Methodenartikel

Eine modifizierte Technik zur Induktion des polyzystischen Ovarialsyndroms bei Mäusen

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DOI:

10.3791/66637

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5. Juli 2024

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1Obstetrics and Gynecology Hospital, Institute of Reproduction and Development, Fudan University, 2Women's Hospital, Key Laboratory of Reproductive Genetics (Ministry of Education), Zhejiang University School of Medicine, 3International Institutes of Medicine, the Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 4Research Units of Embryo Original Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences (No. 2019RU056), 5State Key Laboratory of Cardiology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Induktion von Modellen des polyzystischen Ovarialsyndroms (PCOS) bei Mäusen durch kontrollierte Letrozolfreisetzung mit Minipumpen vor. Unter adäquater Anästhesie wurde die Minipumpe subkutan implantiert, und PCOS wurde bei den Mäusen nach einer bestimmten Zeit der Freisetzung der Minipumpe erfolgreich induziert.

Zusammenfassung

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine der Hauptursachen für Unfruchtbarkeit bei Frauen. Tiermodelle werden häufig verwendet, um die ätiologischen Mechanismen von PCOS zu untersuchen und für die damit verbundene Arzneimittelentwicklung. Letrozol-induzierte Mausmodelle replizieren die metabolischen und reproduktiven Phänotypen von Patienten mit PCOS. Die traditionelle Methode der Letrozol-Behandlung bei PCOS-Mäusen erfordert eine tägliche Dosierung über einen bestimmten Zeitraum, die arbeitsintensiv sein und die Mäuse erheblich belasten kann. Diese Studie beschreibt eine einfache und effektive Methode zur Induktion von PCOS bei Mäusen durch Implantation einer kontrollierten Letrozol-freisetzenden Minipumpe. Eine Minipumpe, die in der Lage ist, eine stabile und kontinuierliche Abgabe einer quantitativen Menge Letrozol zu gewährleisten, wurde hergestellt und unter Narkose subkutan in Mäuse implantiert. Diese Studie zeigte, dass das Mausmodell PCOS-Merkmale nach der Implantation von Letrozol-Minipumpen erfolgreich nachahmte. Die in dieser Studie verwendeten Materialien und Geräte sind für die meisten Labore leicht zugänglich und erfordern keine besondere Anpassung. Insgesamt stellt dieser Artikel eine einzigartige, einfach durchzuführende Methode zur Induktion von PCOS bei Mäusen vor.

Einleitung

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine der häufigsten Erkrankungen bei Frauen im gebärfähigen Alter1. Sie betrifft bis zu 18 % der Frauen weltweit und ist weltweit die Hauptursache für weibliche Unfruchtbarkeit 2,3. PCOS ist gekennzeichnet durch eine Reihe miteinander verbundener Fortpflanzungsanomalien, darunter eine gestörte Gonadotropinsekretion, chronische Anovulation, erhöhte Androgenproduktion und polyzystische Ovarialmorphologie4. Neben gynäkologischen Erkrankungen erhöht PCOS auch das Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen 5,6. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist die Ätiologie von PCOS nach wie vor unklar 7,8.

Um bessere Einblicke in die Pathogenese von PCOS zu erhalten und neuartige Therapien zu entwickeln, ist die Erstellung von Tiermodellen, die die menschliche Physiologie genau nachahmen, von enormer Bedeutung9. Zu den derzeit berichteten Nagetiermodellen von PCOS gehören unter anderem solche, die durch Behandlungen mit Testosteron, Letrozol und Östradiolvalerat induziert werden. Testosteron induziert Hyperandrogenämie und wird häufiger als PCOS-Induktor bei Ratten verwendet10. DHEA wurde verwendet, um PCOS bei Nagetieren zu induzieren, den Testosteronspiegel und das Verhältnis von LH/FSH (luteinisierendes Hormon / follikelstimulierendes Hormon) zu erhöhen und unregelmäßige Brunstzyklen zu verursachen11. Estradiolvalerat (EV) ist ein lang wirkendes Östrogen, und Studien mit dieser Methode zeigen, dass die Spiegel von Sexualsteroidhormonen und Gonadotropinen je nach der Dosis der verabreichten EV variieren 12,13,14. Letrozol ist ein nichtsteroidaler Aromatasehemmer15. Die Behandlung mit Letrozol induziert eine nicht-zyklische Brunst, erhöht das Eierstockgewicht und das Körpergewicht, vergrößert die Adipozyten, maximiert die Follikelentwicklung und erhöht den Testosteronspiegel bei Ratten16,17. Mit Letrozol behandelte Mäuse weisen eine erhöhte Anzahl von Sinusfollikeln und hämorrhagischen Zysten sowie erhöhte Konzentrationen von LH, FSH, Östradiol und Progesteron auf18,19.

Derzeit umfassen die wichtigsten Methoden für die Letrozol-induzierte PCOS-Modellierung die orale Verabreichung und die subkutane Injektion, die beide eine wiederholte tägliche Dosierung erfordern 20,21,22. Diese Methoden sind zeit- und arbeitsintensiv, und die wiederholte Verabreichung verursacht wahrscheinlich erheblichen Stress für die Tiere23. Obwohl in einigen Studien Letrozol-Pellets24,25 verwendet werden, müssen diese Produkte angepasst werden und sind teuer. In diesem Bericht wird eine Technik zur Induktion von PCOS bei Mäusen mit Hilfe von Minipumpen beschrieben. Diese Methode ist einfach, zeitsparend und verwendet chirurgische Instrumente und Geräte, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Protokolle in dieser Studie wurden von der Tierethikkommission der Fudan-Universität genehmigt. Hier wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 4 Wochen verwendet. Die Einzelheiten zu den Tieren, Reagenzien und Geräten, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Minipumpe

  1. Nehmen Sie das in der Originalverpackungsflasche gelagerte Letrozolpulver (50 mg), zentrifugieren Sie das Letrozolpulver in der Flasche bei 300 x g für 5 s (bei Raumtemperatur) und öffnen Sie dann den Deckel.
  2. Geben Sie langsam mit einer Pipette 625 μl DMSO zum Letrozolpulver und mischen Sie es gut, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 8 mg/100 μl zu erhalten, was insgesamt 625 μl ergibt.
    HINWEIS: Wenn Sie eine andere Packungsgröße für Letrozolpulver verwenden, berechnen Sie bitte im Voraus die erforderliche Menge an DMSO, um die Stammlösung zu konfigurieren. Das Letrozolpulver, DMSO und andere verwandte Verbindungen müssen steril sein. Die Pipettenspitzen, Röhrchen und andere verwandte Gegenstände sollten vor der Verwendung steril oder sterilisiert werden.
  3. Zählen Sie die Anzahl der benötigten Mäuse entsprechend dem Versuchsplan.
  4. Ziehen Sie mit einer Pipette die Gesamtmenge an Letrozol-Stammlösung auf, die von der Anzahl der benötigten Mäuse abhängt, und injizieren Sie sie langsam in das Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: 4 Wochen alte Mäuse für eine 8-wöchige Exposition wurden ausgewählt, um das PCOS-Mäusemodell zu induzieren. Die Gesamtdosis von Letrozol beträgt 8 mg für jede Maus, was zwei aufeinanderfolgende Pumpstöße erfordert, um implantiert zu werden (ein Pumpstoß wird 4 Wochen lang freigesetzt), d.h. 4 mg/4 Wochen pro Pumpe. Wie in Schritt 1.2 erwähnt, beträgt die Konzentration der Letrozol-Stammlösung 8 mg/100 μl. Zur Vorbereitung der Pumpen werden für jede Pumpe 50 μl Stammlösung benötigt, wie unten berechnet: insgesamt 4 mg Letrozol geteilt durch 8 mg/100 μl.
  5. Ziehen Sie die gleiche Menge PEG300 auf, fügen Sie es der Letrozollösung hinzu und mischen Sie es gut (es kann entsprechend vortext werden).
  6. Bereiten Sie die Lösung des Steuergeräts für die Kontrollgruppe vor (50 μl DMSO + 50 μl PEG300 für jede Pumpe ohne Letrozol).
  7. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl steriler Zentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der erforderlichen Pumpen vor. Für jede Pumpe muss ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen vorbereitet werden.
  8. Ziehen Sie Kochsalzlösung mit einer Spritze und geben Sie 5 ml Kochsalzlösung in jedes Zentrifugenröhrchen. Verschließen Sie dann die Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie zur weiteren Verwendung auf ein Röhrchengestell.
  9. Tragen Sie ein neues Paar sterile Handschuhe, nehmen Sie die Minipumpen in der gewünschten Menge heraus und legen Sie sie auf eine saubere, sterile Arbeitsplatte oder einen Behälter.
  10. Drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger vorsichtig auf die Kappe, die zum Pumpenkörper passt, und halten Sie den Pumpenkörper mit der anderen Hand fest.
  11. Stechen Sie mit dem dünnen Schlauch, der an der Kappe befestigt ist, mehrmals langsam in die Einfüllöffnung der Pumpe (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit nicht verstopft ist, fließt die Flüssigkeit nach dem Befüllen möglicherweise nicht frei im Rohr.
  12. Nehmen Sie die Nadel, die zur Pumpe passt, und eine sterile 1-ml-Spritze. Befestigen Sie die Nadel an der Spritze und ziehen Sie sie fest (Abbildung 1C).
  13. Ziehen Sie vorsichtig und langsam die oben konfigurierte endgültige Lösung von Letrozol mit der neu zusammengesetzten Spritze auf (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Die Aspiration der Letrozollösung muss langsam und gleichmäßig erfolgen. Bei schneller Aspiration können Luftblasen entstehen, die die anschließende Injektion der Arzneimittellösung beeinträchtigen können.
  14. Injizieren Sie die Letrozollösung in die Minipumpe.
    1. Drücken Sie eine Minipumpe vorsichtig mit einer Hand zusammen, so dass sie aufrecht steht, und halten Sie mit der anderen Hand die oben erwähnte 1-ml-Spritze fest und führen Sie sie langsam in den Boden der Pumpe ein (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Wenn die Nadel nicht in den Boden der Pumpe eingeführt wird, kann die Flüssigkeit in der Pumpe während der Injektion leicht Blasen bilden, was sich auf die anschließende Freisetzung des Arzneimittels durch die Pumpe auswirkt.
    2. Injizieren Sie dann langsam die konfigurierte Lösung. Die Injektion macht sich bemerkbar, wenn die Öffnung der Pumpe leicht sprudelt.
    3. Injizieren Sie langsamer, wenn sich das Injektionsvolumen 90 μl nähert. Sobald die Pumpe vollständig gefüllt ist (ca. 100 μl), ziehen Sie die Spritze heraus.
    4. Setzen Sie die Kappe vorsichtig in das Pumpengehäuse ein und ziehen Sie sie fest; An diesem Punkt läuft eine kleine Menge Lösung aus. Wischen Sie es vorsichtig weg.
  15. Nehmen Sie die mit dem Arzneimittel beladene Pumpe, wobei der Auslass nach oben zeigt (das Ende mit der Kappe), nehmen Sie das zuvor vorbereitete Zentrifugenröhrchen und tauchen Sie die Pumpe vollständig in sterile Kochsalzlösung (Abbildung 1F). Verschließen Sie dann das Zentrifugenröhrchen und legen Sie es auf das Röhrchengestell.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Pumpe während des gesamten Vorgangs nicht verunreinigt wird.
  16. Nachdem alle Minipumpen hergestellt sind, legen Sie alle Zentrifugenröhrchen für 48 Stunden in ein 37 °C-Thermostat.

2. Vorbereitung auf die Operation und Anästhesie

  1. Bereiten Sie alle erforderlichen Instrumente am Tag der Operation vor und sterilisieren Sie sie, einschließlich Pinzetten, Hämostaten, chirurgische Scheren, Nadelhalter und resorbierbare chirurgische 4-0-Nähte.
  2. Prüfen Sie vor der Verwendung des Isofluran-Anästhesiegeräts (Abbildung 2B) sorgfältig, ob die Rohrleitungsverbindung korrekt ist, und stellen Sie sicher, dass die Rohrleitung intakt und nicht undicht ist.
  3. Schrauben Sie die Füllverschlusskappe am Verdampfer des Anästhesiegeräts ab und fügen Sie dann langsam das Anästhetikum hinzu.
  4. Halten Sie das Anästhesieniveau zwischen der oberen und unteren Grenze, die auf dem Anästhesiegerät angegeben ist.
  5. Tauschen Sie den Dreiwege-Ventilschalter um, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vom Verdampfer des Anästhesiegeräts mit der Anästhesie-Induktionsbox verbunden ist.
  6. Öffnen Sie die Luftpumpe und den Verdampfer und stellen Sie dann die Isoflurankonzentration für die Anästhesieeinleitung ein (in der Regel 3%-4%).
  7. Warten Sie ca. 1 min, bis das Anästhetikum die Induktionsbox füllt, dann setzen Sie die Maus in die Induktionsbox ein und warten Sie, bis die Anästhesie abgeschlossen ist (dieser Vorgang dauert ca. 2-3 min).
  8. Überprüfen Sie, ob die Mäuse ausreichend betäubt sind, indem Sie die Box vorsichtig kippen. Wenn die Mäuse umgedreht werden und keine Anzeichen einer Rückkehr in die liegende Position zeigen, wird eine Narkose eingeleitet.

3. Implantation der Letrozol-Minipumpe

  1. Ziehen Sie eine chirurgische Maske und sterile Handschuhe an.
  2. Nehmen Sie die voranästhesierten Mäuse aus der Induktionsbox und tragen Sie die Enthaarungscreme auf den Rücken der Mäuse auf, dann warten Sie 1 Minute. Wischen Sie die Enthaarungscreme und das Haar vorsichtig mit feuchter Gaze ab.
  3. Wechseln Sie gleichzeitig den Dreiwege-Ventilschalter, um sicherzustellen, dass der Luftstrom vom Verdampfer des Anästhesiegeräts mit der Anästhesiemaske verbunden ist, und stellen Sie die Erhaltungskonzentration (in der Regel 2%) ein.
  4. Halten Sie die Maus nach dem Enthaaren mit der dominanten Hand fest und legen Sie ihren Kopf/ihre Nase in die Narkosemaske.
  5. Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Pedalrückzugsreflex testen.
    HINWEIS: Alle Eingriffe, die eine Anästhesie beinhalten, müssen mit Gasfiltern durchgeführt werden, die mit Aktivkohletabletten ausgestattet sind, und der Eingriff sollte in einem Abzug durchgeführt werden.
  6. Befestigen Sie die Maus in Bauchlage auf der Bedienplatte und tragen Sie Augenschmiermittel auf beide Augen auf.
  7. Tragen Sie Povidon-Jod-Tupfer dreimal auf die exponierte Haut auf (Abbildung 2C). Dann injizieren Sie Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg.
  8. Bestätigen Sie die Narkosetiefe erneut über eine Zehenkneife. Nehmen Sie dann an der Mittellinie des Nackens, wobei Sie die Haut auf der haarlosen Seite bevorzugen, die Haut mit einer Pinzette auf und machen Sie mit einem Skalpell oder einer chirurgischen Schere einen seitlichen Schnitt von etwa 0,5 cm (Abbildung 2D).
  9. Öffnen Sie dann die Epidermis unter dem Schnitt und greifen Sie mit einem Blutstiller oder Nadelhalter darauf zu, um die Haut zu befreien, und schaffen Sie Platz für eine Minipumpe (ca. 2 cm vom Schnitt entfernt) (Abbildung 2E).
  10. Nehmen Sie die Pumpe mit einer sterilen Pinzette aus der Kochsalzlösung im Zentrifugenröhrchen, wobei das offene Ende der Pumpe nach unten zeigt, und bereiten Sie sich darauf vor, die Pumpe subkutan in die Mäuse einzuführen (Abbildung 2F).
  11. Klemmen Sie eine Seite des Hautschnitts mit einer Pinzette fest und schieben Sie die Pumpe in den Unterhautraum. Beim Betreten der Pumpe sollte kein Widerstand entstehen. Drücken Sie die Pumpe im Inneren mit den Fingern leicht und vorsichtig so weit wie möglich nach innen (Abbildung 1G).
  12. Vernähen Sie die Inzisionsstelle vorsichtig mit 4-0 chirurgischen Nähten (Abbildung 2H).
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den subkutanen Pumpenkörper beim Nähen nicht zu beschädigen.
  13. Desinfizieren Sie die Haut an der Operationsstelle nach dem Nähen zweimal mit Jodotropfen.

4. Bergung der Tiere

  1. Übertragen Sie die Mäuse nach der Operation vorsichtig von der Matratze, die während der Anästhesie verwendet wurde, auf eine trockene, saubere Matratze. Stellen Sie sicher, dass sich die Mäuse in einer warmen und ruhigen Umgebung befinden.
  2. Überwachen Sie den Zustand der Mäuse genau, z. B. die Tiefe und Häufigkeit ihrer Atemzüge.
  3. Beobachten Sie das Verhalten der Mäuse, wenn ihre Beweglichkeit zurückkehrt. Stellen Sie schließlich sicher, dass sie ohne offensichtliche abnormale Verhaltensweisen wie Schwindel oder unkoordinierte Bewegungen stehen und gehen können.
  4. Nachdem sich die Mäuse erholt haben, setzen Sie sie vorsichtig in vorbereitete Käfige um. Lege steriles Gelee und Futter auf den Boden des Käfigs, damit sich die Mäuse davon ernähren können.
    HINWEIS: Die Dehnung der Operationsstelle kann die Mäuse daran hindern, in der frühen postoperativen Phase leicht zu trinken und zu fressen, also legen Sie Gelee und Futter auf den Boden des Käfigs.
  5. Injizieren Sie Meloxicam subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg (alle 24 Stunden in den ersten 3 Tagen nach der Operation). Nach 8-wöchiger Letrozol-Behandlung (d. h. zwei aufeinanderfolgende Minipumpenimplantationen) testen Sie die Mausmodelle.

Ergebnisse

Das Versuchsprotokoll und einige kritische Schritte sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Der Serumtestosteronspiegel ist in Abbildung 3A dargestellt. Mäuse, die mit Letrozol-Minipumpen behandelt wurden (im Folgenden als LTZ-Mäuse bezeichnet), wiesen im Vergleich zu weiblichen Kontrollmäusen signifikant erhöhte Serumtestosteronspiegel auf. In der Zwischenzeit zeigte die histologische Analyse der Eierstöcke, dass LTZ-Mäuse polyzystische Ovarien mit einer signifikanten Verringerung der Anzahl der Corpora lutea aufwiesen (Abbildung 3B,C), was auf eine Anovulation hinweist. Darüber hinaus zeigten LTZ-Mäuse im Vergleich zu weiblichen Kontrollmäusen eine signifikante Östrus-Azyklizität (Abbildung 3D). Die Auswertung des Körpergewichts zeigte, dass LTZ-Mäuse schwerer waren als Kontrollmäuse (Abbildung 3E). Die Ergebnisse der Glukosetoleranztests und AUC-Berechnungen zeigten, dass LTZ-Mäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen eine Glukoseintoleranz entwickelten (Abbildung 3F,G). Der Serumlipid-Assay zeigte, dass LTZ-Mäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen eine Veränderung des Serumlipidprofils aufwiesen (Abbildung 3H).

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Abbildung 1: Materialien und kritische Schritte zur Vorbereitung der Minipumpe. (A) Schematische Darstellung der Herstellung von Letrozol-Minipumpen. (B) Die Minipumpe wurde durch einen dünnen Schlauch entstopft, der an der Kappe befestigt war. (C) Eine zur Pumpe passende Nadel wurde am Nadelende einer 1-ml-Spritze befestigt. (D) Die Letrozollösung wurde langsam und sprudelfrei aspiriert. (E) Die Letrozollösung wurde langsam von ganz unten in die Pumpe injiziert. (F) Die gefüllten Pumpen wurden mit einem Deckel verschlossen und in Kochsalzlösung gelagert, wobei das Deckelende nach oben zeigte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Materialien und kritische Schritte bei der Implantation der Pumpen in die Mäuse für die PCOS-Induktion. (A) Schematische Darstellung der Implantation von Letrozol-Minipumpen. (B) Anästhesieausrüstung: Luftpumpe, Anästhesiegerät, Induktionsbox und Gasfilter. (C) Anästhesierte Mäuse wurden fixiert und sterilisiert. (D) Ein 0,5 cm langer Schnitt in der Nähe der dorsalen Mittellinie. (E) Die Haut wurde befreit, um Platz für das Einsetzen der Minipumpe zu schaffen. (F) Eine Minipumpe wurde mit einer sauberen und sterilen Pinzette aus der Kochsalzlösung herausgeklemmt. (G) Die Minipumpe wurde unter die zuvor befreite Haut implantiert. (H) Die Haut wurde mit 4-0 Nähten verschlossen. (I) Die implantierte Maus konnte sich erholen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Charakterisierung von reproduktiven und metabolischen Phänotypen in den Letrozol-Minipumpen-implantierten Mausmodellen. (A) Die Plasma-Testosteronspiegel bei den LTZ-behandelten Mäusen waren signifikant höher als bei den Kontrollmäusen (n = 9 Tiere pro Gruppe). (B) Histologische Analyse der Eierstöcke. Der Pfeil zeigt die Corpora lutea an. Maßstabsbalken: 1 mm. (C) Anzahl der Corpora lutea in den angegebenen Gruppen (n = 9 Tiere pro Gruppe). (D) LTZ-Mäuse zeigten Azyklizität im Vergleich zu weiblichen Kontrollmäusen. (E) Das Körpergewicht in den angegebenen Gruppen (n = 10 Tiere pro Gruppe). (F,G) Ergebnisse des Glukosetoleranztests in den angegebenen Gruppen (n = 8 Tiere pro Gruppe). (H) Serumlipidspiegel in den angegebenen Gruppen (n = 8 Tiere pro Gruppe). Die Daten werden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. AUC gibt die Fläche unter der Kurve an; E, Brunststadium; LDL-C, Lipoprotein-Cholesterin niedriger Dichte; HDL-C, Lipoprotein-Cholesterin hoher Dichte; P, Proöstrus-Stadium; M/D, Stadium des Metestrus/Diestrus; TC, Gesamtcholesterin; und TG, Triglyceride. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Dieser Bericht zeigt ein einfaches Protokoll zur Induktion von PCOS bei Mäusen unter Verwendung leicht zugänglicher Materialien. Das PCOS-Modell der Maus ist für die Erforschung von PCOS-Mechanismen und das Screening von Medikamenten unerlässlich26. Von den verfügbaren Methoden zur Induktion von PCOS-Modellen bei Mäusen ist die Letrozol-Induktion eine der am häufigsten verwendeten Methoden. Die Verwendung von Letrozol kann einen hyperandrogenen Zustand entwickeln und aufrechterhalten, indem die Umwandlung von Testosteron in Östradiol gehemmt oder die Testosteronsynthese erhöhtwird 27. Das Letrozol-induzierte Mausmodell zeigt metabolische und reproduktive Ähnlichkeiten mit Patienten mit PCOS28. Konventionelle Techniken der Letrozolbehandlung im Maus-PCOS-Modell erfordern jedoch eine tägliche orale Fütterung oder Injektion von Letrozol-Medikament in Mäuse für 21 Tage oder länger29,30. Die langfristige kontinuierliche Zuteilung von Medikamenten mit zeitgesteuerter Dosierung von Fütterung oder Injektion ist zeit- und arbeitsintensiv, und die wiederholte Verabreichung von Medikamenten kann für Mäuse notorisch stressig sein, was zu nicht-experimentellen Faktoren führt, die die Modellergebnisse beeinflussen23,31. Obwohl in einigen PCOS-Studien an Ratten und Mäusen implantierbare Letrozol-Pellets verwendetwerden 28,32, müssen die verwendeten Produkte angepasst werden und sind möglicherweise nicht rechtzeitig verfügbar. Die aktuelle Studie schlägt eine Technik zur Implantation von Letrozol-Minipumpen vor, um PCOS bei Mäusen zu induzieren. Die Methode ist einfach, zeitsparend und verwendet chirurgische Instrumente und Geräte, die in den meisten Labors leicht verfügbar sind.

Kritische Schritte und Fehlerbehebung
Es ist wichtig, einige wichtige Schritte zu beachten, um beim Üben dieser Methode optimale Ergebnisse zu erzielen. Befreien Sie zunächst die Pumpe vor dem Gebrauch mit dem dünnen Schlauch, der an der passenden Kappe befestigt ist. Frühere Erfahrungen deuten darauf hin, dass eine verstopfte Pumpe das Laden und Freisetzen von Medikamenten stören kann. Darüber hinaus muss jeder Schritt bei der Konfiguration der Letrozollösung mit Sorgfalt ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass die endgültige Lösung genau die gewünschte Konzentration aufweist. Während des gesamten Montageprozesses der Pumpe muss darauf geachtet werden, eine Kontamination zu vermeiden. Darüber hinaus sind vor und während der Anästhesie sorgfältige Anpassungen erforderlich, um eine angemessene Anästhesie für die Versuchsmäuse zu gewährleisten und die nachteiligen Auswirkungen der Anästhesie auf die operierten Mäuse zu minimieren.

Vorteile und Grenzen
Die in dieser Studie beschriebene Methode bietet mehrere Vorteile: (1) Sie spart Zeit und ermöglicht eine kontinuierliche Letrozolfreisetzung nach der Pumpenimplantation; (2) Es vermeidet den Stress der wiederholten Verabreichung von Medikamenten an Versuchstieren und minimiert den Einfluss nicht-experimenteller Faktoren auf die Modellierungsergebnisse; (3) die notwendigen Materialien, chirurgischen Instrumente und Geräte sind in den meisten Laboratorien allgemein verfügbar; (4) Die Methode induziert effektiv PCOS-Phänotypen bei Mäusen. Diese Methode hat jedoch auch Einschränkungen: (1) Die Anästhesie und der chirurgische Eingriff, die für die Implantation einer Minipumpe erforderlich sind, können bei den Mäusen zu Reizungen führen, und das Vorhandensein der Minipumpe unter der Haut könnte ihre Aktivität stören; (2) Die Wirksamkeit dieser Modellierungsmethode kann durch Verschmutzung oder Beschädigung des Pumpenkörpers während des Prozesses beeinträchtigt werden. Basierend auf den Erfahrungen der Autoren kann die sorgfältige Ausführung der Protokollschritte zu einer hohen Erfolgsquote bei der Induktion des PCOS-Mausmodells führen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Studie wurde unterstützt vom National Key Research and Development Program of China (Zuschüsse 2021YFC2700701), der National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 82088102, 82071731, 82171613, 8227034, 81601238), dem Innovationsfonds der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften für Medizinische Wissenschaften (Zuschuss 2019-I2M-5-064), der Wissenschafts- und Technologiekommission der Stadt Shanghai (Zuschüsse 21Y11907600), der Stadtkommission für Gesundheit und Familienplanung von Shanghai (Zuschuss 20215Y0216), Kollaboratives Innovationsprogramm der Shanghai Municipal Health Commission (Zuschuss 2020CXJQ01), Klinischer Forschungsplan des Shanghai Hospital Development Center (Zuschuss SHDC2020CR1008A), Shanghai Clinical Research Center für gynäkologische Erkrankungen (Zuschuss 22MC1940200), Shanghai Urogenital System Diseases Research Center (Zuschuss 2022ZZ01012), Shanghai Frontiers Science Research Base of Reproduction and Development, Die Wissenschafts- und Technologiekommission der Stadt Quzhou (Zuschuss 2022K54), Open Fund Project des Key Laboratory of Reproductive Genetics, Bildungsministerium, Zhejiang University (Zuschuss KY2022035) und Open Fund Project der Guangdong Academy of Medical Sciences (Zuschuss YKY-KF202202).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SpritzeBofeng BiotechBD3008411ML (steril)
ZentrifugationsröhrchenBiological Hope1850-K15ML (steril)
PipetteEppendorf3123000268-A100μ L-1000μ L (steril)
PipettenaufsatzPette701010100810μ L-100μ L (steril)
Letrozol-PulverSigmaL6545-50MGPrimär wirkende Arzneimittel (steril)
PEG(Poly(ethylenglykol))SolarbioP8250Zur Auflösung (steril)
Sterile physiologische KochsalzlösungBiosharpBL158AMini-Pumpenlagerung
Osmotische PumpenALZET1004Letrozol-Lagerung und verzögerte Freisetzung (steril)
DimethylsulfoxidBiosharpBS087Wird zum Auflösen verwendet (steril)
Anästhesiegerät für KleintiereRWD R500IPfür die Anästhesie
Isofluran RWD20071302für die Anästhesie
HämostatenBiosharpBS-HF-S-125für chirurgische Instrumente
BiosharpBS-SOR-S-100PChirurgisches Instrument
NadelhalterShangHaiJZJ32010Pinzette für chirurgische Instrumente
RWD F12028Chirurgisches Instrument
Nadel und resorbierbares Nahtmaterial 4-0JINGHUANCR413Chirurgisches Instrument
Povidon-Jod-TupferSingleLadyGB26368-2010Hautdesinfektion
EnthaarungscremeZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701 Enthaarungsmittel für Versuchstiere
NitrilhandschuheBiosharpBC040-LWird für den aseptischen Betrieb
verwendet SterileGaze ZHENDEBA69087Wird zum Abwischen von Flüssigkeiten
verwendet C57BL/6J MäuseShanghai Model Organisms CenterN/AAlter: 4 Wochen
HaustieraugenschmiermittelBAITESHF021153Wird für Mausaugenschmiermittel
verwendet Meloxicam InjektionMEIDAJIAR21064-21Wird für die Analgesie von Mäusen verwendet (steril)
Schere

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