegen.
    HINWEIS: Die sterile Plastikfolie und das sterile Seidenpapier werden nach dem Schnitt platziert, da ein weites Sichtfeld erforderlich ist, um den Schnitt in Bezug auf die Position der Brustwarzen zu positionieren.
  11. Befeuchten Sie das Papier mit sterilem PBS, beobachten Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner vom Schnitt an und ziehen Sie das Gebärmutterhorn durch die Löcher der Plastikfolie und des Papiers heraus.
  12. Injizieren Sie mit einer Mikropipette, die an einer Aspiratorröhrchenanordnung befestigt ist, 1 μl der Plasmidmischung durch exspiratorischen Druck durch die Gebärmutterwand in den linken oder rechten Seitenventrikel (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Alternativ kann das Plasmid mit einem Mikroinjektor injiziert werden.
  13. Kneifen Sie den Kopf des Embryos mit einer Pinzettenelektrode zusammen und legen Sie elektronische Impulse mit einem Elektroporator an (35 V für E14-16, 50 V für E17, 50 ms Rechteckimpulse im Abstand von 450 ms, 5 Mal) (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Kneifen Sie den Kopf der Embryonen nicht stark ein, da dies die Embryonen beschädigen würde. Der tatsächliche Strom sollte 40-70 mA betragen.
  14. Setzen Sie das Gebärmutterhorn wieder in die Bauchhöhle ein.
  15. Nähen Sie die Bauchdecke mit einem 5-0 Seidenfaden.
  16. Tragen Sie Atipamezol-Lösung in einer Dosis von 10 μl/g Körpergewicht intraperitoneal auf.
  17. Nähen Sie die Haut mit einem 5-0 Seidenfaden.
    HINWEIS: Die Haut kann mit einem Autoclip geschlossen werden.
  18. Halten Sie die manipulierten Mäuse mindestens 30 Minuten lang auf einer warmen Platte. Die Mäuse beginnen sich im Käfig zu bewegen.
    HINWEIS: Das Verfahren der In-utero-Elektroporation (von den Schritten 1.7 bis 1.16) sollte innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden. Die typische Betriebszeit beträgt 20 Minuten.

2. Vorbereitung der Scheiben

HINWEIS: Die Frische der Scheiben ist der Schlüssel zum Erfolg dieses Experiments. Die Scheiben müssen innerhalb von 2 h (aus den Schritten 2.5-2.12) vorbereitet werden.

  1. Bereiten Sie die ausgewogene Salzlösung der Hanks mit Ca2+ und Mg2+ zu; HBSS(+). 5 mL CaCl2 (14 g/L, autoklaviert) und 5 mL MgSO 4,7H2O (20 g/L, autoklaviert) zu 500 mL HBSS(-) hinzufügen. Bei 4 °C lagern. Die Lösung vor Gebrauch 5 min lang mit 95 %O2 + 5 % CO2 -Gas auf Eis sprudeln.
  2. Bereiten Sie das Nährmedium vor. Es werden mindestens 2,5 ml/Schale benötigt. Fügen Sie 2 ml fötales Rinderserum, 25 μl L-Glutamin (200 mM), 200 μl B27 (50x), 50 μl Penicillin + Streptomycin (10 K Einheiten/ml und 10 mg/ml) zu 8 ml Neurobasalmedium hinzu.
  3. Bereiten Sie Agarosegel mit 3 % niedriger Schmelztemperatur vor. Porieren Sie 50 mL HBSS(+), fügen Sie dann 1,5 mg Agarose bei niedriger Schmelztemperatur hinzu und autoklavieren Sie es. Die Agarose in der Mikrowelle schmelzen und vor der Verwendung bei 50 °C in einem Wasserbad-Inkubator aufbewahren.
  4. Geben Sie 1,9 ml Nährmedium in eine Glasbodenschale. Setzen Sie vorsichtig einen Zellkultureinsatz darauf auf, um Luftkolben nicht unter dem Filter einzuschließen, und geben Sie dann 500 μl Kulturmedium auf den Filter (Abbildung 1B). Lege es auf Eis.
  5. Nach der Betäubung der manipulierten Mäuse durch Inhalation von 5% Isofluran werden sie durch Zervixluxation (nach institutionell anerkannten Protokollen) in geeigneten Stadien getötet, um sie zu beobachten.
    HINWEIS: Zwei Tage (48 h) bzw. 3 Tage nach der Elektroporation bei E14,5 sind für die Beobachtung des multipolar-bipolaren Übergangs bzw. des Fortbewegungsmodus geeignet.
  6. Nehmen Sie die Embryonen heraus und legen Sie sie in eine Petrischale mit kaltem PBS.
  7. Selektieren Sie die Embryonen durch die Expression von GFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen unter einem Mikroskop.
  8. Nach der Enthauptung der Embryonen wird das Gehirn6 unter einem Präpariermikroskop präpariert und in kaltem HBSS(+) aufbewahrt.
  9. Gießen Sie das geschmolzene Agarosegel mit einer niedrigen Schmelztemperatur von 3 % in ein Kryomold (siehe Materialtabelle), legen Sie dann die Gehirne hinein und rollen Sie sie mehrmals. Stelle es bei Raumtemperatur auf, bis die Agarose vollständig fest geworden ist, und lege es dann auf Eis.
  10. Schneiden Sie das Gehirn mit einem vibrierenden Mikrotom in einer Dicke von 350 μm koronal auf (siehe Materialtabelle).
  11. Ordnen Sie die Scheiben auf dem Filter an (maximal 6 Scheiben pro Filter).
  12. Ziehen Sie das Nährmedium von der Innen- und Außenseite des Filterbechers (insgesamt 600 μl) heraus. In diesem Schritt werden die Scheiben gepresst und auf einem Filter fixiert. Geben Sie nach 5 Minuten 100 μl Kulturmedium in die Innenseite des Zellkultureinsatzes.

3. Zeitraffer-Bildgebung

  1. Halten Sie die Kulturkammer mindestens 30 Minuten vor der Bildgebung auf dem Tisch eines inversen Laserscan-Mikroskops bei 37 °C mit der Heizung der Kammer oder einer Haube, die das Mikroskop umschließt, montiert, um eine Z-Drift zu vermeiden. Geben Sie befeuchtetes 5 % CO2 + 40 % O2 -Gas in die Kulturkammer.
  2. Stellen Sie die Kulturschale mit den oben vorbereiteten Scheiben in die Kulturkammer.
  3. Mit einem 20-fachen Objektiv mit großem Arbeitsabstand (NA = 0,45) können Sie etwa 10 Z-Stapel-Bilder mit 5-μm-Schritten alle 15-30 Minuten für 24 Stunden aufnehmen.
    HINWEIS: Die Verwendung eines motorisierten XY-Tisches wird dringend empfohlen. Dies ermöglicht es uns, Bilder aus mehreren objektiven Bereichen zu erhalten. In der Regel erhalten wir in einem Zeitraffer-Experiment 10-20 Bilder aus verschiedenen Objektivfeldern.

4. Bildgebende Analyse

  1. Konvertieren Sie XYZT-Bilder in XYT durch die maximale Projektion der Z-Achse mit ImageJ oder einer anderen Software.
    HINWEIS: Wenn die Schichten während der Beobachtung verschoben wurden, passen Sie die Position der Zellen in den Bildern mit StackRed an, einem ImageJ-Plug-in mit seiner Funktion der Steifkörpertransformation (siehe Materialtabelle).
  2. Verfolgen Sie die Flugbahn von GFP- oder anderen fluoreszierenden Protein-positiven Zellen entweder manuell oder automatisch. Manuelles und automatisches Tracing kann mit MTrackJ24 bzw. TrackMate 25,26 (ImageJ-Plugins) durchgeführt werden. Die automatische Rückverfolgung mit TrackMate ist effizient, um viele Zellen unvoreingenommen zu analysieren. Die manuelle Rückverfolgung mit MTrackJ bleibt jedoch nützlich, um einzelne Zellen genau zu verfolgen.

Ergebnisse

Radiale Gliazellen in der pallialen VZ produzieren nur Neuronen bis E14 und sowohl Neuronen als auch Gliazellen bei E15 und E16. Um das Migrationsverhalten von Neuronen und Gliazellen gleichzeitig zu beobachten, haben wir sie mit verstärktem GFP (EGFP) bzw. RFP markiert, indem wir einen neuronenspezifischen Promotor, den Tα1-Promotor27, und den humanen humanen sauren Gliafibrillenprotein (hGFAP)-Promotor28 verwendeten, der bevorzugt in Astrozyten aktiviert wird. Astrozyten-Vorläuferzellen wiederholen die Zellteilung während der Migration, was zu einer Verdünnung des Plasmids in den Zellen führt. Um dies zu vermeiden, wurde ein Transposon-Vektorsystem bestehend aus einem Donorplasmid (pPB) und einem Transposase-Expressionsvektor (pCAG-hyPBase) verwendet29,30. Das hier verwendete Donorplasmid (pPB-CAG-LNL-RFP) hat eine loxP-neo-loxP (LNL)-Kassette und exprimiert RFP in Abhängigkeit von der Cre-Rekombinase. ICR-Mäuse (Wildtyp; WT) wurden mit den in Abbildung 2A angegebenen Plasmiden bei E15 elektroporiert, und die Schnitte wurden 3 Tage später präpariert. Während dieser Zeit erreichte die erste Kohorte von EGFP+-Neuronen die Oberfläche der kortikalen Platte (Abbildung 2B), aber viele EGFP+-Neuronen wanderten immer noch. Die Zeitrafferbeobachtung wurde 24 Stunden lang durchgeführt. Während dieser Beobachtung wanderten Neuronen mit einem dicken Führungsfortsatz linear in Richtung Gehirnoberfläche mit einer relativ konstanten Geschwindigkeit in der kortikalen Platte (19,54 ± 6,21 μm/h, mittlere ± Standardabweichung, 70 Zellen). Die Migrationspfade wurden automatisch mit der TrackMate-Software verfolgt (magentafarbene Linien in Abbildung 2B). Im gleichen objektiven Feld wurden Astrozyten-Vorläuferzellen mit RFP sichtbar gemacht (Abbildung 2C). Da der hGFAP-Promotor auch in radialen Gliazellen in späten embryonalen Stadien aktiv ist, exprimieren einige Neuronen, die von diesen radialen Gliazellen abgeleitet sind, auch RFP (blaue Pfeile in Abbildung 2B, C). Diese Neuronen werden fast immer mit einem EGFP-Expressionsvektor transfiziert. Daher wurden Astrozyten-Vorläuferzellen als RFP-einfach-positive Zellen identifiziert.

Im Gegensatz zu Neuronen wandern Astrozyten-Vorläuferzellen schnell und zufällig mit häufigen Richtungsänderungen innerhalb der Zwischenzone und der kortikalen Platte (unregelmäßige Migration)5. Die Migration der Astrozyten-Vorläuferzellen wurde manuell mit der MTrackJ-Software verfolgt (magentafarbene Linien in Abbildung 2C), die ihre hohe Beweglichkeit (88,37 ± 33,61 μm/h, 5 Zellen) zeigte. Um die Beziehung zwischen Astrozyten-Vorläuferzellen und Blutgefäßen zu beobachten, wurden Flt1-DsRed-Mäuse verwendet, die DsRed, ein RFP, in Endothelzellen exprimieren. In diesem Experiment sollten die Astrozyten-Vorläuferzellen nur durch EGFP identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde das rDIO-System5 entwickelt, in dem die EGFP-Expression in Abhängigkeit von hGFAP-Cre in Neuronen durch Verwendung eines Dcx-Promotors (eines frühen neuronenspezifischen Promotors)31-abhängigen Aktivierung eines anderen Satzes von DNA-Rekombinase und ihrer Erkennungssequenz (Dre-rox) eliminiert werden kann (Abbildung 2D, die Sequenz von pPB-CAG-rDIO-EGFP ist in der Ergänzungsdatei 1 enthalten)32, 33. Urheberrecht Das rDIO-System wurde durch In-utero-Elektroporation in die Flt1-DsRed-Maus bei E15 eingeführt, und die Schnitte wurden 24 Stunden später vorbereitet. Als Ergebnis wurde beobachtet, dass die EGFP-positiven Astrozyten-Vorläuferzellen aktiv entlang der Blutgefäße wanderten (Blutgefäß-gesteuerte Migration)5 (Abbildung 2E).

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Abbildung 1: Ablauf von Zeitrafferbeobachtungen von Zellen, die durch In-utero-Elektroporation markiert wurden. (A) Eine trächtige Maus wird in einem geeigneten Stadium betäubt und die Bauchhöhle aufgeschnitten. Das Operationsgebiet ist mit sterilem Kunststoff und sterilen Papierbögen abgedeckt. Die Gebärmutterhörner werden freigelegt, und den Embryonen wird 1 μl Plasmidmischung injiziert und elektronische Impulse angelegt. Die Bauchdecke und die Haut werden vernäht, und die manipulierten Mäuse werden wieder in den Heimkäfig gesetzt. (B) Scheiben, die aus elektroporierten Gehirnen hergestellt wurden, werden auf den Filter des Zellkultureinsatzes (maximal 6 Scheiben) in einer Glasbodenschale gelegt. Die Glasbodenschalen mit den Scheiben sind in einer Kulturkammer montiert. Dieses Zeitraffersystem verfügt über eine Acrylhaube, die das gesamte Mikroskop abdeckt, um die Temperatur auf 37 °C zu halten. Die Kulturkammer, in der befeuchtetes Mischgas zugeführt wird, ist mit einem Mikroskoptisch im Inneren der Haube ausgestattet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Zeitrafferbeobachtungen von Neuronen und Astrozyten-Vorläuferzellen. (A) Methode zur differentiellen Markierung von Neuronen (EGFP, grün) und Astrozyten-Vorläuferzellen (RFP, rot) und ein repräsentatives Bild eines Schnitts, der 2 Tage nach der Elektroporation 2 h nach Beginn der Zeitraffer-Bildgebung aufgenommen wurde (rechts). (B,C) Zeitrafferbilder von EGFP+ (B) und RFP+ Zellen (C) auf demselben objektiven Feld (siehe (A) - rechts von 2 h bis 21 h Beobachtung. (B) Die Trajektorien von EGFP+ -migrierenden Zellen, die von der TrackMate-Software automatisch erkannt wurden, wurden in Magenta dargestellt. (C) Die Trajektorien der RFP+ -Zellen wurden manuell mit der MTrackJ-Software verfolgt. Doppelt positive EGFP/RFP-Zellen, von denen angenommen wird, dass es sich um Neuronen handelt, sind durch blaue Pfeile gekennzeichnet. (D) Markierungsstrategie von Astrozyten-Vorläuferzellen unter Verwendung des rDIO-Systems in Flt1-DsRed-Mausembryonen. (E) Repräsentatives Ergebnis der Blutgefäß-gesteuerten Migration. Eine Zelle (Pfeil) ragte aus einem führenden Fortsatz (Pfeilspitze) hervor und wanderte entlang des DsRed-exprimierenden Blutgefäßes (magenta) in Richtung der Pialoberfläche. CP; kortikale Platte. IZ; Zwischenzone. VZ; ventrikuläre Zone. Maßstabsleisten: 200 μm (A–C), 50 μm (E). Diese Abbildung ist eine Adaption von Tabata H. et al.5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Neuronen (Schichten II/III)Astrozyten-VorläuferzellenrDIO-System
(Astrozyten-spezifische Markierung)
pCAG-EGFP0,5 μg/μLpPB-CAG-LNL-EGFP0,5 μg/μLpPB-CAG-rDIO-EGFP0,5 μg/μL
oder Ta1-EGFP (spezifischer für Neuronen)0,5 μg/μLhGFAP-Cre0,75 μg/μlhGFAP-Cre0,75 μg/μl
pCAG-hyPBase0,5 μg/μLpDcx-Dre0,5 μg/μL
pCAG-hyPBase0,5 μg/μL

Tabelle 1: Repräsentative Komponenten der Plasmidmischung für jedes Ziel. EGFP-Vektoren können durch äquivalente RFP oder andere fluoreszierende Proteinexpressionsvektoren ersetzt werden. Zur Markierung von Astrozyten-Vorläuferzellen wird ein Transposon-Vektorsystem verwendet. pPB-Vektoren sind PiggyBac-Transposon-Vektoren für die Genomintegration. pCAG-hyPBase ist ein PiggyBac-Transposase-Expressionsvektor. LNL ist eine loxP-neo-loxP-Kassette für die Cre-abhängige Expression. rDIO-EGFP ist eine Cre-loxP- und Dre-roxP-abhängige On/Off-Kassette der EGFP-Expression. Um den Funktionsgewinn- oder -verlust-Phänotyp gewünschter Gene zu beobachten, können Expressionsvektoren oder Knockdown-Vektoren bei 1 μg/μl hinzugefügt werden. Die Konzentration dieser Vektoren sollte jeweils angepasst werden.

Ergänzende Datei 1: Plasmidsequenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Mit diesem Protokoll wurde eine Methode zur Zeitrafferbeobachtung von Zellen eingeführt, die von der pallialen (kortikalen) VZ abstammen. Um die migrierenden Zellen aus der VZ zu markieren, verwendeten wir die in utero-Elektroporation, bei der einzelne Zellen eindeutig mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis markiert wurden als bei der viralen Vektor-vermittelten Markierung. Mit Hilfe der In-utero-Elektroporation kann jede Art von Vektor in beliebiger Kombination leicht in die radialen Gliazellen (neurale Stammzellen) in lebenden Embryonen eingeführt werden. Neuronen und gliale Vorläuferzellen können selektiv mit verschiedenen Promotoren markiert werden. Da die Kopienzahl der durch In-utero-Elektroporation eingeführten Plasmide hoch ist, können Gain-of-Function- und Loss-of-Function-Studien leicht durch Co-Elektroporation von GFP-Expressionsvektoren und verschiedenen Vektoren, die mit den interessierenden Genen in Verbindung stehen, wie z. B. Expressionsvektoren und Knockdown/Knockout-Vektoren, durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die In-utero-Elektroporation verwendet werden, um Plasmidvektoren in die VZ verschiedener anderer Gehirnregionen als der kortikalen VZ einzuführen, was es uns ermöglicht, die Migration anderer Zelltypen wie inhibitorische Neuronen, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus ganglionären Eminenzen 34,35,36 und hippokampale Pyramidenneuronen 37 zu beobachten.

In Zeitrafferstudien können die Auswirkungen von Gain-of-Function- und Suffer-of-Function-Experimenten auf das Zellverhalten mit der Software TrackMate und MTrackJ evaluiert werden. Viele Gene, darunter auch solche, die für neurologische Entwicklungsstörungen und geistige Behinderungen verantwortlich sind, sind an der neuronalen Migration beteiligt. Zeitrafferstudien können direkt zeigen, wie diese Gene das Zellverhalten regulieren. Im Vergleich zur neuronalen Migration sind die molekularen Mechanismen der Gliazellmigration noch nicht gut verstanden. Diese Methode kann nicht nur die normale Entwicklung von Gliazellen aufdecken, sondern auch die genetischen und umweltbedingten Faktoren, die die Gliaentwicklung und ihre Beziehung zu psychischen Erkrankungen beeinflussen können.

Die Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie unweigerlich von der In-vitro-Schnittkulturmethode abhängt. Interessanterweise verlieren wandernde Neuronen keine Richtungshinweise für die Migration zur Gehirnoberfläche, selbst in Schnitten, die in vitro kultiviert wurden. Die Ermittler müssen jedoch vorsichtig mit Artefakten umgehen. Zellen in der Nähe der Oberfläche sind am Filter befestigt, und die Kanten der Schichten lassen sich leicht verformen. Diese Zellen sollten von der Analyse ausgeschlossen werden. Kontrollversuche sollten nach Möglichkeit in Betracht gezogen werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Hirnschnitte die normale Entwicklung innerhalb von ca. 24 h rekapitulieren. Daher sollte der Zeitpunkt der Schnittvorbereitung aus der Elektroporation so bestimmt werden, dass die zu analysierenden Ereignisse in diesem Zeitfenster auftreten. Um den multipolar-bipolaren Übergang zu beobachten, sollten die Schnitte 2 Tage nach der Elektroporation vorbereitet werden. Um die Migration im Fortbewegungsmodus zu analysieren, ist 3 Tage später geeignet. Die Beobachtung der blutgefäßgesteuerten Migration ist eine schwierigere Aufgabe als die anderer Experimente. Die Endothelzellen werden leicht in Scheiben ohne Blutfluss abgebaut. Um den Abbau der Blutgefäße zu minimieren, sollten die Scheiben so schnell wie möglich vorbereitet und in einem Medium aufbewahrt werden, das 20 % Serum und 40 % O2 -Gas enthält. Andere komplementäre Experimente, wie z. B. histologische Analysen von fixierten Gehirnen oder in vivo Live-Bildgebung mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie, können die Beobachtungen aus Schicht-Zeitraffer-Analysen verstärken.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode die einzige Möglichkeit ist, das Zellverhalten 24 h lang zu beobachten. Mit der Entwicklung neuartiger Plasmidvektoren wird sich das Anwendungsspektrum dieser Methode in Zukunft weiter erweitern.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Tα1 Promoter ist ein Geschenk von P. Barker und F.D. Miller. Der Dcx-Promoter ist ein Geschenk von Q. Lu. hGFAP-Cre war ein Geschenk von Albee Messing. Das PiggyBac-Transposon-Vektorsystem wurde vom Sanger Institute zur Verfügung gestellt. Flt1-DsRed-Mäuse wurden von M. Ema (Shiga University) zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (Fördernummer JP21K07309 an H. Tabata, JP20H05688 und JP22K19365 an K. Nakajima) und der Takeda Science Foundation, dem Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, dem Keio Gijuku Academic Development Funds für K. Nakajima.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AbsaugschlauchDrummond2-040-000
Atipamezol (5 mg/ml)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27 ErgänzungGibco17504-044
Butorphanol (5 mg/ml)MeijiVetorphale
ZellkultureinsatzMilliporePICM ORG 50
KonfokalmikroskopNikonA1RHD25Ausgestattet mit einem Objektiv mit langem Arbeitsabstand (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
KulturkammerTokkenTK-NBCMPMaßgeschneiderter
ElektroporatorNEPA GeneNEPA21
Fast GreenSigma-AldrichF7258
GasmischerTokkenTK-MIGM01-02
GlasbodenschaleIwaki3910-035Durchmesser des Glasbodens beträgt 27 mm
GlaskapillarenNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
HeizeinheitTokkenTK-0003HU20Sonderanfertigung, inklusive Haube und Heizung
hGFAP-CreAddgene#40591Ein Geschenk von Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030
Niedrige SchmelztemperaturAgarose Lonza50100
Medetomidin (1 mg/ml)MeijiMedetomin
MikroinjektorNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/ml)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Neurobasales MediumGibco21103-049
pCAG-hyPBaseDie hyPBase-cDNA aus pCMV-hyPBase (ein Geschenk des Sanger Instituts) wurde in den Downstream des CAG-Promotors von pCAGGS (ein Geschenk von J. Miyazaki) eingefügt.
pDcx-DreDer Dcx-Promotor von Dcx4kbEGFP70 (ein Geschenk von Q. Lu) wurde mit dem CAG-Promotor von pCAG-NLS-HA-Dre34 (ein Geschenk von Pawel Pelczar, Addgene #51272) getauscht.
Penicillin + StreptomycinGibco15140122
Plasmid-AufreinigungskitInvitrogenPureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit (K210005)
pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL Kassette von pCALNL-DsRed (ein Geschenk von Connie Cepko, Addgene #13769) und TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) wurden in die Klonierungsstelle von pPB-CAG.EBNXN (ein Geschenk des Sanger Institute) eingefügt.
pPB-CAG-rDIO-EGFPDie Sequenz, die synthetische Rox-Stellen, eine synthetische DIO-Kassette und EGFP-cDNA von pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in umgekehrter Richtung enthält, wurde in die Klonierungsstelle von pPB-CAG.EBNXN eingefügt (ein Geschenk des Sanger Instituts). Die Reihenfolge finden Sie in der Zusatzdatei.
AbzieherNarishigePN-31
StackRedein Plugin für ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
NahtnadelNazmeC-24-521-R Nr.11/2 Kreis, Länge 14 mm
NahtfadenNazmeC-23-B2Silk, Größe 5-0
Zeitgesteuerte schwangere ICR (Wildtyp) MäuseJapan SLCICR Maus
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
Pinzetten-ElektrodeBEX oder NEPA GenCUY650P5 
TΑ 1-EGFPEGFP cDNA aus pEGFP-N1 (Clontech, U55762) wurde in den Downstream des Tα 1 Promotor in Plasmid 253 (ein Geschenk von P. Barker und F.D.Miller)
Vibrierendes MikrotomLeica oder ZeissMikrotom mit vibrierender Klinge VT1000S oder Hyrax V50.

Referenzen

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